一种用于检测pdgfra基因热点突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测PDGFRA基因突变的引物、探针、锁核酸探针、试剂盒及检测方法，属于生物【技术领域】。所述引物和探针，所述引物和所述探针包括用于检测所述PDGFRA基因的第12号外显子和第18号外显子中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物。所述试剂盒包括：上述引物和探针。本发明提供的引物和探针能够高灵敏地检测出PDGFRA基因是否发生突变，同时，采用锁核酸探针可以大大提高了检测PDGFRA基因突变的灵敏度，采用本发明提供的试剂盒能够准确检测PDGFRA基因是否突变。
【专利说明】-种用于检测PDGFRA基因热点突变的引物、探针、锁核苷 酸探针、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种用于检测roGFRA基因突变的引物、探 针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 血小板源性生长因子受体a多肤（platelet-derivedgrowthfactorreceptor alpha，H)GFRA)是一种单链跨膜蛋白，属III型酪氨酸蛋白激酶家族。最常见的H)GFRA突 变位点是编码位于第二酪氨酸激酶区活化环的区域（exonlS)，少数突变发生在近膜区 (exonl2)，突变引起TOGFRA蛋白的功能改变，通常会导致非配体依赖性的二聚体形成、酪 氨酸残基自主磷酸化及下游信号的激活。这种激活导致的最终结果是肿瘤的发生。
[0003] 现有的检测F^GFRA基因突变的方法有Sanger测序法，但采用Sanger测序法检测 TOGFRA基因突变时，其检测灵敏度低，不能准确检测出TOGFRA基因是否发生突变，使用者 迫切需要一种高灵敏度的检测方法替换Sanger测序法。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中检测roGFRA基因突变的方法的灵敏度低的问题，本发明实 施例提供了一种用于检测TOGFRA基因突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方 法。所述技术方案如下：
[0005] -方面，本发明实施例提供了一种用于检测TOGFRA基因突变的引物和探针，所述 用于检测TOGFRA基因突变的引物和探针包括用于检测所述TOGFRA基因的第12号外显子 的引物和探针、以及用于检测所述TOGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一 种，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，
[0006] TOGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0007] TOGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示；
[0008] TOGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQIDNO. 3所示；
[0009] TOGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 4所示；
[0010] TOGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 5所示；
[0011] TOGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQIDNO. 6所示；
[0012] 所述探针的5'端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3'端均连接有BHQ淬灭基 团。
[0013] 另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测roGFRA基因突变的锁核酸探针，所 述锁核酸探针包括：
[0014] roGFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQID NO. 7所示；
[0015] TOGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQID NO. 8所示；
[0016] 所述锁核酸探针的3'端均连接有PCM基团。
[0017] 再一方面，本发明实施例提供了一种用于检测TOGFRA基因突变的试剂盒，所述试 剂盒包括：上述的引物和探针。
[0018] 具体地，所述试剂盒还包括：如权利要求2所述的锁核酸探针。
[0019] 具体地，所述试剂盒还包括：PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、测序反应液、 消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。
[0020] 具体地，所述PCR反应液包括：含Mg2+的5XPCR缓冲液5iil、2. 5mmol/LdNTPs 1. 5ii1、5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2ii1。
[0021] 具体地，所述消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0022] 具体地，所述测序反应液包括：3iimol/L所述TOGFRA基因第12号外显子的正向 弓丨物1111、311111〇1/1所述？06?狀基因第18号外显子的正向引物1111、0.31115\81 8(^ 和 0? 45ii1 2. 5XBuffer。
[0023] 具体地，所述测序PCR产物纯化试剂包括0. 75mol/LNaCl和纳米磁珠。
[0024] 又一方面，本发明实施例提供了一种检测TOGFRA基因突变的方法，采用上述的试 剂盒，所述方法包括：
[0025] 提取样本的基因组DNA;
[0026] 以获得的所述基因组DNA作为所述模板DNA，采用所述试剂盒进行PCR扩增反应， 得到PCR扩增产物；
[0027] 对所述PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR扩增产物；
[0028] 将所述纯化的PCR扩增产物作为模板，进行测序PCR扩增，得到测序PCR扩增产 物；
[0029] 将所述测序PCR扩增产物进行纯化；
[0030] 将纯化后的所述测序PCR扩增产物测序分析，并与所述TOGFRA基因对应的野生型 进行测序分析对比，判定所述样本中的所述TOGFRA基因是否发生突变。
[0031] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的引物和探 针能够高灵敏地检测出TOGFRA基因是否发生突变，同时，锁核酸（Lockednucleicacid， LNA)是一种人工合成的反义寡核苷酸，其结构中0 -D-呋喃核糖的2' -0,4' -C位通过不同 的缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥刚性缩合结构，环形桥锁定 了呋喃糖C3' -内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳 定性，因此对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解。将锁核酸作为探 针与RNA/DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错 配可使RNA/DNA的熔解温度（Tm值）较大幅度地下降，采用锁核酸探针可以大大提高了检 测TOGFRA基因突变的灵敏度。本发明提供的试剂盒包括本发明实施例提供的引物、探针以 及锁核酸探针，使得本发明实施例提供的试剂盒具有高灵敏度。本发明实施例提供的检测 方法，能够准确检测TOGFRA基因是否突变，同时，对待测样本的基因片段采用荧光PCR进行 扩增，扩增情况可以通过扩增曲线和Ct值判断，通过加入锁核酸探针，在PCR过程中对突变 型样本进行富集，能显著提高突变型的检测灵敏度。PCR扩增产物采用碱性磷酸酶和核酸外 切酶进行消化，这能有效去除PCR扩增产物中残留的dNTP、引物和单链DNA等，省去了凝胶 电泳的步骤，不但节省了时间还避免了污染，此外，本发明实施例采用磁珠法对测序PCR产 物进行纯化，与传统的乙醇/醋酸钠法相比操作简单快捷、对设备要求简单（只需一个磁力 架）、纯化结果稳定，得到的测序峰图干净清晰、无染料峰。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0033] 图1是本发明实施例四提供的TOGFRA基因第12号外显子V561D突变型的测序峰 图；
[0034] 图2是本发明实施例四提供的TOGFRA基因第18号外显子D842V突变型的测序峰 图；
[0035] 图3是本发明实施例四提供的加入了锁核酸探针后检测TOGFRA基因18号外显子 的测序峰图；
[0036] 图4是本发明实施例四提供的未加入锁核酸探针后检测TOGFRA基因18号外显子 的测序峰图；
[0037] 图5是本发明实施例四提供的扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0038] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一 步地详细描述。
[0039] 实施例一
[0040] 本发明实施例提供一种用于检测TOGFRA基因突变的引物和探针，用于检测 TOGFRA基因突变的引物和探针包括用于检测TOGFRA基因的第12号外显子的引物和探针、 以及用于检测TOGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一种，该引物包括：正向 引物和反向引物，其中，
[0041] TOGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0042] TOGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示；
[0043] TOGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQIDNO. 3所示；
[0044] TOGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 4所示；
[0045] TOGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 5所示；
[0046] TOGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQIDNO. 6所示；
[0047] 探针的5'端均连接有FAM荧光基团，探针的3'端均连接有BHQ淬灭基团。
[0048] 本发明实施例提供的引物和探针具有高灵敏度，能够准确检测TOGFRA基因是否 发生突变。
[0049] 实施例二
[0050] 本发明实施例提供了一种用于检测TOGFRA基因突变的锁核酸探针，改锁核酸探 针包括：
[0051] H)GFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQID NO. 7所示；
[0052] TOGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQID NO. 8所示；
[0053] 锁核酸探针的3'端均连接有P04基团。
[0054] 本发明实施例提供的用于检测TOGFRA基因突变的锁核酸探针，锁核酸（Locked NucleicAcid，LNA)是一种人工合成的反义寡核苷酸，其结构中P-D-呋喃核糖的2'-0， 4'-C位通过不同的缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥刚性缩合结 构，环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架 局部结构的稳定性，因此，锁核酸对DNA和RNA均具有很好的识别能力和强大的亲和力，且 不易被酶解，将锁核酸作为探针与RNA/DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对 碱基错配敏感，一个碱基的错配可使RNA/DNA的熔解温度（Tm值）较大幅度地下降，通过加 入锁核酸探针，在PCR过程中对突变型样本进行富集，进一步提高突变型的检测灵敏度，采 用锁核酸探针可以大大提高检测TOGFRA基因突变的灵敏度，同时，PDGFRA基因检测的样本 多来源于胃肠道间质瘤的病变细胞组织，该组织中往往含有正常细胞，影响检测，本发明实 施例采用与野生型基因序列匹配的锁核酸，在进行PCR扩增时，锁核酸能够与野生型序列 结合，从而阻滞PCR延伸，导致PCR扩增失败，而锁核酸不能与突变型序列结合，使得TOGFRA 基因突变型得到扩增，从而提高了TOGFRA基因突变的检出率。
[0055] 实施例三
[0056] 本发明实施例提供一种用于检测TOGFRA基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：本发 明实施例一提供的引物和探针、本发明实施例二提供的锁核酸探针、PCR反应液、阳性质控 品、阴性质控品、测序反应液、消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。
[0057] 具体地，在试剂盒中，10iimol/L正向引物各0? 75iil，10iimol/L反向引物各 0? 75iil，10iimol/L探针各 0? 5iil，10iimol/L锁核酸探针各 0? 5ill。
[0058] 具体地，PCR反应液包括：含Mg2+的5XPCR缓冲液5iU、2. 5mmol/L dNTPsl. 5ii1、5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2ii1。
[0059] 具体地，消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸外切酶I，且碱性磷酸酶和核酸外切酶 I的酶活力比为2:5。
[0060] 具体地，测序反应液包括：3iimol/LTOGFRA基因第12号外显子的正向引物liil、 3iimol/LPDGFRA基因第 18 号外显子的正向引物liil、0.3iil5XBigdye和 0.45iil 2. 5XBuffer。该测序反应液用于检测PCR扩增产物。
[0061] 具体地，测序PCR产物纯化试剂包括0. 75MNaCl和纳米磁珠。
[0062] 具体地，阴性质控品为含TOGFRA野生型基因片段的重组质粒。
[0063] 具体地，阳性质控品为含有TOGFRA突变型基因片段的重组质粒。
[0064] 本发明提供的用于检测TOGFRA基因突变的试剂盒，本发明提供的试剂盒包括本 发明实施例提供的引物、探针以及锁核酸探针，使得该试剂盒能够准确检测TOGFRA基因是 否发生突变，通过加入锁核酸探针，在PCR过程中对突变型样本进行富集，进一步提高突变 型的检测灵敏度。
[0065] 实施例四
[0066] 本发明实施例提供一种检测H)GFRA基因突变的方法，采用本发明实施例三提供 的试剂盒，具体检测方法如下：
[0067] 1、提取样本的基因组DNA
[0068] 样本收集：用石蜡包埋病理切片组织，且该切片中含有胃肠道间质瘤的病变细 胞，为了保证病理切片组织含有足够比例的胃肠道间质瘤的病变细胞，需要加同一组织的HE(Hematoxylin-Eosin)染色片子一张（在显微镜下肿瘤细胞的比例> 70% )。选用石錯 DNA提取试剂盒QIAGENQIAampDNAFFPETissueKit(CatN0. 56404)，对新鲜组织按照石 蜡样本提取步骤进行，但无需加入二甲苯处理步骤，操作步骤详见该石蜡DNA提取试剂盒 说明书，提取的样本的基因组DNA采用紫外分光光度计测定浓度及质量，测量0D260/0D280 结果在1. 8?2. 0之间，提取的样本的基因组DNA浓度在20ng/iil以上。
[0069] 其中，病理切片组织来源于胃肠道间质瘤患者的病变组织，经脱水处理后用石蜡 包埋，切片后作为待检样本（该胃肠道间质瘤患者的病变组织的TOGFRA基因的第12号外 显子和第18号外显子均发生了突变）。
[0070] 样本用量：每例石蜡包埋病理切片切5张，每张切片的厚度为8?10iim，胃肠道 间质瘤的病变细胞的区域大于5_X5mm，连续切片，封存于1. 5ml离心管中。
[0071] 样本质量：为确保样本的基因组DNA提取的成功率，选择1年以内的石蜡标本。
[0072] 2、PCR扩增
[0073] 准备2个PCR反应管，用微量加样器在每一个PCR反应管内加入引物、探针、锁 核酸探针和PCR反应液，其中，10ymol/L正向引物各0? 75iil，10iimol/L反向引物各 0. 75iil，10iimol/L探针各0. 5iil，10iimol/L锁核酸探针各0. 5iil，PCR反应液包括：含 Mg2+的 5XPCR缓冲液 5ii1、2. 5mmol/LdNTPs1. 5ii1、5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2iil，补水至23iU，其中，2个PCR反应管分别对应TOGFRA基因的第12号外 显子和第18号外显子，再向PCR反应管中加入提取的样本的基因组DNA、阴性质控品和阳 性质控品各2iil，盖紧PCR反应管，经5000rpm离心数秒，得到上清液，取该上清液进行PCR 扩增反应。
[0074] 在荧光PCR仪上设置以下程序：
[0075]
【权利要求】
1. 一种用于检测H)GFRA基因突变的引物和探针，其特征在于，所述用于检测TOGFRA基 因突变的引物和探针包括用于检测所述TOGFRA基因的第12号外显子的引物和探针、以及 用于检测所述TOGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正 向引物和反向引物，其中， PDGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； PDGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； PDGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示； PDGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 4所示； PDGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 5所示； PDGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO. 6所示； 所述探针的5'端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3'端均连接有BHQ淬灭基团。
2. -种用于检测TOGFRA基因突变的锁核酸探针，其特征在于，所述锁核酸探针包括： TOGFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO. 7 所示； TOGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO. 8 所示； 所述锁核酸探针的3'端均连接有P04基团。
3. -种用于检测TOGFRA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要 求1所述的引物和探针。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：如权利要求2所述 的锁核酸探针。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR反应液、阳性质 控品、阴性质控品、测序反应液、消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：含Mg2+的5XPCR 缓冲液 5iil、2.5mmol/L dNTPs 1.5iil、5U/iil Taq 酶 0.2iil 和 20ng/iil 的模板 DNA 2 y l〇
7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸 外切酶I。
8. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述测序反应液包括：3 y mol/L所述 TOGFRA基因第12号外显子的正向引物liil、3iimol/L所述TOGFRA基因第18号外显子的 正向引物1以1、0.31115\818(^6和0.451112.5\811打61'。
9. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述测序PCR产物纯化试剂包括 0. 75mol/L NaCl和纳米磁珠。
10. -种检测TOGFRA基因突变的方法，采用权利要求3-9任一项所述的试剂盒，其特征 在于，所述方法包括： 提取样本的基因组DNA ; 以获得的所述基因组DNA作为所述模板DNA，采用所述试剂盒进行PCR扩增反应，得到 PCR扩增产物； 对所述PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR扩增产物； 将所述纯化的PCR扩增产物作为模板，进行测序PCR扩增，得到测序PCR扩增产物； 将所述测序PCR扩增产物进行纯化； 将纯化后的所述测序PCR扩增产物测序分析，并与所述TOGFRA基因对应的野生型进行 对比，判定所述样本中的所述TOGFRA基因是否发生突变。
【文档编号】C12N15/11GK104328182SQ201410604371
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】林佳, 李品, 霍然, 唐景峰 申请人:武汉百泰基因工程有限公司