一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测拟盐皮质激素增多症相关基因的产品，该试剂盒包括：A.独特设计并制备捕获探针，针对基因HSD11B2全部外显子片段；B.设计独特带有标签序列的接头；C.通用引物对探针序列进行PCR扩增；D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便，极大地降低了测序检验成本。
【专利说明】一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种检测拟盐皮质 激素增多症相关基因突变的体外诊断试剂盒，是一种应用于新一代测序平台技术的一种拟 盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒。 技术背景
[0002] 拟盐皮质激素增多症（Apparent mineralocorticoid excess，ΑΜΕ)AME 患者体内 并不存在盐皮质激素过多，恰恰相反，这类患者血压异常升高的原因是糖皮质激素过多，主 要是皮质醇增多所致。
[0003] 人体盐皮质激素受体和糖皮质激素受体同源性高达94%。体外实验证明，糖皮质 激素和盐皮质激素对醛固酮受体具有同样的亲和性。考虑到血中糖皮质激素浓度远远高于 盐皮质激素，因此体内必然存在一种机制以保证盐皮质激素和其受体特异结合，这种机制 便是 11 β -轻固醇脱氧酶（11 β -hydroxysteroid dehydrogenase，11 β -HSD)对皮质醇的 灭活作用。
[0004] 11 β-HSD有两种异构体，11 β-HSD I主要存在于肝脏，11 β-HSD II主要存在于肾 脏和胎盘。AME是由于11 β-HSD II缺陷造成的。已报道的11 β-HSD II基因突变多达十 几种，分别位于第3、4、5外显子和内含子3。
[0005] HSD11B2基因位于16q22,该基因发生突变可导致11 β -HSD II酶无活性或活性 降低，大量皮质醇不能被转化成皮质酮，大量蓄积的皮质醇占据远端肾小管的盐皮质激 素受体，激活转录因子及血清糖皮质类固醇激酶，使泛素连酶Nedd4-2磷酸化，磷酸化的 Nedd4-2不能与ENaC结合进而灭活ENaC，导致ENaC活性升高，钠重吸收增加，出现类似醛 固酮增高的临床表现-高血压和低血钾，即称类盐皮质激素增多症（AME)。HSD11B2基因突 变不仅导致基因表达降低或对底物的亲和力降低，也可导致11 β-HSD II蛋白酶的稳定性 降低，半衰期显著缩短。
[0006] 拟盐皮质激素增多症是一种常染色体隐性遗传性疾病，可导致高血压和低血钾， 糖皮质激素治疗有效。该病是由于HSD11B2基因突变所致，该基因可编码肾2型11 β羟 固醇脱氢酶同工酶。正常情况下，该酶可将血循环中的皮质醇灭活为较低活性的代谢产物 皮质酮，而基因的失活性突变可导致肾皮质醇浓度升高。皮质醇浓度较高时可激活盐皮 质激素受体，从而产生类醛固酮效应，出现低钾血症、高血压和高钠血症等。其他疾病，如 Liddle综合征，也可表现出拟盐皮质激素增多症的相似症状，可通过计算尿游离皮质醇/ 尿游离皮质酮比值做出诊断，由于拟盐皮质激素增多症患者的皮质酮水平降低，因此该值 较正常人偏高。另外，还可以通过患者对于留钾类利尿剂的反应对这两种综合征做鉴别诊 断，Liddle综合征的患者只对与上皮钠离子通道结合的利尿剂有效，而拟盐皮质激素增多 症的患者除了该类利尿剂，还可通过盐皮质激素受体结合剂被纠正。拟盐皮质激素增多症 极为罕见，目前世界范围内报道的病例不超过100例。 (原文： Apparent mineralocorticoid excess syndrome Apparentmineralocorticoidexcess (AME) isan autosomal recessive[1]disorder causing hypertension and hypokalemia(abnormally low levels of potassium). The condition responds to glucocorticoid treatment. It results from mutations in the HSD11B2 gene, which encodes the kidney isozyme of 11β -hydroxysteroid dehydrogenase type 2. In an unaffected individual, this isozyme inactivates circulating cortisol to the less-active metabolite cortisone. The inactivating mutation leads to elevated local concentrations of cortisol in the kidney. Cortisol at high concentrations can cross-react and activate the mineralocorticoid receptor (MR)， leading to aldosterone-like effects in the kidney. This is what causes the hypokalemia, hypertension, and hypernatremia associated with the syndrome. Other conditions such as Liddlei s Syndrome can mimic the clinical features of AMEj so diagnosis can be made by calculating the ratio of free urinary cortisol to free urinary cortisone. Since AME patients create less cortisone, the ratio will much be higher than non-affected patients. [2] Alternatively, one could differentiate between the two syndromes by administering a potassium-sparing diuretic. Patients with Liddlei s Syndrome syndrome will only respond to a diuretic that binds the ENaC channel, whereas those with AME will respond to a diuretic that binds to ENaC or the mineralcorticoid receptor. AME is exceedingly rare, with less than 100 cases recorded worldwide. [2] )
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[0010] 对于拟盐皮质激素增多症综合征的鉴别诊断传统的方法主要依靠生化检查和影 像学检查。这些手段存在很大的缺点：
[0011] 1.检查种类多；
[0012] 2.灵敏度和特异度低；
[0013] 3.易受药物和精神状况等因素的影响；
[0014] 4.检测时间要求苛刻；
[0015] 基因诊断的优势在于：
[0016] 1.方便，安全，快捷：仅抽取2-4毫升血；
[0017] 2.任何时间都可以检查；
[0018] 3.不限制饮食，服药，任何身体状况都可以检测；
[0019] 4.相比反复，多项传统检查，更为经济；
[0020] 5.发病前，疾病极早期诊断的唯一方式；
[0021] 6.源头确诊，一次检测，终身受益。
[0022] 这一切都揭示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。
[0023] 近年，大规模 DNA 平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了 以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的"特权"能够被众多研 究人员分享。
[0024] 但是直接使用大规模DNA平行测序平台检测的成本目前仍然令个人难以承受。本 发明可以同时把多个甚至几十病人的拟盐皮质激素增多症相关基因精确的选择性捕获，然 后用于大规模测序平台，可以极大地降低基因诊断的成本，使之广泛应用于临床成为可能。
【发明内容】
[0025] 本发明的目的是，提供一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的目标捕获再 测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本 低。
[0026] 为实现上述目的，本发明采用捕获目的HSD11B2基因全部外显子片段以及邻近 50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP ;高 保真聚合酶；链霉素磁珠。本发明采用的技术方案是：一种新的目标捕获再测序方法，包括 以下步骤：
[0027] A.设计并制备用于捕获拟盐皮质激素增多症相关基因突变的探针。并将这些探针 结合在磁珠、薄膜或者玻片上。探针序列见序列表。
[0028] B.将待测基因 DNA样品分别片段化至200-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使 片段两端引入粘性末端。
[0029] C.分别加入IIlumina公司Nextera? DNA Sample Prep Kit中设计好的一端带有 标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与的一对接头连接，形成新的片段。
[0030] D.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对Illumina公司Nextera? Index Kit-PCR primers通用引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR 扩增反应；
[0031] E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交， 然后经过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。
[0032] F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。
[0033] G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。
[0034] 为实现上述技术方案，步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸（DNA)，或是核糖核 酸（RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可以 是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。链霉素磁珠材质是铝镍 钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些 材质。
[0035] 其中，步骤A所述的捕获探针，包括覆盖基因 HSD11B2全部编码外显子片段和两 端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为50bp-180bp，最优为75bp ; 片段长度为60bp-200bp，最优为80bp ;片段长度为65bp-220bp，最优为85bp ;片段长度为 70bp-240bp，最优为90bp ;探针之间重叠部分为5-20bp，最优为8bp ;目标区碱基的探针覆 盖度为IX至IOX，最优为3X。
[0036] 本发明的主要优点在于：
[0037] 1.本发明可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部拟盐皮质激素 增多症相关基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99. 99%。
[0038] 2.本发明的试剂盒可以一次完成1-48个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大 地降低了样品准备的成本。
[0039] 3.本发明的试剂盒可以一次完成1-1152个样品的全部拟盐皮质激素增多症相关 基因，近4000条序列的平行检测，充分利用设备的高通量特性，极大降低了每个样品的测 序成本。
[0040] 4.本发明的试剂盒可以一次反应同时分辨错义、插入和缺失突变。大大增加了临 床检出率和准确性。
[0041] 5.本发明的检测方法步骤简单，减少重复操作的环节，因而避免了复杂操作过程 中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。
[0042] 6.本发明所提供的检测方法所需时间大大少于sanger法的测序技术.
[0043] 实例：在完成同样的检测量（100人份的检测量），sanger法需要2个人工同时工 作一周。我们的方法只需要一个人在一天内完成全部的检测量。
[0044] 7.检测的准确度大大优于基因芯片技术，更符合临床检测要求。基因芯片只能检 测碱基错义突变，而插入和缺失突变无法同时检测。我们的方法可以同时检测错义、插入、 缺失和可变剪切的基因突变。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图示为目标区域序列和探针。
【具体实施方式】
[0046] 下面用实施例仅是对本发明实际应用的举例描述，本发明的实际应用不仅限于以 下实施例：
[0047] 实施例一、
[0048] 一、探针设计：
[0049] 按表合成链霉素标记的探针。探针溶液采用agilent公司的SureSelect缓冲系 统体系。
[0050] 二、基因组提取：
[0051] 采用 Qiagen FlexiGene DNA Kit(Code No :51204)进行提取待测 96 份样本的基 因组， 〇〇26〇/280 值达到1. 8-2. 0,各取1-3 μ g做为起始模板。
[0052] 三、测序前样品制备
[0053] 1.目的基因片段化：
[0054] 取定量过的270份基因组DNA，稀释至20-35ng/ μ L。取130 μ L，用超声破碎仪分 别进行片段化。
[0055] 2. AMpure XP 片段化选择
[0056] 1.取96孔板，加入80-100 μ L磁珠后，再加入样品DNA，移液器反复吹打混匀；
[0057] 2.混合液 26°C 放置 5min ;
[0058] 3.将96孔板静置在磁板上3min ;
[0059] 4.小心移取全部上清至新的孔中，小心不要碰到磁环；
[0060] 5.再在移至新孔的上清中加入100-150 μ L磁珠，移液器反复吹打，充分混匀；
[0061] 6.混合液 26°C 放置 5min ;
[0062] 7.将96孔板静置在磁板上3min，小心移去上清；
[0063] 8.加入70%乙醇200 μ L，静置30s，小心移去上清；
[0064] 9.重复步骤8操作一次；
[0065] 10.将96孔板从磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分挥发；
[0066] 11.加入40 μ L IOmM pH = 8. 0 Tris-HCl，移液器反复吹打混匀；
[0067] 12.将96孔板静置在磁板上Imin，至溶液变清；
[0068] 13.小心移取上清至新的PCR管内，得到纯化后的基因组DNA。
[0069] 3.末端平齐和纯化
[0070] 1.取96孔板，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态。
[0071]
【权利要求】
1. 一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒，其包括：捕获目的HSD11B2 基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测 序接头序列；缓冲液；dNTP ;高保真聚合酶；链霉素磁珠。
2. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"，全部 探针在3'采用生物素修饰。
3. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"这种 探针是寡聚核糖核酸（RNA)，或寡聚脱氧核糖核酸（DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包 括生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。
4. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"的探 针是结合在磁珠上的，或结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。
5. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"的探 针针对目标区域以高密度叠瓦式设计，探针序列与HSD11B2为互补序列。
6. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"探针 长度在50-180bp，最优为75bp。
7. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"探针 长度在60-200bp，最优为80bp。
8. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"探针 长度在65-2200bp，最优为85bp。
9. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"探针 长度在70-240bp，最优为90bp。
10. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"探针 重叠部分适宜范围为5bp_20bp，最优为8bp。
11. 根据权利要求1所述"一种检测拟盐皮质激素增多症相关基因突变的试剂盒"链 霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶 磁，但不仅限于这些材质。
【文档编号】C12Q1/68GK104388552SQ201410613210
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】刘哲 申请人:百世诺（北京）医疗科技有限公司