一种木香疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种木香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好，在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到P.tentaculata，不需要复杂仪器，能较好满足对P.tentaculata的现场检测，为P.tentaculataa的检测提供了新的技术平台，可用于P.tentaculata的高灵敏度快速检测，同时也可用于发病田块中疫病的早期诊断和病菌的监测。
【专利说明】-种木香疫霉的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂 盒和LAMP检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种木香疫霉菌（Phytophthora tentaculata)的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
【背景技术】
[0002] 木香疫霉菌（P. tentaculata)于1993年首次在德国苗圃中呈现根腐和莖腐的菊 花上分离到，随后又在马鞭草和绵杉菊上也发现了该病原物。2007年，在我国的云南昆明， 在木香上也分离到了该病原物，这是我国首次报道P. tentaculata。根据目前已有的资料分 析，该病原物主要引起菊科植物的根腐和茎腐，对园艺作物的生产具有较大的危害。云南一 直是我国鲜花和园艺植物的主要供应省份，如何制订有效的防治措施以防止该疫霉种随带 菌苗木、花草等向其它地区的迁移是一个需要引起重视的问题。为了阻止P. tentaculata 传播范围的不断扩大，使P. tentaculata引起的疫霉根腐病得到控制，需要对其进行快速、 准确地检测。
[0003] 传统的P. tentaculata的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生 化特征等。传统方法在P. tentaculata检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操 作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发 展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，虽然PCR法在特异性和敏感性 上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4?5h，同时PCR方法依赖精密的温度循 环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
[0004] 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种 新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的 新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合 酶的作用下引起自循环链置换反应，60?65°C范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴 随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立 区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳 定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经 济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广 泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道 很少，P. tentaculata的检测国内外均未见报道。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中木香疫霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特 异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种木香疫霉菌的LAMP检测引物组合物。 本发明的另一目的是提供上述木香疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本发明还有一目的是提供 上述木香疫霉菌的LAMP检测方法。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种用于检测木香疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引 物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：
[0008] FIP -ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3 / ；
[0009] BIP:5, -TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3,;
[0010] F3:5，-TGCCTTATAGGAATAGCGC-3，；
[0011] B3 :5，-AGCATAAGTGAATTGACCCA-3，；
[0012] LBji -CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3，。
[0013] 所述的LAMP检测引物组合物在检测P. tentaculata的中的应用。
[0014] 一种检测木香疫霉菌的LAMP检测试剂盒：包含ImL检测溶液，所述的检测溶液包 括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、 8mM 环引物 LB、56mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2S04、0.24mM MgS04、4% Triton X_100、Bst DNA polymerase 320单位，180mM轻基萘酚蓝；其中，各引物序列具体如 下：
[0015] FIP:5， -ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3，；
[0016] BIP:5, -TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3,;
[0017] F3:5' -TGCCTTATAGGAATAGCGC-3' ；
[0018] B3 :5，-AGCATAAGTGAATTGACCCA-Si ;
[0019] LBji -CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3，。
[0020] 所述的检测木香疫霉菌的LAMP试剂盒在检测P. tentaculata的中的应用。
[0021] 一种检测木香疫霉菌的方法,包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板， 利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP ;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结 果（羟基萘酚蓝不会影响电泳结果），如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品中存 在P. tentaculata ;轻基萘酚蓝（hydroxylnaphthol blue, HNB)属于金属离子指示剂的一 种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中 Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体 系呈紫色，反应过程中Mg 2+与LAMP反应的副产物P2O广结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度 降低，pH发生变化,从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此,反应结束后通过反应体系 的颜色变化，来判断P. tentaculata的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在P. tentaculata ; 紫色表示检测结果为阴性，不存在P. tentaculata。
[0022] 所述的检测P. tentaculata的方法，优选：提取待检微生物的DNA，取1 μ L DNA溶 液，加入23 μ L所述的检测溶液和1 μ L灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为：60? 65°C，55?85min，优选64°C，80min ;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果 (羟基萘酚蓝不会影响电泳结果），如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测的病原为 P. tentaculata ;或者以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳 性，存在P. tentaculata ;紫色表示检测结果为阴性，不存在P. tentaculata。
[0023] 本发明的关键性技术之一是Ρ· tentaculata的高效特异扩增的引物序列及其扩 增方法。为了验证P. tentaculata的特异性引物序列，本发明以我国江苏、云南、山东和福 建等省份的10株P. tentaculata菌株和12种其它卵菌以及19种病原真菌为供试材料（表 1)。采用CTAB法提取发病组织中P. tentaculata的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉， 力口 900 μ L2% CTAB提取液和90 μ LlO% SDS，漩涡混匀，于55°C水浴lh，中间每IOmin上下 颠倒几次。12000rpm离心IOmin,取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，颠倒混 勻，12000rpm离心IOmin ;将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混勻，12000rpm离心 5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH5. 2)，-20°C 沉淀（>lh)。12000rpm离心IOmin,倾去上清，沉淀用70%乙醇洗漆两次，室温瞭干。加适 量灭菌超纯水或TE (pH8. 0)溶解沉淀（含20 μ g/mL RNase)，37°C处理Ih后，-20°C保存备 用。所有的土壤样品采用FaiU.DNAK SPIN试剂盒（Q-Biogene Ltd，USA)进行DNA的提取。 土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明书。这一商用土壤微生物DNA提取试剂盒可以在0. 5h内 提取到土壤中的微生物。当发生LAMP扩增反应时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应 液的浊度上升，通过HNB的显色反应结果所示，P. tentaculata的反应管里均呈天蓝色，其 为阳性结果，而其它疫霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管均呈紫色，为阴性结果，证明所 设计的LAMP特异性引物具有种的特异性。同时，反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，成像观察 扩增的反应产物，P. tentaculata的反应管中的反应液出现了典型阶梯形状条带，而其它疫 霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管没有出现梯形条带。这说明该引物组可被用于生产实 践中发病组织及土壤中P. tentaculata的快速可靠的检测盒鉴定。当用于发病组织中存在 P. tentaculata时，采用NaOH快速裂解法提取P. tentaculata的DNA，具体过程如下：取一 段发病的植株组织，每毫克组织加入10 μ L 0. 5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至I. 5mL 的EP管中，12000rpm离心5min，取5 μ L上清液加入495 μ LO. ImM Tris (ρΗ8· 0)，混匀后取 1 μ L直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无 PCR抑制物存在。
[0024] 表1用于检测R tentaculata特异性的真菌和卵菌菌株
[0025]
[0026]
【权利要求】
1. 一种用于检测木香疫霉菌的LAMP检测引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、 反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如 下： FIP:5' -ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3'; BIP:5, -TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3,; F3:5' -TGCCTTATAGGAATAGCGC-3，； -AGCATAAGTGAATTGACCCA-3'； LB:5' -CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3'。
2. 权利要求1所述的LAMP检测引物组合物在检测A 的中的应用。
3. -种检测木香疫霉菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：包含lmL检测溶液，所述的 检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向 外引物 B3、8mM 环引物 LB、56mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM (NH4)2S04、0.24mM MgS04、4%Triton X_100、Bst DNA polymerase 320 单位，180mM轻基萘酌?蓝；其中，各引物序 列具体如下： FIP:5' -ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3'; BIP:5, -TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3,; F3:5' -TGCCTTATAGGAATAGCGC-3，； -AGCATAAGTGAATTGACCCA-3'； LB:5' -CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3'。
4. 权利要求3所述的检测木香疫霉菌的LAMP检测试剂盒在检测A 的中 的应用。
5. -种检测木香疫霉菌的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待检微生物的DNA ; 2) 以提取的DNA为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP ; 3) 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带， 则证明所检测样品中存在A (ewtecWate ;无特征性阶梯状条带，贝U所检测样品中无A ;或进行步骤4)操作； 4) 反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断A 的有无：天蓝色表示 检测为阳性，存在A (ewtecw/ate ;紫色表示检测结果为阴性，不存在A
6. 根据权利要求5所述的检测木香疫霉菌的方法，其特征在于：步骤2)中，取1 y L DNA溶液，加入23 y L所述的检测溶液和1 y L灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为： 60?65°C，55 ?85min。
【文档编号】C12N15/11GK104372092SQ201410642888
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】戴婷婷, 郑小波, 吴小芹 申请人:南京林业大学