重组猪长效-α干扰素的构建和修饰方法及其冻干注射剂的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种重组猪长效-α干扰素的构建和修饰方法及其冻干注射剂的制备方法。本发明重组猪-α干扰素采用大肠杆菌可溶性表达制备，根据聚乙二醇的特点，用聚乙二醇修饰重组猪-α干扰素得重组猪长效-α干扰素，延长重组猪长效-α干扰素在猪体内的半衰期至44.5h、增强猪的免疫力。本发明重组猪长效-α干扰素在细菌高密度、高容积下表达优良，生产和纯化工艺简单新颖、成本低，提高了产品收率和纯度。本发明重组猪长效-α干扰素冻干注射剂具有成本低、疗效显著、产品质量稳定的优点。
【专利说明】重组猪长效-α干扰素的构建和修饰方法及其冻干注射剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药【技术领域】，具体涉及一种重组猪长效-α干扰素的构建和修饰方法及其冻干注射剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]猪干扰素是研究最早的动物干扰素之一，20世纪80年代就有猪干扰素的相关报道。已发现的猪干扰素包括INF-α、β、ω、δ和INF-Y，现在已完成基因克隆、测序和定位。近年来，对猪干扰素的诱导条件和理化活性有了进一步的研究，同时对猪白细胞干扰素进行了大量的临床试验。研究表明，它对猪的许多病毒性传染病如流行性腹泻、猪瘟、传染性胃肠炎等，以及对牛病毒性腹泻、小鹅瘟、羔羊腹泻等都具有显著疗效，试验证实猪干扰素与牛羊等动物之间存在交叉活性。谢海燕等采用PCR技术克隆得到的IFN - α基因；夏春等克隆得到的猪β干扰素IFN - β基因。曹瑞兵等从经ConA诱导培养的猪外周血白细胞中扩增出猪IFN -Y基因，重组猪IFN -Y具有较高的干扰素活性。同时，万建青、陈涛等分别成功地在毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统中表达出重组干扰素基因，表达产物占菌体总蛋白的比率在20 %飞0%之间，表达产物具有抗病毒活性，为基因工程干扰素的规模化生产和应用提供了可能。目前尚未有一种高效的用于治疗猪病毒病的干扰素制剂。现有的猪干扰素必须每天重复用药，价格昂贵，治疗效果欠佳。今后的发展趋势是寻找一种高效价格低廉的长效干扰素制剂，能够用于临床，对人而言，主要用作免疫增强剂和无毒副作用，动物主要用于病毒病的治疗。目前尚未有猪的长效干扰素投放市场。我们拟通过基因修饰建立猪长效干扰素，研制一种有效的制剂，3-5年投放市场。
[0003]干扰素(IFN)是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分，猪干扰素是治疗猪病毒性疾病的首选药物。猪是现代农业发展的主要项目，发展养猪生产是关系国计民生的大问题。困扰养猪业发展的主要问题是疾病问题，而猪的传染性疾病是对猪的最大危害，我国每年因猪的传染性疾病造成的经济损失达数十亿元，严重阻碍养猪业的发展。在猪的传染病中病毒性疾病占主导地位，约占85%。对于猪的病毒性传染病(如猪瘟、口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征等)目前主要靠疫苗进行预防。猪病毒性疾病绝大多数都有可用的疫苗进行预防。
[0004]近年来，随着猪病毒新毒株、变异株的不断出现，我国猪病毒病的防治面临严峻的挑战，目前的预防和治疗措施已经不能有效地控制疫病的发展，其危害日益严重，因此迫切需要一种有效的防治措施和高效的药物。对动物的病毒性传染病的治疗只有依靠高免血清或病毒干扰制剂。由于受价格和动物适应性的影响，目前尚无可供的高免血清用于猪病毒性疾病的治疗。虽然已经研究出可以用于治疗病毒性疾病的干扰素制剂，如聚肌胞、猪干扰素等，但这些产品存在严重缺陷，这类药品半衰期短、疗效差、价格高。对患病动物每天必须重复用药，增加了用药的成本，往往达不到预期效果，使这类药物的应用受到严重的制约。到目前为止，还没有一种有效而实用的药物用于猪病毒性疾病的治疗，所以研制高效的抗病毒药物是治疗猪病毒性疾病的重要手段，是防治猪病毒性传染病发展养猪生产所必须。本课题拟研制一种长效的猪病毒干扰素制剂，3天注射一次，对猪病毒性疾病具有良好效果，对发展养猪生产，保障市场供给和稳定市场物价具有重要的经济意义和社会意义。
[0005]
【发明内容】
[0006]针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种重组猪长效-α干扰素的构建和修饰方法，以及提供一种疗效好、价格低的重组猪长效-α干扰素冻干注射剂，不需要每天对患病动物重复用药。
[0007]本发明的目的是通过如下技术方案来实现的:一种重组猪长效-α干扰素CrpoIFN- α)，其特征在于:先使用原核表达系统可溶性表达猪-α干扰素，再使用聚乙二醇修饰重组猪-α干扰素得重组猪长效-α干扰素(rpoIFN- α )；
所述聚乙二醇修饰剂为甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺。
[0008]本发明还提供一种重组猪长效-α干扰素的构建方法，包括如下步骤:
1)引物设计:根据GenBank中登录号Μ28623.1的猪干扰素的基因序列，利用Primer5.0生物软件，设计扩增猪干扰素成熟肽基因的引物:
上游引物:5’ -GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’，
下游引物:5’ -CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3，；
2)猪肝脏基因组DNA提取:用DNA抽提试剂盒对猪肝脏基因组DNA进行提取；
3)猪-α干扰素成熟肽基因的克隆:根据步骤1)、2)所得引物与猪肝脏基因组DNAjlJ用PCR扩增技术，对猪-α干扰素成熟肽基因进行克隆；
4)DNA电泳:采用琼脂糖凝胶电泳对步骤3)所得猪-α干扰素成熟肽基因进行电泳分离，并对目标片段进行回收，得到PCR回收产物；
5)提取质粒:用质粒提取试剂盒对质粒进行提取；
6)质粒与PCR产物的双酶切:对步骤4)所得PCR回收产物和步骤5)所得质粒分别进行双酶切；
7)DNA片段的连接:将步骤6)所得双酶切后的PCR回收产物与载体质粒在Τ4连接酶的作用下进行连接；
8)感受态细胞的制备:挑取活化的大肠杆菌于LB液体培养基中，37°C培养，直至0D_值达到0.6^0.8，取培养液用Cacl2法制备感受态细胞；
9)感受态细胞的转化:将步骤7)得到的重组质粒转入到新鲜制备的步骤8)所得感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板上，37 1:培养过夜；
10)阳性克隆的鉴定:取步骤9)中含氨苄青霉素的LB培养基平板上生长的菌落经PCR反应进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定，取通过PCR鉴定为阳性的克隆进行扩大培养、提取质粒、双酶切、酶切产物鉴定，鉴定为阳性即表示载体构建成功；
11)重组菌株的诱导表达:挑选步骤10)制备得的阳性克隆于100mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 0C >180 r/min培养过夜，直至OD6tltl值为0.6?0.8时，加入f 5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液lmL，22 °C下诱导Γ?Ο h，将诱导结束后得到的培养液于10000 r/min的离心速度下离心I min,收集菌体沉淀,称取菌体沉淀的重量,并加入菌体沉淀重量3?10倍体积的裂解液，吹打使菌体重悬，预冷后超声破碎，将超声破碎后的液体于4 0CuOOOO r/min的离心速度下离心10 min，取离心上清液，加入与离心上清液等体积的2XLoading Buffer (上样缓冲液)，取上述混合溶液于100 °C下煮沸10 min,得重组猪-α干扰素粗品；
12)重组猪-α干扰素粗品的纯化:将步骤11)所得重组猪-α干扰素粗品过镍离子金属螯合亲和层析柱进行分离纯化，用洗脱液进行梯度洗脱，收集每个梯度的洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳鉴定目标蛋白，将经SDS-PAGE电泳鉴定为重组猪-α干扰素的水溶液用透析袋除盐，置于-80 °C超低温冰箱中预冻4 h，在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，即得精制重组猪-α干扰素。
[0009]一种重组猪长效-α干扰素的修饰方法，包括如下步骤:
1)用磷酸盐缓冲液将上述制得的精制重组猪-α干扰素配置成重组猪-α干扰素的磷酸盐反应溶液；
2)在反应温度4°C条件下，将聚乙二醇修饰剂添加到步骤I)所述含重组猪-α干扰素的磷酸盐反应溶液中，再加入氰基氢硼化钠，搅拌均匀，进行修饰反应；
3)向步骤2)所述溶液中加入过量的甘氨酸终止反应，得反应液；
4)将步骤3)所得反应液过SP阳离子交换层析柱，用洗脱液进行梯度洗脱，对各洗脱峰物质用SDS-PAGE电泳鉴定目标产物，收集得单聚乙二醇修饰重组猪长效-α干扰素水溶液，将所得重组猪长效干扰素水溶液用透析袋除盐，置于-80 °C超低温冰箱中预冻4h，在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，即得修饰的重组猪长效-α干扰素；
其中，步骤I)所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为4.(Γ10.0，磷酸盐缓冲溶液中重组猪- α干扰素的浓度为1.2^2.0mg/mL ；
步骤2)中所述聚乙二醇修饰剂为甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺，所述聚乙二醇修饰剂与重组猪-α干扰素的摩尔比为1:1飞:1，以反应溶液的总体积计，添加的氰基氢硼化钠浓度为lmg/mL，修饰反应时间为6?30 h。
[0010]步骤4)中所述梯度洗脱，流动相A相:50mmol/L、pH值为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，流动相B相为:在体积为IL的A相中再加入117g氯化钠而得，B相的梯度浓度为5°/Γ30%(V/V)。
[0011]一种重组猪长效-α干扰素冻干注射剂，采用重组猪长效-α干扰素为主要原料，通过添加剂协同保护，经溶液配制、脱内毒素、除杂除菌、分装、冻干后制得；
所述原料的浓度，以配制溶液的总体积计为:磷酸氢二钠0.0Γ0.03 mmol/L，氯化钠9?15 g/L，冻干保护剂1%?3% (V/V)，重组猪长效-α干扰素0.5 X 14?1.5 X 14 U/L，其中重组猪长效-α干扰素的比活性为4.41 X 15 U/mg ；
所述重组猪长效-α干扰素为上述修饰方法制备所得；
所述冻干保护剂为甘露醇。
[0012]所述重组猪长效-α干扰素冻干注射剂的制备方法，包括如下步骤:
I)在无菌操作室内，根据要配制溶液的体积，称取磷酸氢二钠、氯化钠、冻干保护剂、重组猪长效-α干扰素，倒入灭菌盐水瓶中，用超纯水定容至要配制的体积；其中，以配制溶液的总体积计，磷酸氢二钠、氯化钠、冻干保护剂、重组猪长效-α干扰素的最终浓度为磷酸氢二钠0.0Γ0.03mmol/L,氯化钠9?15g/L，甘露醇1%?3% (V/V)，重组猪长效-α干扰素0.5 X 14?1.5X104U/L (重组猪长效_ α干扰素的比活性为4.41 X 15 U/mg)；
2)在步骤I)配置好的药液中加入内毒素脱除剂，搅拌1(T20min ；
3)在已灭菌的布氏漏斗上铺垫两层灭菌滤纸，将步骤2)所得药液通过滤纸，滤除杂质；
4)用0.22 μ m不锈钢钟罩式滤器过滤步骤3)所得药液，滤除杂菌；
5)将步骤4)所得滤除杂菌的药液以每瓶1lOmL的份量，分装到相应的西林瓶中；
6)将步骤5)所得药液在低于冻干保护剂最低共熔点8?101:的温度下，预冻12 h；
7)将步骤6)预冻好的药品，在冷凝器温度〈-40°C、压强范围l(T30Pa的条件下，进行升华干燥12h ；
8)将步骤7)所得升华干燥好的药品在压强范围15?30Pa条件下，_15°C进行解析干燥4?6 h ；
9)将冷冻干燥机压强降至10Pa，将步骤8)所得解析干燥好的药品在-10 1:继续冷冻干燥2h ；
10)将步骤9)冻干后的重组猪长效-α干扰素注射剂产品，在无菌条件下加塞压盖，即得重组猪长效-α干扰素冻干注射剂。
[0013]相比现有技术，本发明具有如下有益效果:
1、本发明重组猪-α干扰素采用大肠杆菌可溶性表达制备，是技术的核心之一，比已有的技术产量提高30%，能实现规模化生产，制备工艺更简单，纯化更容易。
[0014]2、实现了重组猪-α干扰素在细菌高密度、高容积下的高效表达。
[0015]3、根据聚乙二醇的特点，精心设计了重组猪-α干扰素的修饰方法，是技术重大创新发明，用聚乙二醇修饰重组猪-α干扰素，操作简便且后续纯化工艺路线新颖。
[0016]3.1根据重组猪-α干扰素的氨基酸序列特点，分别采用了相对分子质量为20kDa的直链型mPEG-ALD (单甲氧基聚乙二醇丙醛)、mPEG_SPA (单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯)修饰重组猪-α干扰素。
[0017]3.2优化重组猪-α干扰素的聚乙二醇修饰条件，使用mPEG-ALD (单甲氧基聚乙二醇丙醛)、mPEG_SPA (单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯)大量修饰重组猪-α干扰素，采用SP阳离子交换层析法纯化单聚乙二醇修饰偶联物，SDS-PAGE检测修饰产物，使用细胞模型及动物实验对重组猪长效-α干扰素生物活性进行了研究。
[0018]4、本发明重组猪长效-α干扰素在猪体内的半衰期延长时间提高14倍。
[0019]5、本发明重组猪长效-α干扰素冻干注射剂产品质量稳定、成本低，能有效提高动物的免疫力，治疗猪的病毒性疾病，包括隐性感染，如猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪伪狂犬、猪流行性腹泻等。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0021]一种重组猪长效-α干扰素(rp0IFN- α )，先使用原核表达系统可溶性表达猪-α干扰素，再使用聚乙二醇修饰重组猪-α干扰素得重组猪长效-α干扰素(rp0IFN-α X
[0022]实施例1:一种重组猪长效-α干扰素构建和PEG修饰。
[0023](一)重组猪长效-α干扰素的构建:
1、引物设计:
利用Primer 5.0,根据GenBank中登录号M28623.1的猪IFN- α基因序列，设计扩增猪-α干扰素成熟肽基因的引物。上游引物5’端添加EcoR I限制性酶切位点和ATG起始密码子，下游引物5’端添加Xho I限制性酶切位点。
[0024]上游引物为5’ -GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’ ；
下游引物为 5’ -CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’。
[0025]弓丨物送经Takara公司合成。
[0026]2、猪肝脏基因组DNA的提取:用组织/细胞DNA (小量)抽提试剂盒(WatsonB1technologies, Inc)对猪肝脏基因组DNA进行提取。
[0027]2.1称取猪肝脏组织20 mg左右(最大起始量:25 mL)，移入1.5 mL EP离心管中。
[0028]2.2在冰袋上，用配备的组织捣碎棒将组织彻底捣碎。
[0029]2.3加入200 μ L DLT液，涡旋震荡，使组织碎片重悬。65 °C温浴，并不断晃动，直至无组织碎片存在。
[0030]2.4 加入 200 μ L DT 液，8 μ LRNase A (核糖核酸酶)和 25 μ L Proteinase K(蛋白酶K)，迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。65 °C水浴30 min，并不时晃动。
[0031]2.5以12000 r/min离心5 min，将上清移入离心管中。
[0032]2.6加入200 μ L无水乙醇，混匀后加到吸附柱中，12000 r/min离心30 S。将吸附柱移入一个干净的收集管中。
[0033]2.7 加入 500 μ L Wash buffer,静止 I min 后，12000 r/min 离心 30 S。取出吸附柱，倒掉收集管中的液体后放回。
[0034]2.8重复步骤7 —次。
[0035]2.9 12000 r/min 离心 I min。
[0036]2.10取出吸附柱放入1.5 mL离心管中。还慢在柱中白色吸附膜中央加入滴加60μ LElut1n buffer, 65。。静置 5 min 后，12000 r/min 离心 I min。
[0037]2.11 将收集管(DNA)-20 °C保存。
[0038]3、猪α -干扰素成熟肽基因的克隆:
PCR反应体系
Ex Taq DNA 聚合酶0.5 μ L,
10Χ扩增缓冲液5 yL，Mg2+ 4 yL ,
4种dNTP混合物4 μ L，
引物I (上游引物)I UL，
引物2 (下游引物)I yL，
模板 DNAIuL,
双蒸水33.75 μ L，
将上述溶液混匀后稍离心，再置于PCR仪中:
PCR反应条件 95 °C预变性5 min
94°C 变性 45 s 61 °C退火45 s (温度梯度PCR后，选定)，
72 °C延伸 I min,
循环30次，
最后72 °C延伸7 min,
4、DNA电泳:
1.0%琼脂糖凝胶的制备:称取1.0 g琼脂糖，加入100 mLl X TAE缓冲液。电磁炉加热溶解，冷却60 °C左右时，加入5 μ L的EB母液。混匀后倒入插好梳子的电泳模板中。室温自然凝固后(约30 min)，将胶连同电泳板放入电泳槽中。加入电泳缓冲液，使其没过胶面。
[0039]加样5 μ L DNA提取物加I μ L 6XDNA上样缓冲液，混匀后上样。
[0040]电泳恒压110 V电泳约30 min。指示剂迁移到适当位置，停止电泳。
[0041]成像将凝胶置于紫外能下观察将凝胶置于紫外灯下观察，照相。
[0042]5、目的片段的回收:
5.1在凝胶成像系统中，切下目的DNA片段。转移到1.5 mL离心管中。5.2称量出凝胶块质量，按I g凝胶加入I ml Binding Buffer的比例加入Binding Buffer润旋振荡后，65 °C温浴7 min至凝胶完全融化，期间颠倒震荡。
[0043]5.3转移700 μ L DNA脂糖溶液到HiBindTM DNA柱子中，将其放入2 mL收集管中，10，000 g离心I min，取出柱子，弃去收集管中液体。5.4将柱子重新套回收集管中，力口300 μ L Binding Buffer 至 HiBind DNA 柱子中；静置 I min, 10，000 g 离心 I min,弃去收集管中液体。
[0044]5.5将柱子放回收集管中。加入700 μ L SPff Wash buffer。室温下静置Imin后
10,000g离心I min。弃去收集管中滤出液。
[0045]5.6重复步骤5 —次。
[0046]5.7将柱子重新放回收集管，13，000 g离心I min，清除残留在柱中的液体。5.8把柱子放入1.5 mL离心管，滴加30 μ L洗脱液至柱子膜中央。室温静置I min后，13，000g离心I min，滤出液即为是目的DNA溶液，-20 °C保存备用。6、质粒的提取:用OmegaB1-Tek的的质粒提取试剂盒(Plasmid Mini Kit I )对质粒进行提取。
[0047]6.1在含Amp (氨苄青霉素)的LB平板上，挑取阳性克隆。转接到5 mL含Amp (氨苄青霉素)(工作浓度为100 yg/mL)的LB液体培养基中。37 °C振荡(转速为300 r/min)培养12 h。6.2取5 mL菌液，批次放入1.5 mL EP管中。10000 g离心I min。6.3弃去上清，向EP管中加含RNase A的溶液I 250 μ L。涡漩振荡使菌体重悬。
[0048]6.4加入250 μ L溶液II至离心管中，快速温和颠到数次，直至裂解液变澄清。
[0049]6.5加350 μ L溶液III至离心管中，快速温和颠倒数次，白色絮状沉淀出现。
[0050]6.6 13000 g离心10 min。6.7轻轻吸取上清(避免沉淀和细胞碎片的吸入)，移入已套好2 mL离心管的吸附柱中。室温10000 g离心I min。6.8弃去滤过液。向吸附柱中加入500 μ L Buffer HB。10000 g离心lmin,除去蛋白质残留。
[0051]6.9弃去滤过液。700 μ L Wash Buffer (已按照说明加入100%乙醇稀释过)清洗吸收柱，10000 g离心I min。
[0052]6.10重复步骤8，再加700 μ L Wash Buffer清洗吸收柱。6.11 13000 g离心2min取出吸附柱中残留的乙醇。6.12将吸收柱放入干净1.5 mL离心管，滴加30 μ L TE缓冲液在吸附柱滤膜中央。静置I min后13000 g离心I min。
[0053]7、质粒和PCR产物的双酶切:
取一个干净、灭菌的200 μ L的EP管，按下表加入各种试剂水15 μ L,
1XH buffer5 μ L,
PCR产物(或质粒DNA)25 μ L，
EcoR I限制性酶2.5 μ L，
Xho I 限制性酶2.5 yL,
总体积50 μ L,
PCR产物，37 °C保温2 11;质粒0嫩，37 °C保温过夜，
8、DNA片段的连接:
连接反应体系如下:
PCR回收产物7.0 μ L,
2XT4DNA连接酶缓冲液 1.0 μ L， pET32a Vector1.0 μ L,
T4DNA 连接酶1.0 μ L,
共计10.0 μ L，
混匀离心，16 1:放置过夜(以上均在冰上操作)。
[0054]9、感受态细胞的制备:
9.1受体菌的培养:从含LB平板上挑去活化的DH5 α大肠菌落，转接到5 mL LB液体培养基中，37 °C培养过夜。次日，将菌液按照1:100的比例接种到100 mL的LB液体培养基中，37 °〇培养，直至00_值达到0.6?0.8。9.2感受态细胞的制备(CaCl2法):9.2.1培养液冰上预冷10 min后，4 °C 3000 g离心10 min。9.2.2弃去上清，用10 mL
0.05 mol/L的CaCl2溶液(已4°C预冷)轻轻吹打，使细胞悬浮。冰上预冷30 min。4 V3000 g离心10 min。9.2.3弃去上清，加入4 mL含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2溶液(已4 °C预冷)轻轻吹打，使细胞悬浮。将装有细胞悬液的锥形瓶置于冰上。9.2.4将感受态细胞装入无菌、已预冷的1.5 mL EP管(200 yL/支)，-70 °C保存。
[0055]9.3感受态细胞的转化:
9.3.1将经过灭菌的1.5 mL的EP放入-20 °C的冰箱预冷，然后每管加入200 μ L的感受态细胞；再加入连接产物5 μ L ;冰浴40?60 min。放置同时设立对照，阳性对照为Control Insert DNA连接产物；空白对照为酶切后的空载体。
[0056]9.3.2将EP管放入42 °C水浴锅中预热好的架子上，计时90 s (此时不能摇动)
9.3.3计时结束后，将EP迅速放入冰浴中2?3 min。
[0057]9.3.4将连接产物放入到800 μ L的无菌LB液体培养基中，37 °C，150 r/min培养I h，使细菌复原，并是其抗生素基因得以表达。
[0058]9.3.5转移100 μ L的培养液，在含有Amp (氨苄青霉素)的LB平板上涂布(如菌浓过大，可以将涂布量降低)。
[0059]9.3.6将平板室温放置，直至液体被吸干(转化前，先将平板从4 °C拿出，再倒置放入培养箱，这样避免了对转化菌的再刺激)。
[0060]9.3.7 37 1:培养过夜，次日可观察到转化克隆的出现。
[0061]10、阳性克隆的鉴定:
10.1菌落PCR鉴定:
以Amp (氨苄青霉素)平板上出现的转化克隆为模板，挑取5个以上，按照先前的PCR反应体系和条件进行扩增；通过琼脂糖凝胶电泳对其进行初步鉴定。
[0062]10.2双酶切鉴定:
将经过鉴定为阳性的克隆进行扩大培养。将其加入含Amp (氨苄青霉素)的LB液体培养中，37 °C, 180 r/min，培养过夜。达到一定菌浓后，使用质粒提取试剂盒提取质粒。质粒双酶切，37 °C，2 h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0063]水3 yL，
1XH bufferI μ L,
PCR产物(或质粒DNA)5 μ L，
EcoR I0.5 μ L，
Xho I0.5 μ L，
总体积10 μ Lo
[0064]测序鉴定:
将双酶切为阳性的质粒，送TaKaRa公司测序，测序结果与GeneBank中登录号为Μ28623.1的猪IFN-α成熟肽基因序列进行比对。
[0065]11、重组猪- α干扰素的诱导表达:
11.1种子菌的活化:
用接种环挑取少量重组菌株菌液在含有氨苄青霉素的LB平板上划线，放入37 °C培养箱，倒置培养过夜。次日，平板上出现的单菌落即为种子菌。
[0066]11.2种子菌的一次活化:用接种环挑取种子菌单菌落，接种于5 ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C, 180 r/min，培养过夜。
[0067]11.3种子菌的扩大培养:将活化的菌液按照1:100的比例接种于50 ml含Amp(氨苄青霉素)的LB液体培养基中37°C，180 r/min，培养过夜。然后，按照同样的比例放大到5L的锥形瓶中培养，培养条件同样为37 V，180 r/min。待其OD6tltl值到达0.6^0.8时，即可进行诱导。
[0068]11.4重组猪-α干扰素的诱导表达:
?向扩大培养的种子菌中加入lmmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液ImL, 22 °C下诱导4ho将诱导结束后得到的培养液于10000 r/min的离心速度下离心I min,收集菌体沉淀，称取菌体沉淀的重量，并加入菌体沉淀重量3倍体积的裂解液，吹打使菌体重悬，预冷后超声破碎，将超声破碎后的液体于4 0CuOOOO r/min的离心速度下离心10 min，取离心上清液，加入与离心上清液等体积的2 X Loading Buffer (上样缓冲液)，取上述混合溶液于100°C下煮沸10 min,得重组猪-α干扰素粗品；
12、重组猪-α干扰素粗品的纯化:
12.1往层析柱中填装金属螯合亲和层析介质；
12.2 依次用超纯水、I mol/L NaOH,0.2 mol/L EDTA 溶液各清洗一次。0.1 mol/LNiS04 (内含0.3 mol/L NaCl)溶液过柱，挂Ni。再用水清洗一次，除去游离的Ni离子。
[0069]12.3 用平衡 Buffer (50 mmol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCl 缓冲液，内含 0.1 mol/LNaCl)平衡，直至紫外检测值不变。
[0070]12.4上样，使裂解液随流动相进入金属螯合亲和层析柱；
12.5 用平衡 Buffer (50 mmol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCl 缓冲液，内含 0.1 mol/L NaCl)平衡柱子，洗去未与介质结合的杂质，紫外检测值不变，将其调零，作为基准。
[0071]12.6流动相A相:50mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，流动相B相:在体积为IL的A相中加入34 g咪唑而得，B相的梯度浓度为2 9Γ80 % (V/V)，进行梯度洗脱，收集每个梯度的洗脱峰。
[0072]12.7对每个洗脱峰进行SDS-PAGE电泳鉴定目标蛋白，将经SDS-PAGE电泳鉴定为重组猪-α干扰素的水溶液用透析袋除盐，置于-80 °C超低温冰箱中预冻4 h，在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，即得精制重组猪-α干扰素。
[0073](二)重组猪长效-α干扰素的修饰:
1、用PH值为4.0的磷酸盐缓冲液，将上述步骤所得的精制重组猪- α干扰素配置成1.2mg/mL的重组猪- α干扰素的磷酸盐反应溶液；
2、在反应温度4°C条件下，将甲氧基聚乙二醇丙醛添加到重组猪-α干扰素的磷酸盐反应溶液中，其中甲氧基聚乙二醇丙醛与重组猪-α干扰素的摩尔比为1:1，再加入氰基氢硼化钠(以反应溶液的总体积计，氰基氢硼化钠添加浓度为浓度为lmg/mL)，搅拌均匀，进行修饰反应6 h ；
3、反应结束后加入过量的甘氨酸终止反应,得反应液；
4、将所得反应液过SP阳离子交换层析柱，流动相A相:50mmol/L、pH值为4.5的乙酸乙酸钠缓冲液，流动相B相为:在体积为IL的A相中再加入117g氯化钠而得，B相的梯度浓度59T30% (V/V)，在此条件下进行梯度洗脱，对各洗脱峰物质用SDS-PAGE电泳鉴定目标产物，收集得单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰重组猪长效-α干扰素水溶液。
[0074]5、将收集得重组猪长效-α干扰素水溶液用透析袋除盐，置于-80 1:超低温冰箱中预冻4 h，在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，即得重组猪长效-α干扰素。
[0075]所述重组猪-α干扰素纯度达到95%以上；并进行SP阳离子交换层析法纯化，甲氧基聚乙二醇丙醛对重组猪长效-α干扰素的单修饰率达到60%以上，延长重组猪长效-α干扰素在猪体内的半衰期至44.5 h。
[0076]二、一种重组猪长效-α干扰素冻干注射剂，采用重组猪长效-α干扰素为主要原料，通过添加剂协同保护，经溶液配制、脱内毒素、除杂除菌、分装、冻干后制得；其中原料的浓度，以配制溶液的总体积计为:磷酸氢二钠0.01mmol/L,氯化钠9g/L，甘露醇1%(V/V)，重组猪长效-α干扰素0.5 X 14 U/L (重组猪长效_ α干扰素的比活性为4.41 X 15 U/mg)。
[0077]三、所述重组猪长效-α干扰素冻干注射剂的制备方法，包括如下步骤:
1、在无菌操作室内，称取0.0014g磷酸氢二钠、9 g氯化钠、10 mL甘露醇、活力为
0.5X 14 U的重组猪长效-α干扰素,倒入灭菌盐水瓶中,用超纯水定容至IL ；
2、向配置好的药液中加入0.2% (W/V)的针用活性炭，搅拌10 min，除去内毒素；
3、在已灭菌的布氏漏斗上铺垫两层灭菌滤纸，将除内毒素的药液通过滤纸，滤除杂质； 4、用0.22 μ m钟罩式滤器过滤除去杂质的药液，滤除杂菌；
5、将滤除杂菌的药液以每瓶1mL的份量，分装到相应的西林瓶中，盖上棉塞封口；
6、将分装好的药液在低于冻干保护剂最低共熔点81:的温度下，预冻12 h；
7、预冻好的药品，在冷凝器温度-50°C、压强范围10 Pa的条件下，进行升华干燥
12h ；
8、所得升华干燥好的药品在压强范围15Pa条件下，-15°C进行解析干燥4 h；
9、将冷冻干燥机压强降至10Pa，将所得解析干燥好的药品在-10°C继续冷冻干燥
2h，；
10、将冻干后的重组猪长效-α干扰素注射剂产品，在无菌条件下加塞压盖，即得重组猪长效-α干扰素冻干注射剂。
[0078]实施例2:
一、一种重组猪长效-α干扰素构建和PEG修饰。
[0079](一)重组猪长效-α干扰素的构建:
1、引物设计:
利用Primer 5.0，根据GenBank中登录号M28623.1的猪IFN- α基因序列，设计扩增猪α-干扰素成熟肽基因的引物。上游引物5’端添加EcoR I限制性酶切位点和ATG起始密码子，下游引物5’端添加Xho I限制性酶切位点。
[0080]上游引物为5，-GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’ ；
下游引物 5’ -CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’。
[0081]引物送经Takara公司合成。
[0082]2、猪肝脏基因组DNA的提取:用组织/细胞DNA (小量)抽提试剂盒(WatsonB1technologies, Inc)对猪肝脏基因组DNA进行提取。
[0083]2.1称取猪肝脏组织20 mg左右(最大起始量:25 mL)，移入1.5 mL EP离心管中。
[0084]2.2在冰袋上，用配备的组织捣碎棒将组织彻底捣碎。
[0085]2.3加入200 μ L DLT液，涡旋震荡，使组织碎片重悬。65 °C温浴，并不断晃动，直至无组织碎片存在。
[0086]2.4 加入 200 μ L DT 液，8 μ LRNase A (核糖核酸酶)和 25 μ L Proteinase K(蛋白酶K)，迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。65 °C水浴30 min，并不时晃动。
[0087]2.5以12000 r/min离心5 min，将上清移入离心管中。
[0088]2.6加入200 μ L无水乙醇，混匀后加到吸附柱中，12000 r/min离心30 S。将吸附柱移入一个干净的收集管中。
[0089]2.7 加入 500 μ L Wash buffer,静止 I min 后，12000 r/min 离心 30 S。取出吸附柱，倒掉收集管中的液体后放回。
[0090]2.8重复步骤7 —次。
[0091]2.9 12000 r/min 离心 I min。
[0092]2.10取出吸附柱放入1.5 mL离心管中。还慢在柱中白色吸附膜中央加入滴加60μ LElut1n buffer, 65。。静置 5 min 后，12000 r/min 离心 I min。
[0093]2.12 将收集管(DNA) -20 °C保存。
[0094]3、猪α -干扰素成熟肽基因的克隆: PCR反应体系
Ex Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L,
1X扩增缓冲液5 yL，Mg2+4 yL ,
4种dNTP混合物4 yL，
引物I (上游引物) I UL，
引物2 (下游引物) I yL，
模板 DNAIuL,
双蒸水33.75 μ L，
将上述溶液混匀后稍离心，再置于PCR仪中，
PCR反应条件:
95°C预变性5 min ,
94 °C 变性 45 s，
61 °C退火45 s (温度梯度PCR后，选定)，
72 °C延伸 I min,
循环30次，
最后72 °C延伸7 min。
[0095]4、DNA 电泳:
1.0%琼脂糖凝胶的制备:称取1.0 g琼脂糖，加入100 mLl X TAE缓冲液。电磁炉加热溶解，冷却60 °C左右时，加入5 μ L的EB母液。混匀后倒入插好梳子的电泳模板中。室温自然凝固后(约30 min)，将胶连同电泳板放入电泳槽中。加入电泳缓冲液，使其没过胶面。
[0096]加样5 μ L DNA提取物加I μ L 6XDNA上样缓冲液，混匀后上样。
[0097]电泳恒压110 V电泳约30 min。指示剂迁移到适当位置，停止电泳。
[0098]成像将凝胶置于紫外能下观察将凝胶置于紫外灯下观察，照相。
[0099]5、目的片段的回收:
5.1在凝胶成像系统中，切下目的DNA片段。转移到1.5 mL离心管中。5.2称量出凝胶块质量，按I g凝胶加入I ml Binding Buffer的比例加入Binding Buffer润旋振荡后，65 °C温浴7 min至凝胶完全融化，期间颠倒震荡。
[0100]5.3转移700 uL DNA脂糖溶液到HiBindTM DNA柱子中，将其放入2 mL收集管中，10，000 g离心I min，取出柱子，弃去收集管中液体。5.4将柱子重新套回收集管中，力口300 μ L Binding Buffer 至 HiBind DNA 柱子中；静置 I min, 10，000 g 离心 I min,弃去收集管中液体。
[0101]5.5将柱子放回收集管中。加入700 UL SPff Wash buffer。室温下静置Imin后
10,000g离心I min。弃去收集管中滤出液。
[0102]5.6重复步骤5—次.。
[0103]5.7将柱子重新放回收集管，13，000 g离心I min，清除残留在柱中的液体。5.8把柱子放入1.5 mL离心管，滴加30 μ L洗脱液至柱子膜中央。室温静置I min后，13，000g离心I min，滤出液即为是目的DNA溶液，-20 °C保存备用。6质粒的提取
6.1在含Amp (氨苄青霉素)的LB平板上，挑取阳性克隆。转接到5 mL含Amp (氨苄青霉素)(工作浓度为100 μ g/mL)的LB液体培养基中。37 °C振荡(转速为300 r/min)培养12 h。6.2取5 mL菌液，批次放入1.5 mL EP管中。10000 g离心I min。6.3弃去上清，向EP管中加含RNase A的溶液I 250 μ L。涡漩振荡使菌体重悬。
[0104]6.4加入250 μ L溶液II至离心管中，快速温和颠到数次，直至裂解液变澄清。
[0105]6.5加350 μ L溶液III至离心管中，快速温和颠倒数次，白色絮状沉淀出现。
[0106]6.6 13000 g离心10 min。6.7轻轻吸取上清(避免沉淀和细胞碎片的吸入)，移入已套好2 mL离心管的吸附柱中。室温10000 g离心I min。6.8弃去滤过液。向吸附柱中加入500 μ L Buffer HB。10000 g离心lmin,除去蛋白质残留。
[0107]6.9弃去滤过液。700 μ L Wash Buffer (已按照说明加入100%乙醇稀释过)清洗吸收柱，10000 g离心I min。
[0108]6.10重复步骤8，再加700 μ L Wash Buffer清洗吸收柱。6.11 13000 g离心2min取出吸附柱中残留的乙醇。6.12将吸收柱放入干净1.5 mL离心管，滴加30 μ L TE缓冲液在吸附柱滤膜中央。静置I min后13000 g离心I min。
[0109]7、质粒和PCR产物的双酶切
取一个干净、灭菌的200 μ L的EP管，按下表加入各种试剂水15 μ L,
1XH buffer5 μ L,
PCR产物(或质粒DNA)25 μ L，
EcoR I2.5 μ L，
Xho I2.5 μ L，
总体积50 μ L，
PCR产物，37 °C保温2 11;质粒0嫩，37 °C保温过夜。
[0110]8、DNA片段的连接；
连接反应体系如下:
PCR回收产物7.0 μ L,
2XT4DNA连接酶缓冲液 1.0 μ L， pET32a Vector1.0 μ L,
T4DNA 连接酶1.0 μ L,
共计10.0 μ L，
混匀离心，16 1:放置过夜(以上均在冰上操作)。
[0111]9、感受态细胞的制备:
9.1受体菌的培养:从含LB平板上挑去活化的DH5 α大肠菌落，转接到5 mL LB液体培养基中，37 °C培养过夜。次日，将菌液按照1:100的比例接种到100 mL的LB液体培养基中，37 °C培养，直至OD6tltl值达到0.6、.8。 9.2感受态细胞的制备(CaCl2法):
9.2.1培养液冰上预冷10 min后，4 °C 3000 g离心10 min。9.2.2弃去上清，用10 mL0.05 mol/L的CaCl2溶液(已4°C预冷)轻轻吹打，使细胞悬浮。冰上预冷30 min。4 V3000 g离心10 min。9.2.3弃去上清，加入4 mL含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2溶液(已4 °C预冷)轻轻吹打，使细胞悬浮。将装有细胞悬液的锥形瓶置于冰上。9.2.4将感受态细胞装入无菌、已预冷的1.5 mL EP管(200 yL/支)，-70 °C保存。
[0112]9.3感受态细胞的转化:
9.3.1将经过灭菌的1.5 mL的EP放入-20 °C的冰箱预冷，然后每管加入200 μ L的感受态细胞；再加入连接产物5 μ L ;冰浴40?60 min。放置同时设立对照，阳性对照为Control Insert DNA连接产物；空白对照为酶切后的空载体。
[0113]9.3.2将EP管放入42 °C水浴锅中预热好的架子上，计时90 s (此时不能摇动)。
[0114]9.3.3计时结束后，将EP迅速放入冰浴中2?3 min。
[0115]9.3.4将连接产物放入到800 μ L的无菌LB液体培养基中，37 °C，150 r/min培养I h，使细菌复原，并是其抗生素基因得以表达。
[0116]9.3.5转移100 μ L的培养液，在含有Amp (氨苄青霉素)的LB平板上涂布(如菌浓过大，可以将涂布量降低)。
[0117]9.3.6将平板室温放置，直至液体被吸干(转化前，先将平板从4 °C拿出，再倒置放入培养箱，这样避免了对转化菌的再刺激)。
[0118]9.3.7 37 1:培养过夜，次日可观察到转化克隆的出现。
[0119]10阳性克隆的鉴定:
10.1菌落PCR鉴定:
以Amp (氨苄青霉素)平板上出现的转化克隆为模板，挑取5个以上，按照先前的PCR反应体系和条件进行扩增；通过琼脂糖凝胶电泳对其进行初步鉴定。
[0120]10.2双酶切鉴定:
将经过鉴定为阳性的克隆进行扩大培养。将其加入含Amp (氨苄青霉素)的LB液体培养中，37 °C, 180 r/min，培养过夜。达到一定菌浓后，使用质粒提取试剂盒提取质粒。质粒双酶切，37 °C，2 h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0121]水3 yL，
1XH bufferI μ L,
PCR产物(或质粒DNA)5 μ L，
EcoR I0.5 μ L，
Xho I0.5 μ L，
总体积10 μ L，
测序鉴定:
将双酶切为阳性的质粒，送TaKaRa公司测序，测序结果与GeneBank中登录号为M28623.1的猪IFN-α成熟肽基因序列进行比对。
[0122]11重组猪-α干扰素的诱导表达:
11.1种子菌的活化:
用接种环挑取少量重组菌株菌液在含有氨苄青霉素的LB平板上划线，放入37 °C培养箱，倒置培养过夜。次日，平板上出现的单菌落即为种子菌。
[0123]11.2种子菌的一次活化:用接种环挑取种子菌单菌落，接种于5 ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C, 180 r/min，培养过夜。
[0124]11.3种子菌的扩大培养:将活化的菌液按照1:100的比例接种于50 ml含Amp(氨苄青霉素)的LB液体培养基中37°C，180 r/min，培养过夜。然后，按照同样的比例放大到5L的锥形瓶中培养，培养条件同样为37 V，180 r/min。待其OD6tltl值到达0.6^0.8时，即可进行诱导。
[0125]11.4 重组猪-α干扰素的诱导表达:
?向扩大培养的种子菌中加入5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液ImL, 22 °C下诱导10 h。将诱导结束后得到的培养液于10000 r/min的离心速度下离心I min，收集菌体沉淀，称取菌体沉淀的重量，并加入菌体沉淀重量10倍体积的裂解液，吹打使菌体重悬，预冷后超声破碎，将超声破碎后的液体于4 0Cuoooo r/min的离心速度下离心10 min，取离心上清液，加入与离心上清液等体积的2 X Loading Buffer (上样缓冲液)，取上述混合溶液于100 °C下煮沸10 min,得重组猪-α干扰素粗品；
12重组猪-α干扰素粗品的纯化:
12.1往层析柱中填装金属螯合亲和层析介质；
12.2 依次用超纯水、I mol/L NaOH,0.2 mol/L EDTA 溶液各清洗一次。0.1 mol/LNiS04 (内含0.3 mol/L NaCl)溶液过柱，挂Ni。再用水清洗一次，除去游离的Ni离子。
[0126]12.3 用平衡 Buffer (50 mmol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCl 缓冲液，内含 0.1 mol/LNaCl)平衡，直至紫外检测值不变。
[0127]12.4上样，使裂解液随流动相进入金属螯合亲和层析柱；
12.5 用平衡 Buffer (50 mmol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCl 缓冲液，内含 0.1 mol/L NaCl)平衡柱子，洗去未与介质结合的杂质，紫外检测值不变，将其调零，作为基准。
[0128]12.6流动相A相:50mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，流动相B相:在体积为IL的A相中加入34 g咪唑而得，B相的梯度浓度为2 9Γ80 % (V/V)，进行梯度洗脱，收集每个梯度的洗脱峰。
[0129]12.7对每个洗脱峰进行SDS-PAGE电泳鉴定目标蛋白，将经SDS-PAGE电泳鉴定为重组猪-α干扰素的水溶液用透析袋除盐，置于-80 °C超低温冰箱中预冻4 h，在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，即得精制重组猪-α干扰素。
[0130](二)重组猪长效-α干扰素的修饰:
1、用PH值为10.0的磷酸盐缓冲液，将上述步骤所得的精制重组猪-α干扰素配置成
2.0mg/mL的重组猪-α干扰素的磷酸盐反应溶液；
2、在反应温度4°C条件下，将甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺添加到重组猪-α干扰素的磷酸盐反应溶液中，其中甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺与重组猪-α干扰素的摩尔比为6:1，再加入氰基氢硼化钠(以反应溶液的总体积计，氰基氢硼化钠添加浓度为浓度为lmg/mL)，搅拌均匀，进行修饰反应30 h；
3、反应结束后加入过量的甘氨酸终止反应,得反应液；
4、将所得反应液过SP阳离子交换层析柱，流动相A相:50mmol/L、pH值为4.5的乙酸乙酸钠缓冲液，流动相B相为:在体积为IL的A相中再加入117 g氯化钠而得，B相的梯度浓度59T30% (V/V)，在此条件下进行梯度洗脱，对各洗脱峰物质用SDS-PAGE电泳鉴定目标产物，收集得单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺修饰重组猪长效-α干扰素水溶液。
[0131]5、将收集得重组猪长效-α干扰素水溶液用透析袋除盐，置于-80 1:超低温冰箱中预冻4 h，在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，即得重组猪长效-α干扰素。
[0132]二、一种重组猪长效-α干扰素冻干注射剂，采用重组猪长效-α干扰素为主要原料，通过添加剂协同保护，经溶液配制、脱内毒素、除杂除菌、分装、冻干后制得；其中原料的浓度，以配制溶液的总体积计为:磷酸氢二钠0.03 mmol/L，氯化钠15 g/L，甘露醇3%(V/V)，重组猪长效-α干扰素的浓度为1.5Χ104 U/L (重组猪长效-α干扰素的比活性为
4.41 X 15 U/mg)。
[0133]三、所述重组猪长效-α干扰素冻干注射剂的制备方法，包括如下步骤:
1、在无菌操作室内，称取0.0085 g磷酸氢二钠、30 g氯化钠、60 mL甘露醇、活力为
3.0XlO4 U的重组猪长效-α干扰素,倒入灭菌盐水瓶中,用超纯水定容至2 L ；
2、向配置好的药液中加入0.4% (W/V)的针用活性炭，搅拌20 min，除去内毒素；
3、在已灭菌的布氏漏斗上铺垫两层灭菌滤纸，将除内毒素的药液通过滤纸，滤除杂质；
4、用0.22 μ m针头式滤器过滤除去杂质的药液，滤除杂菌；
5、将滤除杂菌的药液以每瓶20mL的份量，分装到相应的西林瓶中，盖上棉塞封口 ；
6、将分装好的药液在低于冻干保护剂最低共熔点101:的温度下，预冻12 h；
7、预冻好的药品，在冷凝器温度-40°C、压强范围30 Pa的条件下，进行升华干燥12
h ；
8、所得升华干燥好的药品在压强范围30Pa条件下，-15 °C进行解析干燥6 h；
9、将冷冻干燥机压强降至10Pa，将所得解析干燥好的药品在-10 °C继续冷冻干燥2
h ；
10、将冻干后的重组猪长效-α干扰素注射剂产品，在无菌条件下加塞压盖，即得重组猪长效-α干扰素冻干注射剂。
[0134]四、上述重组猪长效-α干扰素活性测定:
实验例I重组猪长效-α干扰素体外活性:
1、将重组猪长效-α干扰素样品用含7%新生牛血清的测定培养基稀释，使最终蛋白浓度为10-100 μ g/mL,并作4倍系列稀释。
[0135]2、取保存的病毒，室温融化，用无血清DMEM培养基稀释至100XCCID5(I。
[0136]3、按上述方法培养细胞并铺板，培养至细胞丰度达到80%以上。
[0137]4、弃去上清，每孔加梯度稀释的干扰素100 UL作用18 h，空白对照组和病毒对照组加7%测定培养基。
[0138]5、用少量无血清培养基洗去残余血清，每孔加100 μ L病毒稀释液攻毒I h，空白对照组和干扰素最高浓度组加入100 yL无血清培养基。I h后，弃去上清，所有孔加入攻毒培养基100 uL, 37 1:培养观察，每日记录病变情况。
[0139]6、用Reed-Muench法计算重组猪长效-α干扰素的生物学活性。
[0140]将重组猪长效-α干扰素溶液用7%测定培养基稀释100倍，终浓度为37.4 μ g/mL,用于4倍系列稀释。
[0141]按计划进行实验，每天观察，记录重组猪长效-α干扰素对Marc-145细胞病变保护的结果，按Reed-Muench法计算公式计算重组猪长效-α干扰素活性，结果显示:重组猪长效-α干扰素的比活性为4.41Χ105 U/mg，细胞对照组均未发生病变，病毒对照组均出现病变。
[0142]实验例2:重组猪长效-α干扰素在仔猪体内测活:
重组猪长效-α干扰素皮下给药后144 h仍可测出24.45±8.78 μ g/ml的血药浓度。与未修饰前比较，清除半衰期从3.2 h延长到44.5 h，延长近14倍。
[0143]实验例3:剂型、剂量、稳定性实验。
[0144]1、本发明为一种注射粉针，灭菌蒸馏水稀释后即可使用；
2、根据体外活性测定，设计了5 yg/kg,8 μ g/kg, 12 μ g/kg的注射量，进行仔猪实验，肌肉注射，测定在猪体内的半衰期，优化选择获得重组猪长效-α干扰素冻干注射剂的有效剂量为8 μ g/kg,肌肉注射；
3、考察猪长效-α干扰素冻干注射剂分别在4°C、室温、37 °C下的稳定性，结果显示:猪长效-α干扰素冻干注射剂在4 °C下保存期为2年；室温条件下为I年；37 1:条件下为I个月。
[0145]实验例4:药学研究:药理毒理实验。
[0146]1、急毒:在豚鼠中未获得最大致死剂量。
2、一般药理、特殊毒理、免疫毒性、局部刺激和体外溶血测定未见明显异常。
[0147]3、长期毒性
三个剂量组的注射量分别为10、30、90 ug/kg，皮下注射，隔日注射一次，连续给药30天，停药恢复30天。一般情况(体温、体重、进食)、生化、凝血指标、尿液、眼部、心电图、骨髓和脏器系数无明显异常。未发现脏器发生病理性改变。
[0148]4、猪药代动力学
皮下给药后144 h仍可测出24.45±8.78 ug/ml的血药浓度。与未修饰前比较，清除半衰期从3.2 h延长到44.5 h，延长近14倍；平均滞留时间从7.79 h延长至47.5 h，延长了近7倍。
[0149]5、免疫原性:本品在猪体内产生的抗体滴度为1:500，与未修饰前相比，降低了近200 倍。
[0150]五、经济效益和社会效益的分析:
经市场分析，目前没有良好的猪抗病毒药物，目前所使用的猪干扰素半衰期短，价格昂贵，每年必须重复用药，每针20-30元，一个疗程需注射5-7针，多数养猪户无法承担。本发明研制的猪长效-α干扰素冻干注射剂一般只需注射一次，可取得良好效果，每针在10元以内。按目前的养殖规模和发展趋势，年生产2000万剂，每年即可取得上千万的经济效益。社会效益:养猪生产关系国计民生的大问题，近年来猪肉价格的节节攀升已经证明了这个问题。猪肉价格会严重影响农产品价格。有效防治猪传染性疾病，促进养猪业健康发展无疑对保障市场供给，稳定人们的物质生活具有显著的社会效益。
【权利要求】
1.一种重组猪长效-α干扰素(rpoIFN- α )，其特征在于:先使用原核表达系统可溶性表达猪-α干扰素，再使用聚乙二醇修饰重组猪-α干扰素得重组猪长效-α干扰素(rpoIFN- α )； 所述聚乙二醇修饰剂为甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺。
2.一种重组猪长效-α干扰素的构建方法，包括如下步骤: 1)引物设计:根据GenBank中登录号Μ28623.1的猪干扰素的基因序列，利用Primer5.0生物软件，设计扩增猪干扰素成熟肽基因的引物: 上游引物:5’ -GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’， 下游引物:5’ -CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3，； 2)猪肝脏基因组DNA提取:用DNA抽提试剂盒对猪肝脏基因组DNA进行提取； 3)猪-α干扰素成熟肽基因的克隆:根据步骤1)、2)所得引物与猪肝脏基因组DNAjlJ用PCR扩增技术，对猪-α干扰素成熟肽基因进行克隆； 4)DNA电泳:采用琼脂糖凝胶电泳对步骤3)所得猪-α干扰素成熟肽基因进行电泳分离，并对目标片段进行回收，得到PCR回收产物； 5)提取质粒:用质粒提取试剂盒对质粒进行提取； 6)质粒与PCR产物的双酶切:对步骤4)所得PCR回收产物和步骤5)所得质粒分别进行双酶切； 7)DNA片段的连接:将步骤6)所得双酶切后的PCR回收产物与载体质粒在Τ4连接酶的作用下进行连接； 8)感受态细胞的制备:挑取活化的大肠杆菌于LB液体培养基中，37°C培养，直至0D_值达到0.6^0.8，取培养液用Cacl2法制备感受态细胞； 9)感受态细胞的转化:将步骤7)得到的重组质粒转入到新鲜制备的步骤8)所得感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板上，37 1:培养过夜； 10)阳性克隆的鉴定:取步骤9)中含氨苄青霉素的LB培养基平板上生长的菌落经PCR反应进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定；取通过PCR鉴定为阳性的克隆进行扩大培养、提取质粒、双酶切、酶切产物鉴定，鉴定为阳性即表示载体构建成功； 11)重组菌株的诱导表达:挑选步骤10)制备得的阳性克隆于100mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 0C >180 r/min培养过夜，直至OD6tltl值为0.6?0.8时，加入f 5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液lmL，22 °C下诱导Γ?Ο h，将诱导结束后得到的培养液于10000 r/min的离心速度下离心I min,收集菌体沉淀,称取菌体沉淀的重量,并加入菌体沉淀重量3?10倍体积的裂解液，吹打使菌体重悬，预冷后超声破碎，将超声破碎后的液体于4 0CuOOOO r/min的离心速度下离心10 min，取离心上清液，加入与离心上清液等体积的2XLoading Buffer (上样缓冲液)，取上述混合溶液于100 °C下煮沸10 min,得重组猪-α干扰素粗品； 12)重组猪-α干扰素粗品的纯化:将步骤11)所得重组猪-α干扰素粗品过镍离子金属螯合亲和层析柱进行分离纯化，用洗脱液进行梯度洗脱，收集每个梯度的洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳鉴定目标蛋白，将经SDS-PAGE电泳鉴定为重组猪-α干扰素的水溶液用透析袋除盐，置于-80 °C超低温冰箱中预冻4 h，在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，即得精制重组猪-α干扰素。
3.根据权利要求2所述重组猪长效-α干扰素(rpoIFN-α)的构建方法，其特征在于，步骤5)、6)和7)所述质粒为质粒pET-32a。
4.根据权利要求2所述重组猪长效-α干扰素(rpoIFN-α)的构建方法，其特征在于，步骤8)中所述大肠杆菌为BL21 (DE3)型大肠杆菌菌株。
5.根据权利要求2所述重组猪长效-α干扰素(rpoIFN-α)的构建方法，其特征在于，步骤12)中所述梯度洗脱，流动相A相:50mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，流动相B相:在体积为IL的A相中再加入34 g咪唑而得，B相的梯度浓度为2 9Γ80 % (V/V)。
6.一种重组猪长效-α干扰素的修饰方法，包括如下步骤: 1)用磷酸盐缓冲液将上述制得的精制重组猪-α干扰素配置成重组猪-α干扰素的磷酸盐反应溶液； 2)在反应温度4°C条件下，将聚乙二醇修饰剂添加到步骤I)所述含重组猪-α干扰素的磷酸盐反应溶液中，再加入氰基氢硼化钠，搅拌均匀，进行修饰反应； 3)向步骤2)所述溶液中加入过量的甘氨酸终止反应，得反应液； 4)将步骤3)所得反应液过SP阳离子交换层析柱，用洗脱液进行梯度洗脱，对各洗脱峰物质用SDS-PAGE电泳鉴定目标产物，收集得单聚乙二醇修饰重组猪长效-α干扰素水溶液，将所得重组猪长效干扰素水溶液用透析袋除盐，置于-80 °C超低温冰箱中预冻4h，在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，即得修饰的重组猪长效-α干扰素； 其中，步骤I)所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为4.(Γ10.0，磷酸盐缓冲溶液中重组猪- α干扰素的浓度为1.2?2.0mg/mL ； 步骤2)中所述聚乙二醇修饰剂为甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺，所述聚乙二醇修饰剂与重组猪-α干扰素的摩尔比为1:1飞:1，以反应溶液的总体积计，添加的氰基氢硼化钠浓度为lmg/mL，修饰反应时间为6?30 h ； 步骤4)中所述梯度洗脱，流动相A相:50mmol/L、pH值为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，流动相B相为:在体积为IL的A相中再加入117g氯化钠而得，B相的梯度浓度为5°/Γ30%(V/V)。
7.—种重组猪长效-α干扰素冻干注射剂，其特征在于:采用重组猪长效-α干扰素为主要原料，通过添加剂协同保护，经溶液配制、脱内毒素、除杂除菌、分装、冻干后制得； 所述原料的浓度，以配制溶液的总体积计为:磷酸氢二钠0.0Γ0.03 mmol/L，氯化钠9?15 g/L，冻干保护剂1%?3% (V/V)，重组猪长效-α干扰素0.5 X 14?1.5 X 14 U/L，其中重组猪长效-α干扰素的比活性为4.41 X 15 U/mg ； 所述重组猪长效-α干扰素为权利要求6所得； 所述冻干保护剂为甘露醇。
8.—种重组猪长效-α干扰素冻干注射剂的制备方法，包括如下步骤: 1)在无菌操作室内，根据要配制溶液的体积，称取磷酸氢二钠、氯化钠、冻干保护剂和重组猪长效-α干扰素，倒入灭菌盐水瓶中，用超纯水定容至要配制的体积；其中，以配制溶液的总体积计，磷酸氢二钠、氯化钠、冻干保护剂、重组猪长效-α干扰素的最终浓度为磷酸氢二钠0.0Γ0.03mmol/L,氯化钠9?15g/L，冻干保护剂1%?3% (V/V)，重组猪长效-α干扰素0.5Χ104?1.5X104U/L (重组猪长效-α干扰素的比活性为4.41 X 15 U/mg)； 2)在步骤I)配置好的药液中加入内毒素脱除剂，搅拌1(T20min ； 3)在已灭菌的布氏漏斗上铺垫两层灭菌滤纸，将步骤2)所得药液通过滤纸，滤除杂质； 4)用0.22 μ m不锈钢钟罩式滤器过滤步骤3)所得药液，滤除杂菌； 5)将步骤4)所得滤除杂菌的药液以每瓶1lOmL的份量，分装到相应的西林瓶中；6)将步骤5)所得药液在低于冻干保护剂最低共熔点8?101:的温度下，预冻12 h； 7)将步骤6)预冻好的药品，在冷凝器温度〈-40°C、压强范围l(T30Pa的条件下，进行升华干燥12h ； 8)将步骤7)所得升华干燥好的药品在压强范围15?30Pa条件下，_15°C进行解析干燥4?6 h ； 9)将冷冻干燥机压强降至10Pa，将步骤8)所得解析干燥好的药品在-10°C继续冷冻干燥2h ； 10)将步骤9)冻干后的重组猪长效-α干扰素注射剂产品，在无菌条件下加塞压盖，即得重组猪长效-α干扰素冻干注射剂。
9.根据权利要求8所述重组猪长效-α干扰素冻干注射剂的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为甘露醇，所述重组猪长效- α干扰素为权利要求6所得。
10.根据权利要求8所述重组猪长效-α干扰素冻干注射剂的制备方法，其特征在于，所述内毒素脱除剂为0.29ΓΟ.4% (W/V)的针用活性炭。
【文档编号】C12N15/70GK104262480SQ201410507156
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】蔡家利, 吴胜昔, 王远强, 胡仁建, 户国达, 尹忠宝 申请人:重庆理工大学