L-天冬氨酸氧化酶变体和使用所述变体生产喹啉酸或烟酸的方法

L-天冬氨酸氧化酶变体和使用所述变体生产喹啉酸或烟酸的方法
【专利摘要】为有效生产喹啉酸，本发明提供其中由烟酸或NAD导致的反馈调节被解除的L-天冬氨酸氧化酶变体，和包括所述L-天冬氨酸氧化酶变体在内的微生物。可通过培养包括L-天冬氨酸氧化酶变体在内的微生物，有效生产喹啉酸。
KCCM 11434P
20130620
【专利说明】L-天冬氨酸氧化酶变体和使用所述变体生产喹啉酸或烟 酸的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及L-天冬氨酸氧化酶变体，包括编码所述L-天冬氨酸氧化酶变体的基 因的生产喹啉酸的微生物，和使用所述微生物高效生产喹啉酸或烟酸的方法。

【背景技术】
[0002] 烟酸是尼古丁的氧化物和复合维生素B的一员。它是一种水溶性维生素，也被称 为尼克酸，或维生素B3,并在动物和植物中普遍存在。烟酸的缺乏可能会导致糙皮病或神经 病变。通常，烟酸在体内以烟酸酰胺辅酶的形式存在，即，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)或 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，并参与氧化还原反应。
[0003]喹啉酸（quinolinate)，其也被称为喹啉酸（quinolinic acid)，其由喹啉的氧化 产生。喹啉酸已知具有神经毒性并导致多种神经障碍。喹啉酸也被认为是烟酸的前体。
[0004] 广泛地适用于食品和药品的烟酸可以通过化学合成法或生物学生产方法制备。化 学合成烟酸可能导致包括催化剂在内的大量有毒废料。因此，该废料需要彻底的管理和高 额费用进行处理。此外，作为前体的嘧啶具有多种衍生物，且嘧啶的供应和价格波动导致烟 酸不稳定的价格。
[0005] 为了从化学合成方法解决这些问题，研究了通过使用来源于可再生的碳水化合物 的材料生产烟酸的生物方法。主要通过两种生物合成途径完成烟酸的生物学生产，其中之 一是由色氨酸作为真核生物起始原料开始的烟酸生物合成途径，另一种是由天冬氨酸作为 原核生物起始原料开始的。两种途径都使用喹啉酸作为中间体，且通过喹啉酸磷酸核糖基 转移酶（nadC)、烟酸-单核苷酸腺苷转移酶（nadD)、NAD合成酶（nadE)、烟酰胺-核苷酸腺 苷转移酶（NMN nadR)和烟酰胺酶（pncA)的作用，从喹啉酸生物合成烟酸。
[0006] 经由天冬氨酸的途径使用重组大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌的烟酸的生物合成的 方法已经公开（韩国专利号10-1223904)。本发明的发明人研究了从烟酸的这些生物合成 方法解决问题并改善喹啉酸或烟酸的产率，发现了涉及喹啉酸的高产率生产的酶变体，并 完成了本发明。
[0007]发明详述
[0008] 技术问题
[0009] 本发明提供了 L-天冬氨酸氧化酶的变体，其显示出由烟酸或烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸（NAD)导致的反馈调节被解除。
[0010] 本发明提供了生产喹啉酸的微生物，所述微生物包含L-天冬氨酸氧化酶的变体。
[0011] 本发明提供了通过培养微生物生产喹啉酸的方法。
[0012] 本发明提供了通过培养微生物和喹啉酸的脱羧生产烟酸的方法。
[0013]技术方案
[0014] 本发明的一个方面提供了 L-天冬氨酸氧化酶的变体，其具有在SEQ ID NO: 1所表 示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。
[0015] L-天冬氨酸氧化酶具有将L-天冬氨酸氧化成亚氨基琥珀酸的催化活性，如反应 式1所示。
[0016]〈反应式1>
[0017] L-天冬氨酸+富马酸〈=> a -亚氨基琥珀酸+琥珀酸+H+
[0018] L-天冬氨酸+氧〈= > 过氧化氢+ a -亚氨基琥珀酸+H+
[0019] 本发明的L-天冬氨酸氧化酶可包括表示为SEQ ID N0:1的氨基酸序列。然而，它 并不限于此，因为取决于微生物物种或菌株，蛋白质的氨基酸序列可能存在差异。换言之， 它可以是突变体蛋白或人工变体，该突变体蛋白或人工变体具有在由SEQ ID N0 :1所表示 的氨基酸序列的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸的取代、删除、插入或添加的氨基 酸序列，只要它可以将L-天冬氨酸氧化成亚氨基琥珀酸。本文中，〃多个"可依据蛋白质的 氨基酸残基的三维结构中的位置或类型而有所不同，但具体地是指2至20,特别是2至10， 且更具体地2至5。此外，若基于在个体或微生物的种类的差异，氨基酸的取代、删除、插入、 添加或反转包括由人工变体或天然突变引发的那些。
[0020] 编码本发明的氨基酸序列的多核苷酸可包含编码具有表示为SEQ ID N0 :1的氨 基酸序列、或与其同源性为80 %或更多的氨基酸序列、特别是90 %或更多的氨基酸序列、 更具体地95 %或更多的氨基酸序列、特别具体地97 %或更多的氨基酸序列的蛋白的多核 苷酸序列，只要它具有与L-天冬氨酸氧化酶类似的活性。最具体地，它可以是由SEQ ID N0: 24所表示的多核苷酸序列。
[0021] 术语"同源性"是指两个氨基酸序列之间的同一性，且其可由本领域技术人员熟知 的方法确定，用BLAST2. 0来计算参数，例如得分、同一性和相似性。
[0022] 此外，编码本发明的L-天冬氨酸氧化酶的多核苷酸序列可与SEQ ID.N0 :24的 多核苷酸杂交，或"严格条件"下与从所述SEQ ID. N0 :24的多核苷酸制备的探针杂交，并 且可为编码正常功能的L-天冬氨酸氧化酶的变体修饰的多核苷酸序列。本文所述的"严 格条件"是指允许多核苷酸之间的特异性杂交的条件，并且例如在Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al. , Editors,2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York,1989)或 Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. ,Editors,John ffiley&Sons,Inc. ,New York)中 有具体描述。例如，其描述，杂交是在65°C的杂交缓冲液（3. 5XSSC、0.02%聚蔗糖、0.02% 聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清白蛋白、2.5mM NaH2P04(pH 7)、0.5%SDS、2mMEDTA)中进 行。SSC是pH = 7的0. 15M氯化钠/0. 15M柠檬酸钠。杂交后，DNA被递送转移达到的膜在 室温用2X SSC清洁冲洗，然后在68°C用0. 1至0. 5X SSC/0. IX SDS再次清洁冲洗。
[0023] 本文所述的术语"其他氨基酸"是指除了在修饰之前最初位于氨基酸序列中的氨 基酸以外的其他氨基酸残基。具体地，本发明所述的其他氨基酸可以包括一种选自以下的 氨基酸：精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲 硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨 酸、但不包括赖氨酸。具体地，所述其他氨基酸可包括一种选自以下的氨基酸：精氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸。例如，所述其他氨基酸可包括精氨酸。
[0024] 本文所述的术语"第302位"是指从表示为SEQ ID N0 :1的氨基酸序列的甲硫氨 酸开始的氨基酸位置，这是由于所述氨基酸序列的甲硫氨酸被计数为第一个氨基酸残基。
[0025] 通常，L-天冬氨酸氧化酶的活性通过积聚在微生物中的烟酸或NAD调节，换言之， 它的反馈调节通过烟酸或NAD诱导。由烟酸或NAD导致的反馈调节（feedback regulation by nicotinic acid or NAD)可以在本发明的L-天冬氨酸氧化酶的变体中解除，这与普通 的L-天冬氨酸氧化酶不同。
[0026] 本发明的其他方面提供了具有编码L-天冬氨酸氧化酶变体的核苷酸序列的多核 苷酸。
[0027] 在本发明的一个实施方式中，多核苷酸可具有编码L-天冬氨酸氧化酶的变体的 核苷酸序列，所述L-天冬氨酸氧化酶的变体具有其中由SEQ ID N0:1所表示的氨基酸序列 中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。
[0028] 所述第302位氨基酸可包括一种选自以下的氨基酸：精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝 氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、 色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸。相应的，对应于第302位氨基酸 的核苷酸序列可以被适当取代。在【具体实施方式】中，在SEQIDN0 :24表示的核苷酸序列中 的第904位至第906位核苷酸可以被除AAG、AAA、TAA、TAG和TGA以外的任何核苷酸组合 适当取代。
[0029] 本发明的其它方面提供了包括可操作地连接至调控序列的上述多核苷酸的载体。
[0030] 所述多核苷酸可以具有在SEQ ID N0 :24表示的核苷酸序列中的第904位至第906 位核苷酸被适当取代的核苷酸序列。在【具体实施方式】中，所述多核苷酸可以具有在SEQ ID NO :24表示的核苷酸序列中的第904位至第906位核苷酸被除AAG、AAA、TAA、TAG和TGA以 外的任何核苷酸组合取代的核苷酸序列。该多核苷酸可以可操作地连接至调控序列。该调 控序列可调节L-天冬氨酸氧化酶的表达，并包括启动子、终止子或增强子。
[0031] 本发明的载体没有具体限制，并且可以是本领域中已知的任何载体。例如，该载体 可以是 pCR2. 1-T0P0 载体（Invitrogen，USA)或 pECCG117(KFCC-10673)，但不限于此。
[0032] 本发明的启动子可以是入PL启动子、trp启动子、lac启动子、17启动子、pPro启 动子、PCJ1启动子或pCJ7启动子（韩国专利10-0620092)。在【具体实施方式】中，所述启动 子可以为pCJl启动子，但不限于此。
[0033] 该启动子可以可操作地连接到编码基因的核苷酸序列。本文所述的术语"可操作 地连接"是指核酸表达调控序列（例如，启动子、信号序列、转录调控因子结合位点的阵列、 终止子或增强子）与其他核苷酸序列之间的功能性连接。因此，该调控序列可调节编码该 基因的核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0034] 本发明的另一个方面提供了包含上述多核苷酸的微生物，其中所述多核苷酸可以 包含编码在SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基 酸序列的核苷酸序列。
[0035] 在【具体实施方式】中，根据SEQ ID N0 :1的氨基酸序列中的第302位氨基酸，SEQ ID NO :24的部分核苷酸序列可以被取代。例如多核苷酸可包含在SEQ ID NO :24的核苷酸序 列中的第904位至第906位核苷酸被其他核苷酸取代的多核苷酸。
[0036] 所述多核苷酸可以通过随机突变或基因工程操作获得。其中的SEQIDN0:1的氨 基酸序列的一部分被部分取代的微生物可以通过获得的多核苷酸的转化来构建。
[0037] 本文所述的术语"转化"是指将基因导入宿主细胞中以在其中表达。转化的基因 可以是任何基因，例如，被插入到宿主细胞的染色体中的基因，或者宿主细胞的染色体中不 存在的基因，只要导入的基因是在宿主细胞内可表达的。该基因包含编码多肽的多核苷酸， 如DNA和RNA。例如，该基因可以表达盒的形式导入宿主细胞，所述表达盒是多核苷酸结构， 其包括所述基因的自我表达所需要的元素。通常，表达盒可以包括可操作地连接到基因的 启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。该表达盒可以是可自我复制的表 达载体形式。该基因也可以自身被导入宿主细胞或以多核苷酸结构的形式导入宿主细胞， 并且可操作地连接到宿主细胞中表达所需的序列。
[0038] 本文所述的术语"具有生产喹啉酸的能力的微生物"是指能够从培养基中的碳源 生产喹啉酸并积累喹啉酸的微生物。
[0039] 为提高生产喹啉酸的能力，需要微生物生产大量的喹啉酸，且生产的喹啉酸可累 积而不用于其他途径。因此，在本发明的一些实施方式中，可以通过去除或削弱涉及喹啉酸 的分解途径的喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性，或通过增强涉及喹啉酸的合成途径的喹啉 酸合成酶的表达或活性，或通过它们的组合，获得具有改善的生产喹啉酸的能力的微生物。
[0040] 在【具体实施方式】中，具有改善的生产喹啉酸的能力的微生物还可以被修饰以增强 喹啉酸合成酶的活性。具体地，喹啉酸合成酶的活性增强可以通过额外导入喹啉酸合成酶 以增加其在微生物中表达而实现。喹啉酸合成酶的活性增强也可以通过用强启动子替换微 生物中连接到喹啉酸合成酶的启动子来实现。此外，喹啉酸合成酶的活性增强可以通过增 加喹啉酸合成酶本身的活性来实现。
[0041] 在将异源喹啉酸合成酶导入的情况下，可以导入编码该酶的多核苷酸，以增加该 多核苷酸的表达。编码喹啉酸合成酶的多核苷酸可以表达于微生物的质粒中，或可被插入 到所述微生物的染色体中，并在其中表达。
[0042] 喹啉酸合成酶可以具有由SEQ ID N0 :29所表示的氨基酸序列，或者可以具有与 其同源的氨基酸序列。换言之，它不局限于此，因为取决于微生物物种或菌株，蛋白质的氨 基酸序列可能存在差异。它可以是具有下述氨基酸序列的突变体蛋白或人工变体，所述氨 基酸序列在由SEQ ID N0 :29所表示的氨基酸序列的一个或多个位置包含取代、删除、插 入或添加一个或多个氨基酸，只要它可以从亚氨基琥珀酸合成喹啉酸。编码该酶的基因 nadA的序列可以通过大肠杆菌的基因组序列（gi :GI :89109380)获得，该序列披露于文章 (MolSystBiol.，2006;2:2006.0007.，Epub 2006 年 2 月 21 日），或可从美国国家生物技术 信息中心（NCBI)的数据库或日本DNA数据库（DDBJ)获得。另外，编码本发明的氨基酸序 列的多核苷酸可包含编码具有表示为SEQ ID N0 :29的氨基酸序列、或与其同源性为80% 或更多的氨基酸序列、特别是90 %或更多的氨基酸序列、更具体地95 %或更多的氨基酸序 列、特别具体地97 %或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有与L-天冬氨 酸氧化酶类似的活性。最具体地，它可以是由SEQ ID N0 :26所表示的多核苷酸序列。
[0043] 喹啉酸合成酶具有从亚氨基琥珀酸合成喹啉酸的活性，如反应式2所示。
[0044]〈反应式2>
[0045] a -亚氨基琥珀酸+二羟基丙酮磷酸〈= > 喹啉酸+磷酸+2H20
[0046] 因此，编码该喹啉酸合成酶的基因的表达增强或这种酶的活性增强时，喹啉酸在 细胞中的产率会增加。
[0047] 在一些实施方式中，在具有生产喹啉酸能力的微生物中，天冬氨酸氧化酶和喹啉 酸合成酶的活性可以通过用强启动子取代内源性启动子增强，或通过诱导启动子的突变 增强，或通过增加基因的拷贝数增强。对于强启动子的取代，可以使用通常已知的强启动 子，其包括 pTac、pTrc、pPro、pR、pL、pCJl、pCysK 等。
[0048] 在【具体实施方式】中，提供了具有改善的生产喹啉酸的能力的微生物，其中，喹啉酸 磷酸核糖基转移酶的活性可以额外降低或消除。
[0049] 喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性可通过修饰编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基 因，或通过使用抑制转录的microRNA被降低或去除。
[0050] 喹啉酸磷酸核糖基转移酶可具有由SEQ ID N0 :30所表示的氨基酸序列或与其高 度同源的氨基酸序列。换言之，它不局限于此，因为取决于微生物物种或菌株，蛋白质的氨 基酸序列可能存在差异。它可以是具有下述氨基酸序列的突变体蛋白或人工变体，所述氨 基酸序列在由SEQ ID N0 :30所表示的氨基酸序列的一个或多个位置包含取代、删除、插入 或添加一个或几个氨基酸，只要它可以从喹啉酸合成烟酸单核苷酸。
[0051] 喹啉酸磷酸核糖基转移酶可具有从喹啉酸合成烟酸单核苷酸的活性，如反应式3 所示。因此，通过删除具有合成烟酸单核苷酸的活性的基因或通过削弱该基因活性，喹啉酸 在细胞的产率可以增加。
[0052]〈反应式3>
[0053] 5-磷酸基-a -D-核糖-1-二磷酸+喹啉酸+2H+〈 = >C02+二磷酸+烟酸核糖核 苷酸
[0054] 可以通过将编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的内源基因取代为修饰的基因以降低 或去除酶的活性，或通过用弱启动子取代内源性基因的启动子，或者通过从染色体上删除 编码酶的内源基因，从而降低或去除喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性。
[0055] 在【具体实施方式】中，在具有改善的生产喹啉酸的能力的微生物中，喹啉酸磷酸核 糖基转移酶将喹啉酸转化为烟酸单核苷酸的活性可以被去除。为此，编码喹啉酸磷酸核糖 基转移酶的nadC基因可以从该微生物的基因组中通过同源重组删除。所述基因nadC的序 列可以通过大肠杆菌的基因组序列（gi :GI :89109380)获得，该序列披露于文章（Mol Syst Biol.，2006 ;2 :2006. 0007.，Epub 2006年2月21日），或可从美国国家生物技术信息中心 (NCBI)的数据库或日本DNA数据库（DDBJ)获得。另外，编码本发明的氨基酸序列的多核苷 酸可包含编码具有表示为SEQ ID N0 :30的氨基酸序列、或与其同源性为80%或更多的氨 基酸序列、特别是90 %或更多的氨基酸序列、更具体地95 %或更多的氨基酸序列、特别具 体地97 %或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有与L-天冬氨酸氧化酶 类似的活性。最具体地，它可以是由SEQ ID N0 :25所表示的多核苷酸序列。
[0056] 在【具体实施方式】中，具有生产喹啉酸能力的微生物可以是原核微生物或真核微生 物。
[0057] 在一些实施方式中，具有生产喹啉酸的能力的微生物的实例可以属于以下：肠杆 菌属（Enterbacter)、埃希杆菌属（Escherichia)、欧文氏菌属（Erwinia)、沙雷氏杆菌属 (Serratia)、普罗维登斯菌属（Providencia)、棒状杆菌属（Corynebacterium)和短杆菌属 (Brevibacterium)，但不限于此。
[0058] 在【具体实施方式】中，具有生产喹啉酸能力的微生物可属于埃希杆菌属 (Escherichia)〇
[0059] 具体地，具有生产喹啉酸能力的微生物可以是大肠杆菌（E.coli)。
[0060] 本发明的其他方面提供了生产喹啉酸的方法，其包括：培养含有编码其中SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的L-天冬氨酸氧化酶的多 核苷酸的微生物；并从培养溶液中回收喹啉酸。
[0061]微生物的培养可使用合适的培养基在本领域熟知的合适的培养条件下进行。这 样的培养方法，可以被本领域普通技术人员使用，并且可根据所选择的微生物容易地调 整。培养方法可包括分批培养型、连续培养型和加料分批培养型，但并不限于此。培养方 法的多种实例公开在，例如，"Biochemical Engineering"（James M. Lee，Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)〇
[0062]在培养过程中使用的培养基应满足针对所选择的微生物的适当的条件。各种微生 物培养基被公开在，例如，"Manual of Methods for General Bacteriology (the American Society for Bacteriology，Washington D.C.，U.S. A，1981)"。例如，培养基中可包含多种 碳源、氮源和微量元素。
[0063]可用于培养基的碳源的实例可包括碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽 糖和淀粉；油和脂肪，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚 油酸；醇，如乙二醇和乙醇；和有机酸，如乙酸，它们可以单独使用或组合使用，但并不局限 于此。
[0064]可用于培养基的氮源的实例可包括有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取 物、麦芽提取物、玉米浆（CSL)、大豆粉和尿素；以及无机氮源，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、 碳酸铵和硝酸铵，它们可以单独使用或组合使用，但并不限于此。
[0065]可用于该培养基的磷源的实例可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。 在一些实施方式中，培养基还可以包括金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。在一些实施方式中，除 了上面列出的组分，培养基还可以包括氨基酸、维生素和适当的前体。可以以分批或连续的 方式，向培养溶液中添加用于培养微生物的培养基或单个组分。
[0066] 在一些实施方式中，在培养过程中，培养溶液的pH可以通过以适当的方式加入化 合物调整，例如，氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸或硫酸。另外，在培养过程中，可以使用如 脂肪酸的消泡剂（例如，聚乙二醇酯）抑制培养溶液形成泡沫。为了保持培养溶液在需氧 条件下，氧或含氧气体（例如空气）可被供给到培养溶液中。培养溶液的温度可以维持在 约20°C至约45°C的温度范围内，特别是约25°C至约40°C。可以持续培养，直到得到目标量 的喹啉，具体地，时间可为约10小时至160小时。
[0067]本发明的另一个方面提供了制备烟酸的方法，其包括：培养含有编码其中SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的L-天冬氨酸氧化酶的多 核苷酸的微生物；并通过添加酸至培养的产物进行脱羧反应。
[0068] 本文所述的术语"脱羧反应"指的是通过从喹啉酸除去羧基并释放二氧化碳的反 应以产生烟酸。
[0069]特别地，培养微生物后，所得到的含有喹啉酸的培养溶液可以进行离心或膜过滤 以除去微生物。然后，为了加速脱羧反应，提供氢基的酸可以被添加至含有喹啉酸的培养溶 液。可使用任何酸而没有限制，只要它能够提供氢基至培养溶液中。
[0070]在一个实施方式中，含有喹啉酸的培养溶液可以无需纯化即使用。
[0071] 在一个实施方式中，被添加到培养溶液中的酸可以是盐酸或硫酸。
[0072] 在一个实施方式中，在加入酸后，培养溶液可以具有为约5或更低的pH值，或具体 地可在约2至约3的范围。
[0073] 在一个实施方式中，培养溶液的脱羧反应可以在约KKTC至约150°C的温度下进 行，或具体地可以在约120°C至约135°C的范围。
[0074] 在一个实施方式中，培养溶液的脱羧反应可以在约0. IMPa至约0. 5MPa的压力下 进行，或具体地可以在约〇.2Mpa至约0. 4Mpa的压力下进行。
[0075] 在向含有喹啉酸的培养溶液中加入酸后，紧接着在高温和高压的条件下进行脱羧 约1小时至3小时，在培养溶液中的喹啉酸可转化成烟酸，如反应式4所示。
[0076]〈反应式4>
[0077]喹啉酸+2H+〈=>C02+烟酸
[0078] 在一个实施方式中，生产烟酸的方法还可以包括回收和纯化烟酸。
[0079] 在一个实施方式中，烟酸的回收可以通过本领域中通常已知的方法进行，包括培 养溶液的过滤和结晶方法。
[0080] 有益效果
[0081] 根据本发明的实施方式，通过培养包含L-天冬氨酸氧化酶（其中由烟酸或NAD导 致的反馈调节被解除）变体的微生物，有效生产喹啉酸。这些使用微生物的方法可以解决 传统化学合成方法的问题，该问题是关于由于生成催化剂副产物、高能量消耗和使用不可 再生的资源产生的环境问题，以及传统生物合成方法产率低的问题。因此，这些方法可以有 效地以环境友好的方式生产喹啉酸和烟酸。

【专利附图】

【附图说明】
[0082] 附图1示例了在根据本发明的实施方式生产烟酸的方法中，生产烟酸的途径。
[0083]发明方法
[0084] 本发明将参照下面的实施例进行进一步详细说明。这些实施例仅用于说明目的， 并不意欲限制本发明的范围。
[0085] 实施例1.制备解除NAD反馈调节的L-天冬氨酸氧化酶变体
[0086] 〈1_1>构建表达L-天冬氨酸氧化酶的质粒
[0087] 为制备L-天冬氨酸氧化酶变体，将编码野生型L-天冬氨酸氧化酶的源自大肠杆 菌的nadB基因克隆至表达载体中。为此目的，大肠杆菌K12 W3110菌株的染色体被用作模 板。该菌株购自 American Type Culture Collection(ATCC No. 23257)。基于获自美国国 立卫生研究院的GenBank(NIH GenBank)的由SEQ ID NO :24表示的nadB基因的核苷酸 序列（NCBI登记号"GI :89109380"），构建具有限制酶Ndel和BamHI的识别位点的SEQ ID NO :2和3的引物，以扩增nadB基因的0RF区域，用于基因克隆。
[0088][表1]
[0089]

【权利要求】
1. L-天冬氨酸氧化酶变体，其具有在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中的第302位氨 基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列。
2. 权利要求1的L-天冬氨酸氧化酶变体，其中所述其它氨基酸选自：精氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸。
3. 权利要求1的L-天冬氨酸氧化酶变体，其中了由烟酸或NAD导致的反馈调节被解 除。
4. 多核苷酸，其包含下述的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在SEQ ID NO :1所示的 氨基酸序列中的第302位氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列。
5. 载体，其包含与调控序列可操作地连接的权利要求4的多核苷酸。
6. 包含权利要求4的多核苷酸的微生物。
7. 权利要求6的微生物，其中该微生物属于埃希杆菌属（Escherichia)。
8. 权利要求6的微生物，其中喹啉酸合成酶的活性是增强的。
9. 权利要求6的微生物，其中内源性喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性是降低的。
10. 生产喹啉酸的方法，该方法包括： 在培养基中培养权利要求6的微生物；和 从所述培养基中回收喹啉酸。
11. 生产烟酸的方法，该方法包括： 在培养基中培养权利要求6的微生物；和 通过向所述培养基中添加酸，进行脱羧反应。
【文档编号】C12R1/185GK104450638SQ201410588148
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2013年7月25日
【发明者】金素影, 申容旭, 许仁庚, 金朱恩, 罗光镐, 徐昌一, 孙晟光, 李在熙 申请人:Cj第一制糖株式会社