加强了基因簇表达的重组淀粉酶产色链霉菌及其构建方法
【专利摘要】本发明公开一种加强了基因簇表达的重组淀粉酶产色链霉菌及其构建方法。它过量表达了生物合成丰加霉素的整个toy基因簇，具有比淀粉酶产色链霉菌( Streptomyces diastatochromogenes )1628更高的丰加霉素合成能力。构建过程如下：1）构建表达载体pSET152-toyAM； 2）利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。利用接合转移法将载体pSET152-toyAM特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌( Streptomyces diastatochromogenes )1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。与原始菌株相比，丰加霉素产量提高了4.5倍。
【专利说明】加强了基因簇表达的重组淀粉酶产色链霉菌及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及通过加强基因簇toy AM在淀粉酶产色链霉菌的表达提高丰加霉素产 量，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 丰加霉素是一种新型核苷类抗生素，分子式为C12H13N 5O4，核糖C1连接类似鸟嘌呤 的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转 录而影响菌体的生长，其生物活性研究报道主要集中在临床医学领域。近期有研究发现丰 加霉素对多种植物疫病具有良好的防治效果，长期使用不会造成环境污染，而且对植物生 长也具有一定的调节作用。因此，丰加霉素在农业植物病害防治领域具有的应用潜力。相 对于化学合成法，生物法合成丰加霉素以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以 及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前丰加霉素工业化生产比较经济有效的方法。
[0003] 丰加霉素属于次级代谢产物，合成途径复杂，受到多种因素的限制与调控，导致丰 加霉素合成水平较低，难以规模化生产。解决该问题的现有办法一般都是通过传统的诱变 育种作为主要手段筛选高产优质的生产菌株，但筛选到高效菌株的不确定因素多、周期长。
[0004] 如何利用分子生物学等先进的技术手段改良微生物进一步提高丰加霉素的产量 成为一条可行的思路。McCarty等人以一株合成丰加霉素菌株 (ATCC14673)为起始研究对象，克隆了生物合成丰加霉素基因簇，阐明了丰加霉素的合 成过程及调控机制，研究发现丰加霉素由GTP为前体，经多步反应合成丰加霉素，其中 由toyAM基因负责丰加霉素的生物合成，且成簇排列(基因簇)。本研究小组在前期的 研究中以具有自主知识产权的丰加霉素生产菌株淀粉酶产色链霉菌 i/iasiaiocAroffiogefles) 1628为研究对象，克隆了基因簇中的部分结构基因，如toyB、 toyF等，并尝试在51 1628中过量表达，同时也克隆了 51 1628中负责次级代谢的多效调控因子adpA，但是丰加霉素产量提 高的幅度只有20% - 30%，对于工业化生产来说仍有待提高。利用代谢工程技术增加原始菌 株生物合成丰加霉素基因簇而不是单个结构基因的拷贝数，从而增加丰加霉素合成的代谢 通量而提高丰加霉素产量因为涉及问题复杂而未见相关报道。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种加强基因簇toyAM表达的重组淀粉 酶产色链霉菌及构建方法与用途。
[0006] 淀粉酶产色链霉菌1628是一株拮抗放线 菌，其发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，经分离提取，确定其主要有效成分 为丰加霉素，尚未见通过增加淀粉酶产色链霉菌丰加霉素生物合成基因簇的拷贝数来提高 丰加霉素产量的研究报道。
[0007] 本发明首先从以淀粉酶产色链霉菌1628 (菌株的保藏编号为CGMCC NO. 2060)中克隆负责丰加霉素生物合成的基因簇toyAM， 并将该基因簇与链霉菌整合型质粒PSET152连接，成功构建了基因簇toyAM的重组载体 pSET152-toyAM，并利用接合转移法将其特异性的整合在淀粉酶产色链霉菌聊cm 1628 染色体上。
[0008] -种加强了基因簇toyAM表达的重组淀粉酶产色链霉菌，它过量表达了基 因簇toyAM，具有比保藏编号为CGMCC NO. 2060淀粉酶产色链霉菌 i/iasiaiocAroffiogefles) 1628更高的丰加霉素表达能力。
[0009] 所述的原始菌为淀粉酶产色链霉菌（5?/·<9/7?ο?_7--(95· 1628。
[0010] 所述的基因簇toyAM来自于待重组的原始菌淀粉酶产色链霉菌（5?/·--/7?ο?_7----5· diastatochromogenes) 1628〇
[0011] 所述的基因簇toyAM整合入原始菌淀粉酶产色链霉菌（5?/·--/7?ο?_7----5· diastatochromogenes) 。
[0012] 所述的加强了基因簇toyAM表达的重组淀粉酶产色链霉菌的构建方法，过程如 下： 1) 构建表达载体pSET152-toy AM ; 2) 利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的重 组淀粉酶产色链霉菌。
[0013] 利用载体PSET152实现基因簇toy AM的过量表达，利用接合转移法 将载体pSET 152-toy AM特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌 1628的染色体，获得了遗传稳定的重组淀粉酶产色链霉菌。
[0014] 所述的加强了基因簇toyAM表达的重组淀粉酶产色链霉菌的用途，将重组淀粉酶 产色链霉菌进行发酵，与原始菌株相比，丰加霉素产量提高了 4. 5倍。
[0015] 本发明的有益效果： 本发明加强丰加霉素生物合成基因簇toy AM不仅成功在淀粉酶产色链霉菌中表达，而 且与原始菌相比，丰加霉素产量提高了 4. 5倍，出乎意料，为进一步提高丰加霉素产量，早 日实现大规模工业化生产奠定了良好基础，具有可预期的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是重组质粒pSET152_toy AM的构建示意图。
[0017] 图2是重组质粒pMD18-T- toyAM的酶切验证。
[0018] I. DNA Marker DL2000 ；2. λ mk/Η?η? III Marker ；3.质粒 pMD18-T_toyAM ; 4. pMD18-T-toyAM/fefflH I〇
[0019] 图3是重组穿梭表达质粒pSET152_toy AM的酶切电泳验证图。
[0020] 1. λ DNA/Vifld III Marker ;2· pSET152-toy AM/fe?H I。
[0021] 图 4 是 5： a/tos J1704-T0Y AM HPLC 检测丰加霉素图； A.原始菌株 5： 重组菌株 5： <3^?·5?1074-Τ0ΥΑΜ。
[0022] 图 5 是重组菌 51 1628-Τ0Υ AM 的 PCR 电泳验证图； I. DL2000 Marker ;2-3.基因工程菌株；4.原始菌株。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步的说明。
[0024] 实施例1 :基因簇toyAM的扩增及生物学功能验证 以 51 1628 染色体基因组为模板，以 Ptoy FifeffiHI 和 PtoyF R fe?HI为引物，PCR扩增获得含有汉·ΗΙ酶切位点的基因簇toy AM基因，与pMD18-T Vector 连接，构建克隆载体pMD18-T-toy AM,将克隆载体pMD18-T-toy AM转化至受体大肠杆菌中， 涂布于含氨苄抗性的LB琼脂平板上，37 °C培养过夜后，随机挑取阳性转化子酶切鉴定后 送上海生工测序并进行序列分析，用ifeMH酶切得到两端含有ifeMH酶切位点的基因簇toy AM,与同样利用fe?HI酶切且去磷酸化的链霉菌整合型穿梭表达载体pSET152连接，得到 重组穿梭表达载体pSET152-toy AM。经酶切验证后，将其转入凡^〇/丑77烈^76UZ8002)， 在卡那抗性和阿泊拉霉素抗性的LB平板上筛选阳性转化子万.co/iET 12567 (pUZ8002， pSET152-toy AM),以万· co/iET12567(pUZ8002, pIB139-toyF)为供体，模式链霉菌 aJTws J1074为受体，利用接合转移法将pSET152_toy AM整合在链霉菌51 Wto1S J1074染色体上，在阿泊拉霉素抗性MS平板上筛选阳性接合子，即得到重组链霉菌 J1074-T0Y AM。
[0025] 以51 1628染色体为模板,设计两条引物，PCR扩增toy AM,引物设计如下： toy F :5' -CGCGGATCCATGTATCGCACAGACGACGGACC-3' toy R Bamm -CGCGGATCCATGGCTTTTCGGATCACC -3， 重组质粒pMD18-T-toy AM以限制性内切酶酶切验证如图2所示，重组质粒 PMD18-T- toy AM酶切获得约11 kb和2. 7kb的DNA片段，分别与基因簇toy AM和质 粒PMD18-T的大小一致，说明重组克隆载体连接正确。对重组质粒pMD18-T-toy AM进 行测序，序列分析表明插入片段为10410 bp的序列，与NCBI已公布的不吸水链霉菌（5： 丰加霉素合成基因簇基因序列同源性最高达89%。基因簇核酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[0026] 整合型重组穿梭表达质粒pSET152_toy AM的及酶切验证结果如图3所示，重 组质粒pSET152-toy AM经fe?HI酶切释放11 kb的片段与基因簇toy AM大小一致，说明 质粒pSET152-toy AM构建正确，以接合转移法将其整合在模式链霉菌 J1074的染色体上，在阿泊拉霉素抗性平板上随机挑取若干单菌落于CP培养基中培养多 次后，提取染色体。PCR实验均能扩增出阿泊拉霉素抗性基因 a/7_r，证明重组菌5： WZw1S J1074-T0Y AM构建成功，且遗传稳定。对重组菌J1074-T0YF以及原始菌5： a/tos J1074 进行250 mL摇瓶发酵实验，从发酵角度对5： Wto1S J1074中基因簇toyAM的功能进行验 证。往复式摇床转速为200 r/min，28°C，发酵96h，对照组为链霉菌5： WZw1S J1074。如图 4所示，重组菌可检测到丰加霉素特征峰，且重复性良好。说明克隆获得的基因簇toyAM具 有生物学功能，可以实现丰加霉素的生物合成。
[0027] 实施例2 :淀粉酶产色链霉菌重组菌的构建 以接合转移法将重组质粒pSET152-toy AM整合在淀粉酶产色链霉菌 1628的染色体上，在阿泊拉霉素抗性平板上随机挑取若干单菌落 于CP培养基中培养多次后，提取染色体。PCR实验均能扩增出阿泊拉霉素抗性基因 a/ττ(图 5)，证明重组淀粉酶产色链霉菌1628-T0YAM构建成功，且遗传稳定。
[0028] 实施例3 :淀粉酶产色链霉菌原始菌及重组菌的发酵性能验证 与原始菌株S 1628相比，重组菌1628-T0YAM生物合成丰加霉 素基因簇中的结构基因的转录活性均明显高于原始菌株1628。 对重组菌1628-T0Y以及原始菌51 1628进行250 mL摇瓶发酵实 验，从发酵角度对淀粉酶产色链霉菌中生物合成丰加霉素基因簇拷贝数以及转录活性的增 加对丰加霉素产量的提高作用进行验证。往复式摇床转速为200 r/min，28°C，发酵96h，对 照组为淀粉酶产色链霉菌出发株。如表1所示，重组菌丰加霉素的产量高于原始菌，重组菌 丰加霉素最终产量达到mg/L，较原始菌提高了 4. 5倍，且重复性良好。说明在丰加霉素生产 菌株5： 1628中增加生物合成丰加霉素基因簇拷贝数有利于丰加霉 素的产量的提高。
[0029] 表1重组菌与原始菌最终丰加霉素产量的比较
【权利要求】
1. 一种加强了基因簇toy AM表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：它重组 表达了生物合成丰加霉素的基因簇toy AM，具有比保藏编号为CGMCC NO. 2060的淀 粉酶产色链霉菌1628更高的丰加霉素表达 能力；所述的基因簇toy AM来自于待重组的原始菌淀粉酶产色链霉菌 1628 ;所述的基因簇toy AM整合入原始菌淀粉酶产色链霉菌染色 体。
2. -种如权利要求1所述的加强了基因簇toy AM表达的重组淀粉酶产色链霉菌的构 建方法，其特征在于，过程如下： 1) 构建表达载体pSET152-toy AM ; 2) 利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的重 组淀粉酶产色链霉菌。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用载体pSET152实现基因簇toy AM的 过量表达，利用接合转移法将载体pSET152-toy AM特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌 1628的染色体，获得了遗传稳定的的重组淀粉酶 产色链霉菌；所述的加强了基因簇toy AM表达的重组淀粉酶产色链霉菌的用途，将重组淀 粉酶产色链霉菌进行发酵，与原始菌株相比，丰加霉素产量提高了 4. 5倍。
【文档编号】C12P19/40GK104312967SQ201410506760
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】马正, 俞晓平, 徐显皓, 陶立彬, 申屠旭萍, 边亚琳, 郝培应, 许益鹏 申请人:中国计量学院