一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒。所述核酸膜条包括一基底和固定于所述基底上的特异性寡核苷酸探针，所述特异性寡核苷酸探针序列如：SEQ ID NO：1-42。本发明的另一技术方案为提供一种遗传性耳聋基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的遗传性耳聋基因检测试剂盒检测的核酸膜条、PCR反应液I和PCR反应液II。本发明有益效果在于：本发明遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒包括8对能够高效特异扩增的引物和42条能特异杂交的探针。本发明检测位点较全，做到了2管反应液1张膜条就能够同时完成21个常见的耳聋位点的检测。
【专利说明】-种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 听觉系统中传音、感音及其听觉传导通路中的听神经和各级中枢发生病变，引起 听功能障碍，产生不同程度的听力减退，统称为耳聋。耳聋是严重影响人类健康和生活质 量的最常见的疾病之一，估计全世界现有7亿多人有中度以上（55dB)的听力损失。据我 国2006年第二次全国残疾人抽样调查显示，听力语言残疾者达2780万人，其中单纯听力残 疾2004万，占全国8296万残疾人的24. 16%。在这些听力残疾者人群中0?6岁听障儿 童80万，6?14岁听障儿童11万，每年新生聋儿3万（不包括迟发性聋以及药物性聋）。 据统计，约60%耳聋由遗传因素导致的，其中约70%为非综合征型耳聋。非综合征型耳聋 具有高度的遗传异质性，可以多种方式遗传给下一代，包括：常染色体显性遗传（DFNA)，占 20 %?25% ;常染色体隐性遗传（DFNB)，占75 %?80% ;X连锁遗传（DFN)，占1% ;线粒体 突变母系遗传，约为1 % ;Y连锁遗传（相关染色体位点命名为DFNY)，目前只有王秋菊等报 道过一个中国耳聋相关家系；其中，常染色体隐性遗传性耳聋，多表现为学语前耳聋；常染 色体显性遗传性耳聋则多表现为学语后的进行性发展的耳聋。
[0003] 遗传性耳聋可由多种基因导致。根据症状可分为非综合征型耳聋（nonsyndromic hearingloss，NSHL)和综合征型耳聋（syndromic hearing loss，SHL)。至 2014年 10 月为止 共定位NSHL基因位点有145个，包括DFNA位点57个，DFNB位点80个，DFN位点5个，DFNY 位点1个，修饰基因位点2个。近期在我国国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明： 我国非综合征性耳聋主要由以下几个基因引起，如GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA 12srRNA。
[0004] 耳聋的高发生率及高度的遗传异质性，要求建立切实有效的基因检测方法，有效 的基因检测和预防措施对于减少耳聋的发生具有重大的作用。目前，基因诊断方法包括：聚 合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)、限制酶切指纹-单链构象多态性 分析（REF-SSCP)、变性高效液相色谱分析（DHPLC)、基因芯片、直接测序（DS)等。
[0005] 采用基因检测方法的耳聋检测产品有博奥生物集团的九项遗传性耳聋基因检测 试剂盒（微阵列芯片法）和十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒（微阵列芯片法）、济南 英盛生物技术有限公司的耳聋基因 GJB2 235delC检测试剂盒（荧光PCR法）、智海生物工 程（北京）有限公司的药物性耳聋基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）、中生北控生物科技 股份有限公司的四项耳聋基因检测试剂盒（ARMS-PCR法）、山东三月三基因技术有限公司 的线粒体DNA A1555G突变检测试剂盒（PCR-酶切法），这些产品各有其优点，但是都有一定 的缺点，或者不能定性，或者耗时费力、所需设备昂贵，最重要的是这些产品大部分难以同 时对不同基因的多个突变位点进行检测。鉴于遗传性耳聋基因突变异质性强，涉及的基因 多，位点多，以及人群携带致病基因比例高等特点，因此有必要建立一种高通量、高效率、经 济的基因突变检测方法及产品，以实现临床快速检测或大规模的人群筛查。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种高通量、高效率、经济的遗传性耳聋基因检测的核酸 膜条及试剂盒。
[0007] 本发明的技术方案为提供一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条，包括一基底和 固定于所述基底上的特异性寡核苷酸探针，所述特异性寡核苷酸探针序列如：SEQ ID NO: 1-42。
[0008] 本发明的另一技术方案为提供一种遗传性耳聋基因检测的试剂盒，所述试剂盒包 括上述的遗传性耳聋基因检测试剂盒检测的核酸膜条、PCR反应液I和PCR反应液II ;所 述PCR反应液I包括如下4对引物：引物GJB2F:SEQ ID N0:43;引物GJB2R:SEQ ID NO: 44 ;引物 mtDNAF :SEQ ID NO :45 ;引物 mtDNAR :SEQ ID NO :46 ;引物 2168F :SEQ ID NO :47 ; 引物2168R:SEQIDN0:48;引物IVS7F :SEQIDN0:49;引物IVS7R:SEQIDN0 :50;所述 PCR反应液II包括如下4对引物：引物GJB3F:SEQIDN0:51 ;引物GJB3R:SEQIDN0:52; $*1174F:SEQIDN0:53d|*1174R:SEQIDN0:54d|* 1975F:SEQIDN0:55d|* 1975R :SEQ ID NO :56 ;引物 IVS15F :SEQ ID NO :57 ;引物 IVS15R :SEQ ID NO :58。
[0009] 本发明有益效果在于：本发明遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒包括8对 能够高效特异扩增的引物和42条能特异杂交的探针，此引物和探针长度或位置均经过精 心设计，其中，特异性寡核苷酸探针中的突变探针及其正常对照探针分别设在两条不同的 链上，防止杂合子突变位点的两条探针竞争产物。在位点较多的片段，所述特异性寡核苷酸 正常对照探针尽量均分在正、负链上。在GC含量高的位点，所述特异性寡核苷酸探针人为 引入错配碱基，提高探针的结合的特异性。在探针跟产物结合效率不高的位点，所述特异性 寡核苷酸探针设计成锁核酸探针（LNA)，提高探针的结合效率。
[0010] 本发明试剂盒可以一次试验检测非综合征遗传性耳聋四个热点基因上21个位点 突变，检测位点多，检测灵敏度高、特异性强和重复性好。且做到了 2管反应液1张膜条就 能够同时完成21个耳聋位点的检测。可以肉眼直接判读结果，仪器要求只需要一台普通 的PCR仪和一台杂交仪就可满足实验检测，检测时间短、成本低、操作方便。本发明试剂盒 是一种高通量、高效率、经济的基因突变检测产品，实现了临床快速检测或大规模的人群筛 查，实现早发现、早干预，控制聋哑残疾的发生，具有重大的社会效益。
【具体实施方式】
[0011] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 详予说明。
[0012] 本发明最关键的构思在于：本发明遗传性耳聋基因检测的试剂盒的引物和探针长 度、位置和标记方式均经过精心设计，可以一次试验检测21个位点突变，且在2管反应液1 张月旲条就能够完成检测。
[0013] 实施例1
[0014] 本发明【具体实施方式】如下：
[0015] 1、技术基础
[0016] 根据非综合征遗传性耳聋流行病调查结果来确定要检测的基因及其具体位点。根 据确定的区域设计PCR引物以扩增获得GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA上的各目的DNA片 段；根据所需检测的基因序列特点设计特异的杂交探针；通过PCR产物与探针杂交、信号显 色和结果判读来进行耳聋基因的诊断。
[0017] 1.1基因芯片设计
[0018] 根据DNA芯片检测目标，从相关基因数据库中选取特异性基因序列作为探针；根 据所选用的核酸序列进行探针序列及其布局设计，针对个别探针的序列特殊性，进行特殊 标记或设计，使所设计的探针组合对待测基因的杂交特异性强、探针之间的关联性好、探针 阵列及其空间布局的优化；其主要优点是可以同时检测非综合征遗传性耳聋四个热点基因 上21个位点突变，包括GJB2上6种突变型、GJB3上2种突变型、SLC26A4上10种突变型和 12S rRNA上3种突变型。简便易行，技术要求低，并且探针不受探针分子大小种类的限制， 能根据使用者的要求简便地制出符合目的的芯片。
[0019] 膜条上的探针排列顺序如表1所示，由斑点显现的位置即可判断结果。经由芯片 阅读仪扫描读取分析结果，必要时可进行DNA序列分析，以证实结果的准确性。
[0020] 根据选择的非综合征遗传性耳聋四个热点基因上21个位点突变，包括GJB2上6 种突变型、GJB3上2种突变型、SLC26A4上10种突变型、和12S rRNA上3种突变型，设计探 针阵列（14 X 3)如表1。
[0021] 表1本发明试剂盒的膜条阵列
[0022]
【权利要求】
1. 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条，包括一基底和固定于所述基底上的特异性寡 核苷酸探针，其特征在于，所述特异性寡核苷酸探针序列如：SEQ ID NO :1-42。
2. 根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因检测的核酸膜条，其特征在于，所述基底为 尼龙膜。
3. 根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因检测的核酸膜条，其特征在于，所述特异性 寡核苷酸探针的3'端进行氨基标记。
4. 一种遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述 的遗传性耳聋基因检测试剂盒检测的核酸膜条、PCR反应液I和PCR反应液II ; 所述PCR反应液I包括如下4对引物： 引物 GJB2F :SEQ ID NO :43 ; 引物 GJB2R :SEQ ID NO :44 ; 引物 mtDNAF :SEQ ID NO :45 ; 引物 mtDNAR :SEQ ID NO :46 ; 引物 2168F :SEQ ID NO :47 ; 引物 2168R :SEQ ID NO :48 ; 引物 IVS7F :SEQ ID NO :49 ; 引物 IVS7R :SEQ ID NO :50 ; 所述PCR反应液II包括如下4对引物： 引物 GJB3F :SEQ ID NO :51 ; 引物 GJB3R :SEQ ID NO :52 ; 引物 1174F :SEQ ID NO :53 ; 引物 1174R :SEQ ID NO :54 ; 引物 1975F :SEQ ID NO :55 ; 引物 1975R :SEQ ID NO :56 ; 引物 IVS15F :SEQ ID NO :57 ; 引物 IVS15R :SEQ ID NO :58。
5. 根据权利要求4所述的遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反 应液I和PCR反应液II均采用了 2'-脱氧-5' -三磷酸尿苷-尿嘧啶-N-糖苷酶防污染体 系。
6. 根据权利要求4所述的遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述引物5'端 均标记生物素。
7. 根据权利要求4所述的遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应 液I各组分含量为：
所述 dNTP 包括 dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP ;
【文档编号】C12Q1/68GK104498609SQ201410795807
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】刘晶晶, 梁少明, 危林耿, 向筑 申请人:亚能生物技术（深圳）有限公司