一种棕榈疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种棕榈疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′-CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3′；BIP：5′-TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3′；F3：5′-GCGGAAGGGACTACACCT-3′；B3：5′-AACAACAACACCGAGGCC-3′；LF：5′-ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3′；LB：5′-GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-3′。
【专利说明】-种棕榈疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试 剂盒和LAMP检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种棕榈疫霉菌的LAMP检测引物组合物及 其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
【背景技术】
[0002] 棕榈疫霉菌（Phytophthora palmivora)是农业生产上的一种危害极为严重的病 原菌，能够侵染根、茎、叶、花以及果实等各个部位，在气候潮湿的条件下发病更为严重。。棕 榈疫霉菌属于卵菌门（Oomycota)、卵菌纲（Oomycetes)、霜霉目（Peronosporales)、腐霉科 (Pythiaceae)、疫霉属（Phytophthora)。棕榈疫霉引起的植物病害分布广泛，所以建立棕榈 疫霉的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意义。目前对该病害还没有 快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其 扩散方式。
[0003] 传统的棕榈疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特 征等。传统方法在棕榈疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备 专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，PCR技 术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大 的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4?5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。 其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
[0004] 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本 的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等 优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异 的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60?65°C范围80min内，大 量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程 依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下 进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP 反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立 14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植 物病原卵菌的检测报道很少，棕榈疫霉菌的检测国内外均未见报道。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中棕榈疫霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特 异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种棕榈疫霉菌的LAMP检测引物组合物。 本发明的另一目的是提供上述棕榈疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本发明还有一目的是提供 上述棕榈疫霉菌的LAMP检测方法。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种用于检测棕榈疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引 物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列 具体如下：
[0008] FIP -CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3 / ；
[0009] BIPiSi -TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3 / ；
[0010] F3:5，-GCGGAAGGGACTACACCT-3，；
[0011] B3 :5，-AACAACAACACCGAGGCC-3，；
[0012] LF:5, -ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3,;
[0013] LB : 5' -GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-3'
[0014] 所述的LAMP检测引物组合物在检测棕榈疫霉菌的中的应用。
[0015] 一种检测棕榈疫霉菌的LAMP检测试剂盒：包含ImL检测溶液，所述的检测溶液包 括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM 环引物 LF、8mM 环引物 LB、50mM dNTPs、0. 8M Tris-HC、0. 4mMKCl、0. 4mM(NH4) 2S04、0. 24mM MgS04、4% Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 单位，200mM 羟基萘酚蓝；其中，各引物 序列具体如下：
[0016] FIP -CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3 / ；
[0017] BIPiSi -TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3 / ；
[0018] F3:5，-GCGGAAGGGACTACACCT-3，；
[0019] B3:5，-AACAACAACACCGAGGCC-3，；
[0020] LF:5, -ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3,;
[0021] LB :5' -GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-Si。
[0022] 所述的检测棕榈疫霉菌的LAMP试剂盒在检测棕榈疫霉菌的中的应用。
[0023] -种检测棕榈疫霉菌的LAMP检测方法：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA 为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP ;扩增产物观察LAMP反应 溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在棕榈疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存 在棕榈疫霉菌。
[0024] 所述的检测棕榈疫霉菌的LAMP检测方法：提取待检微生物的DNA，取1 μ L DNA溶 液，加入23 μ LLAMP试剂盒中的检测溶液和1 μ L灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序 为：6(TC?65°C，50 ?70min。
[0025] 本发明的检测棕榈疫霉菌的方法，包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模 板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP ;轻基萘酚蓝（hydroxylnaphthol blue，HNB)属 于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以 通过监测LAMP反应体系中Mg 2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将 HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与LAMP反应的副产物P20 74_结合产 生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因 此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断棕榈疫霉菌的有无：天蓝色表示检测为阳 性，存在棕榈疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在棕榈疫霉菌。
[0026] 本发明的关键性技术之一是棕榈疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方 法。为了验证棕榈疫霉菌的特异性引物序列，本发明以6株棕榈疫霉菌菌株和13种其它卵 菌以及19种病原真菌为供试材料（表I)，采用CTAB法提取发病组织中棕榈疫霉菌的DNA。 具体方法如下：取少量菌丝粉，加900111^2%〇^8提取液和9(^1^10%303，漩涡混匀， 于55°C水浴Ih,中间每IOmin上下颠倒几次。12000rpm离心IOmin,取上清液加等体积酚 /氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，颠倒混勻，12000rpm离心IOmin ;将上清液转移至新管，加等体 积氯仿，轻轻颠倒混勻，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇 和 1/10 体积的 3M NaAc(pH 5. 2)，_20°C沉淀（>lh)。12000rpm 离心 IOmin,倾去上清，沉淀 用70 %乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE (pH 8.0)溶解沉淀（含20 μ g/ mL RNase)，37°C处理Ih后，-20°C保存备用。所有的土壤样品采用FaMDNAu SPIN试剂盒 (Q-Biogene Ltd, USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明书。这一商用 土壤微生物DNA提取试剂盒可以在0. 5h内提取到土壤中的微生物。
[0027] 当发生LAMP扩增反应时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上升， 通过HNB的显色反应结果所示，棕榈疫霉菌的反应管里均呈天蓝色，其为阳性结果，而其它 疫霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管均呈紫色，为阴性结果，证明所设计的LAMP特异性 引物具有种的特异性。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织及土壤中棕榈疫霉菌 的快速可靠的检测盒鉴定。当用于发病组织中存在棕榈疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提 取棕榈疫霉菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10 μ L 0. 5M NaOH,在研钵中充分研磨后转移至I. 5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5 μ L上清液加 入495μ L 0. ImM Tr is (pH 8.0)，混匀后取IyL直接用于PCR反应。每个反应至少重复三 次，同时为确定植株中无 PCR抑制物存在。
[0028] 表1用于检测棕榈疫霉菌特异性的真菌和卵菌菌株
[0029]
【权利要求】
1. 一种用于检测棕榈疫霉菌的LAMP引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向 内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物 序列具体如下： FIP -CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3/ ； BIP:5' -TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3'; F3:5， -GCGGAAGGGACTACACCT-3，； B3:5， -AACAACAACACCGAGGCC-3,; LF:5, -ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3,; LB:5' -GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-3'。
2. 权利要求I所述的LAMP引物组合物在检测棕榈疫霉菌中的应用。
3. -种检测棕榈疫霉菌的LAMP试剂盒，其特征在于：包含ImL检测溶液，所述的检测 溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物 B3、8mM 环引物 LF、8mM 环引物 LB、50mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM (NH4)2S04、 0.24mM MgS04、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 单位，200mM 羟基萘酚蓝；其中， 各引物序列具体如下： FIP -CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3/ ； BIP:5' -TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3'; 卩3:5' -GCGGAAGGGACTACACCT-3，； B3:5, -AACAACAACACCGAGGCC-3,; LF:5, -ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3,; LB:5' -GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-3'。
4. 权利要求3所述的检测棕榈疫霉菌的LAMP试剂盒在检测棕榈疫霉菌中的应用。
5. -种检测棕榈疫霉菌的方法，其特征在于：包括提取待检微生物的DNA，以提取的 DNA为模板，利用LAMP引物组合物或LAMP试剂盒进行LAMP ;观察LAMP反应溶液颜色变化， 天蓝色表示检测为阳性，存在棕榈疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在棕榈疫霉菌。
6. 根据权利要求5所述的检测棕榈疫霉菌的方法，其特征在于：提取待检微生物的 DNA，取2 ii L DNA溶液，加入23 ii L LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序 为：60°C?65°C，50-70min，扩增产物进行颜色变化的观察。
【文档编号】C12N15/11GK104313176SQ201410643035
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】戴婷婷, 吴小芹, 康振烨 申请人:南京林业大学