发酵法生产木糖醇的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种发酵法生产木糖醇，包括以下步骤：富含多缩戊糖植物原料水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液；将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30℃培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于 100mL 的液体培养基中生长，再按照 2％的接种量接种于 1000mL 以 3％木糖为唯一碳源的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h。本发明用于生产低聚果糖操作简单、作用条件温和、易掌握，木糖 - 木糖醇的转化率最高提高到了91.4％，发酵时间需要不到2h即可，大大提高了发酵法生产木糖醇的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
【专利说明】发酵法生产木糖醇
[0001](一)
【技术领域】
本发明涉及木糖醇，具体涉及发酵法生产木糖醇。
[0002](二)
【背景技术】
木糖醇是一种重要的功能性多元糖醇，木糖醇在体内代谢不需要胰岛素的参与，食用后不会提高血糖值，可用于糖尿病食品中。它在口腔中不会被微生物发酵，可防止龋齿发生。木糖醇还可作为非肠道营养的能量来源等。正是因为木糖醇具有以上功能特性，它被广泛应用于食品和医药等工业。
[0003]木糖醇的生产方法可分成三种:提取、化学合成、生物合成。目前，工业生产主要采用化学合成法。生物合成法是利用微生物中的还原酶来生产木糖醇，它可有效降低木糖醇的生产成本。发酵法不仅有可能省去木糖纯化步骤，还可以简化木糖醇的分离步骤，是一种很有前途的生产方法。
[0004]自然界的微生物中，酵母比较容易将木糖转化生成木糖醇。其中，产木糖醇性能优越的酵母菌株主要集中于假丝酵母属(Candida)，如季乐蒙地假丝酵母(C.guiIliermondii)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、莫基假丝酵母(C.mogii)、平滑假丝酵母
(C.parasilosis)等等。工业化生产主要使用热带假丝酵母。酵母对D-木糖的转化途径首先是木糖还原酶以NADPH或NADH为辅酶(主要是NADPH);将D-木糖还原为木糖醇，木糖醇既可以作为主要产物进入培养基内，也可以被以NAD+为辅酶的木糖醇脱氢酶催化氧化成D-木酮糖，最后进入磷酸戊糖代谢途径。酵母代谢木糖时会经过D-木酮糖途径，消耗一部分已经生成的木糖醇，所以木糖醇转化率一般只能达到理论值的65%?90%。但在实际工业化生产过程中，木糖-木糖醇转化率只有50%?70%。酵母中的木糖还原酶的活性受到温度、pH、NADPH浓度和离子浓度的影响，而该酶的活性直接影响到木糖-木糖醇的转化率。
[0005]如何提高工业化生产中木糖-木糖醇转化率，一直是本领域亟待解决的问题。2010年8月4公开的一种提高木糖醇得率的发酵方法，提出了向培养基中添加Zn2+至终浓度0.3?0.6mmol/L以提高木糖醇发酵得率。木糖-木糖醇的转化率从68%提高到了79%。转化率提高率仍是有限，需要进一步加强，本发明是在上述方案的技术上进行进一步的研究。
[0006](三)
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种发酵法生产木糖醇，操作方便，过程易于控制，反应时间短，有利于工业化生产。
[0007]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种发酵法生产木糖醇，其特殊之处在于:包括以下步骤:
(O制备木糖溶液:富含多缩戊糖植物原料水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液；
(2)菌株发酵:将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30°C培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于10mL的液体培养基中生长，再按照2%的接种量接种于100mL以3%木糖为唯一碳源的液体培养基中在30°C，200rpm下发酵24h ；
(3)种子培养:10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;装液量为50mL/250mL，培养基pH值自然，接入斜面种子，30°C，180rpm摇床上培养20h ;
(4)发酵木糖产木糖醇:按2%的接种量将液体种子接入发酵瓶中，培养基组份为木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L, NaCl 10 g/L、MgSO4.7H2
O 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4)2HPO4,装液量为 120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸锌 4g/L，培养基pH值自然，往发酵瓶中，分别添加Fe3+、Zn2+，使其达到8-10mmOl/L、l-4mmOl/L，于 30°C，200rpm，250mL 摇瓶培养 40min_2h 后终止。
[0008]本发明的发酵法生产木糖醇，富含多缩戊糖植物原料为玉米芯、草木樨中的至少一种。
[0009]本发明的有益效果:本发明用于生产低聚果糖操作简单、作用条件温和、易掌握，木糖-木糖醇的转化率最高提高到了 91.4%，发酵时间需要不到2h即可，大大提高了发酵法生产木糖醇的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
[0010](四)【具体实施方式】实施例1
现有发酵法生产木糖醇工艺，其步骤:
(O菌株发酵
将热带假丝酵母(Candida tropicalis ACCC 20148,购于中国农业微生物菌种保藏管理中心)接种于 YPD(Y:yeast extract, P:peptone, D:glucose)平板培养基上 30°C培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于10mL的液体培养基中生长，再按照2%的接种量接种于100mL以3%木糖为唯一碳源的液体培养基中发酵。发酵条件为30°C，200rpm，24h。
[0011](2)木糖还原酶的纯化及酶活测定
纯化:将实施例1中发酵完毕的发酵液低温离心并收集菌体，超声波破碎后取上清，将上清PH调到7.0。2.在4°C条件下添加40%饱和度硫酸铵，静置4?6h，低温离心去除杂蛋白，然后再添加硫酸铵使溶液的饱和度为80%，4°C静置20h，离心收集沉淀，沉淀部分溶于少量20mmol/L pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，并用Tris-HCl缓冲液充分透析。3.低温离心取上清。4.将步骤3中浓缩的酶液上样到DEAE-Sepharose柱层析中，在充分洗去杂蛋白后洗脱，流速为1.0mL/min，洗脱液为20mmol/L pH7.0的Tris_HCl，活性部分被含0.5MNaCl的洗脱液洗脱下来，收集蛋白峰。5.用1KDa的YM超滤膜及Amicon超滤杯借助N2压(压力为0.4Mpa)对收集的活性部分进行超滤浓缩、除盐获得纯化产物。
[0012]酶活力测定:用分光光度计在340nm波长处检测还原型辅酶NADH特异吸收值的降低速率，间接检测酶活力大小。具体参数为:木糖还原酶液SOyUNADH 0.15mmol/L,木糖0.lmol/L，缓冲液为PBS(0.05mol/L，pH7.0)，反应温度为30°C，总体积为2.5mL。酶活力单位定义为每分钟消耗lymol NADH所需的酶量为I个酶活单位。蛋白测定方法采用考马斯亮蓝G-250法。经测定纯化后的木糖还原酶的比活力达12U/mg。
[0013]Zn2+浓度对木糖-木糖醇转化率的影响 1.培养基中Zn2+浓度测定:分别选取1g不同厂家的酵母膏，配置IL溶液，用HI93731锌浓度测定仪检测其中Zn2+浓度，经检测，其Zn 2+浓度在8?llmg/L之间。
[0014]2.种子培养:10g/L 木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;装液量为50mL/250mL，培养基pH值自然，接入斜面种子，30°C，180rpm摇床上培养20h。
[0015]3.发酵木糖产木糖醇:按2%的接种量将液体种子接入两组发酵瓶中。培养基组份为(g/L)木糖 100、酵母膏 10.0,NaCl 6.0、MgS04.7H20 0.4、KH2P043、(NH4)2ΗΡ04，装液量为120mL/250mL，培养基pH值自然。向其中一组中添加Zn2+，使其达到0.5mmol/L，而另一组不添加Zn2+
，两组均于30°C，200rpm，250mL摇瓶培养50h后终止，木糖-木糖醇的转化率为79%。
[0016]实施例2
(1)制备木糖溶液:玉米芯水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液，该步骤常规技术进行即可；
(2)菌株发酵:将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30°C培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于10mL的液体培养基中生长，再按照2%的接种量接种于100mL以3%木糖为唯一碳源的液体培养基中在30°C，200rpm下发酵24h ；
(3)种子培养:10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;装液量为50mL/250mL，培养基pH值自然，接入斜面种子，30°C，180rpm摇床上培养20h ;
(4)发酵木糖产木糖醇:按2%的接种量将液体种子接入发酵瓶中，培养基组份为木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4.7H2
O 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4)2HPO4,装液量为 120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸锌 4g/L,培养基pH值自然,往发酵瓶中，分别添加Fe3+、Zn2+,使其达到10mmol/L、2.5mmol/L,于30°C，200rpm, 250mL摇瓶培养40min后终止，木糖产木糖醇的转化率为91.4%。
[0017]实施例3
(O制备木糖溶液:草木樨水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液；
(2)菌株发酵:将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30°C培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于10mL的液体培养基中生长，再按照2%的接种量接种于100mL以3%木糖为唯一碳源的液体培养基中在30°C，200rpm下发酵24h ；
(3)种子培养:10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2P04 ;装液量为50mL/250mL，培养基pH值自然，接入斜面种子，30°C，180rpm摇床上培养20h ;
(4)发酵木糖产木糖醇:按2%的接种量将液体种子接入发酵瓶中，培养基组份为木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4.7H2
O 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4) 2HP04，装液量为 120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸锌4g/L,培养基pH值自然,往发酵瓶中，分别添加Fe3+、Zn2+,使其达到8mmol/L、4mmol/L,于30°C,200rpm,250mL摇瓶培养2h后终止，木糖产木糖醇的转化率为90.8%。
[0018]实施例4
(O制备木糖溶液:玉米芯、草木樨水解得水解产物(两者重量比为3:1)，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液，该步骤常规技术进行即可；
(2)菌株发酵:将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30°C培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于10mL的液体培养基中生长，再按照2%的接种量接种于100mL以3%木糖为唯一碳源的液体培养基中在30°C，200rpm下发酵24h ；
(3)种子培养:10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;装液量为50mL/250mL，培养基pH值自然，接入斜面种子，30°C，180rpm摇床上培养20h ;
(4)发酵木糖产木糖醇:按2%的接种量将液体种子接入发酵瓶中，培养基组份为木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L, NaCl 10 g/L、MgSO4.7H20 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4)2HPO4,装液量为120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸锌4g/L，培养基pH值自然，往发酵瓶中，分别添加 Fe3+、Zn2+,使其达到 9mmol/L、lmmol/L,于 30°C，200rpm, 250mL 摇瓶培养 50min 后终止，木糖产木糖醇的转化率为89.9%。
[0019]Fe3+、Zn2+可以为 FeCl 3、ZnSO4' ZnCl20
【权利要求】
1.一种发酵法生产木糖醇，其特征在于:包括以下步骤: (1)制备木糖溶液:富含多缩戊糖植物原料水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液； (2)菌株发酵:将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30°C培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于10mL的液体培养基中生长，再按照2%的接种量接种于100mL以3%木糖为唯一碳源的液体培养基中在30°C，200rpm下发酵24h ； (3)种子培养:10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;装液量为50mL/250mL，培养基pH值自然，接入斜面种子，30°C，180rpm摇床上培养20h ; (4)发酵木糖产木糖醇:按2%的接种量将液体种子接入发酵瓶中，培养基组份为木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4.7H2 O 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4)2HPO4,装液量为 120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸锌 4g/L，培养基pH值自然，往发酵瓶中，分别添加Fe3+、Zn2+，使其达到8-10mmOl/L、l-4mmOl/L，于 30°C，200rpm，250mL 摇瓶培养 40min_2h 后终止。
2.根据权利要求1所述的发酵法生产木糖醇，其特征在于:富含多缩戊糖植物原料为玉米芯、草木樨中的至少一种。
【文档编号】C12R1/74GK104450800SQ201410755260
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】窦光朋, 张继红, 窦宝德 申请人:山东百龙创园生物科技有限公司