包含来自鳗鱼的胶原蛋白及人体型神经酰胺的组合物、粉末及其制造方法与流程

本发明涉及一种来自鳗鱼的胶原蛋白及包含人体型神经酰胺成分的组合物、粉末及其制造方法。

背景技术：

近年来，在食用生物的一个个体中不适合食用而废弃的部分所含的补充物等中探索可利用的有用化合物，与实用化相关的尝试受到关注。

其中，鳗鱼的头部作为不可食部分而不能食用，成为大量废弃物。

另一方面，已知神经酰胺存在于人体的皮肤角质层中并含有适度的水分，具有保持皮肤柔软性的保湿功能、保持体内水分的功能、阻止来自外部的异物侵入的功能等。

胶原蛋白作为保湿效果高的蛋白质而被人所知。胶原蛋白分子的每3个残中重复的除甘氨酸以外的残基全部暴露在分子表面，可在周围保持较多的水分子。

神经酰胺一直从牛中制备，近年来因为BSE(Bovine spongiform encephalopathy，牛海绵状脑病)等问题，所以进行了从其他原料中制备的研究。例如，提出有来自植物的神经酰胺等。

另外，提出有从以前废弃的珍珠贝等的软体部分以高收获率制造鞘脂的方法(专利文献1)。

先前技术文献

专利文献

专利文献1：专利第3408958号公报

技术实现要素：

发明所欲解决的问题

但是，来自植物的神经酰胺的萃取、生成耗费工夫和成本。

另外，专利文献1中所记载的鞘脂的制造方法是通过有机溶剂来萃取属于腹足类、斧足类、头足类中的任一种类的水圈生物的1种以上的软体部分，并进行色谱分析处理，通过有机溶剂加以区分来提取鞘脂部分的方法，因此极其耗费时间。

已知胶原蛋白以前来自肉或鱼，胶原蛋白自身的分子量较大，因此也有人质疑胶原蛋白单独包含在补充物或化妆品中的情形下的保湿等效果。

本发明的目的是从鳗鱼的不可食部分、主要是头部廉价且高效地提供包含胶原蛋白及神经酰胺成分的组合物或粉末。

解决问题的方法

本发明具有以下的特征。

[1]一种包含来自鳗鱼的胶原蛋白及人体型神经酰胺成分的组合物的制造方法，其包括：

(1)通过喷射水流清洗鳗鱼头部的步骤；

(2)在水中加热鳗鱼头部，同时进行粉碎的步骤；

(3)从前述(2)的步骤的温度冷却后，添加酶来进行酶反应的步骤；

(4)从前述(3)的步骤的冷却温度进一步加热来停止酶反应的步骤；

(5)用过滤器过滤前述(4)中所获得的反应物来将滤液与固形物分离的步骤；

(6)将前述(5)中所获得的滤液注入到离心分离器中并进行分离，回收包含胶原蛋白及神经酰胺成分的组合物的步骤。

[2]根据[1]所述的包含来自鳗鱼的胶原蛋白及人体型神经酰胺成分的组合物的制造方法，其特征在于：所含有的胶原蛋白或神经酰胺的合计量中，在分子量分布中分子量为1000以上的物质为50％以上。

[3]根据[1]或[2]所述的包含来自鳗鱼的胶原蛋白及人体型神经酰胺成分的组合物的制造方法，其特征在于：在前述组合物中添加糊精，并且用喷雾干燥装置使它成为粉末。

[4]一种包含来自鳗鱼的胶原蛋白及人体型神经酰胺成分的粉末，其是使用前述[1]至[3]中任一制造方法来制造。

[发明的效果]

根据本发明，可从鳗鱼的头部廉价且高效地提供包含胶原蛋白及神经酰胺成分的组合物、粉末。

附图说明

图1是表示本发明的实施例的包含来自鳗鱼的胶原蛋白及神经酰胺成分的粉末的制造方法的流程图。

图2是神经酰胺的化学结构(箭头表示串联质量分析时的断裂部位)。

图3是表示从样品中萃取的神经酰胺的质量分析结果的图表。

图4是表示神经酰胺的分子种组成(每克组织的含量)的图表。

图5是表示S1、S2样品GalCer的质谱的图表。

图6是表示S1、S2样品中所含的HexCer的的分子种组成的图表。

图7是表示S1、S2样品中所含的鞘磷脂的质谱的图表。

图8是表示包含胶原蛋白的情况的样品分析结果。

图9是表示样品中所含的胶原蛋白及神经酰胺中分子量较大的(例如1000以上)为50％以上的情况的样品分析结果。

图10是表示图9及图11的样品分析方法的图。

图11是表示样品中所含的胶原蛋白及神经酰胺中分子量较大的(例如1000以上)为50％以上的情况的资料样品分析结果。

符号的说明

无。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明的实施形态。

具有本发明的步骤的包含来自鳗鱼的胶原蛋白及神经酰胺成分的组合物是按照以下的步骤来制造。

(1)通过喷射水流清洗鳗鱼头部的步骤；

(2)在水中加热鳗鱼头部，同时进行粉碎的步骤；

(3)从前述(2)的步骤的温度冷却后，添加酶来进行酶反应的步骤；

(4)从前述(3)的步骤的冷却温度进一步加热来停止酶反应的步骤；

(5)用过滤器过滤前述(4)中所获得的反应物来将滤液与固形物分离的步骤；

(6)将前述(5)中所获得的滤液注入到离心分离器中并进行分离，回收包含胶原蛋白及神经酰胺成分的组合物的步骤。

另外，也可以在该组合物中添加糊精并且用喷雾干燥装置使它成为粉末来制造包含胶原蛋白及神经酰胺成分的粉末。

本发明中，作为原料的鳗鱼通常为可供食用的鳗鱼，可使用属于鳗鱼科(Anguillidae)鳗鱼(Anguilla)属的种类。

例如，可使用大尾鳗鱼、欧洲鳗鱼、美国鳗鱼。

另外，除此以外，也可以使用不属于前述种类但通常称为鳗鱼的种类，例如囊鳃鳗、电鳗、黄鳝、七鳃鳗、盲鳗等。

本发明是使用前述鳗鱼的头部。

本发明是使用以前废弃的头部高效地制造包含胶原蛋白及神经酰胺成分的组合物。

例如，烹饪鳗鱼的烤鱼片时，作为不可食部分的头部通常作废弃处理。

前述头部是烹饪过程中从可供食用的身体部分摘除的部分，当然也可以是身体附着在骨头部分或头部的状态。另外，不限定于这些，例如也可以包含内脏、鳞、鳍、皮、血液等。

(头部的前处理)

以下，参照图1来说明本发明的包含胶原蛋白及神经酰胺成分的组合物的制造方法。

此外，为了除去鳗鱼头部所具有的臭气成分，较佳为

在预先制作的食盐水(例如1～10％左右的浓度)中进行浸渍处理，使氨或三甲胺等在食盐水中溶出。本实施形态中，对在前述食盐水中经过浸渍处理的鳗鱼头部喷射喷射水流，来除去附着在鳗鱼头部外表面的污垢或杂菌。

喷射水流是指提高水流压力来排出的水流状态，使水流猛烈地喷射到鳗鱼头部。

接着，将这种经过清洗的鳗鱼头部投入到水和桶中来加热。添加的水的量例如较佳为设为投入的鳗鱼头部质量的2～4倍左右。

例如，在鳗鱼的头部200kg中添加水800kg并投入到桶中来加热、粉碎。

前述加热、粉碎处理的目的是使鳗鱼头部软化来使作为下一步骤的酶反应变得容易。

在前述投入到桶中的阶段，鳗鱼头部可为生鲜状态，也可为冷冻状态。

在水中加热鳗鱼头部时，作为加热手段，可为煮沸等通常的加热手段。

本实施形态中，在冷冻鳗鱼头部的情形时，如果进行蒸汽加热，则可通过快速解冻来抑制鳗鱼头部的变质，因此较佳。

在鳗鱼头部是冷冻状态的情形时，该阶段中的加热温度及加热时间只要可将鳗鱼头部解冻，则并无特别限定。

例如，在80～100℃下加热30～120分钟的情形时，整体成为解冻状态，因此较佳。

在鳗鱼头部不是冷冻状态的情形时，同样也通过在80～100℃下进行30～120分钟左右的加热处理来使粉碎变得容易，因此较佳。在实施100℃以上或120分钟以上的加热处理的情形时，有所含有的胶原蛋白及神经酰胺改性的可能性，因此欠佳。

接着，在加热的热水中将前述鳗鱼头部粉碎。

作为粉碎手段，可使用通常使用的手段。

例如，可使用球磨机、混砂机、喷射碾机等。

通过在该阶段将原料预先大致地粉碎，可在下一步骤的酶反应中缩短反应时间。粉碎也可以分成2个阶段来进行。

例如，作为第1粉碎处理，使用通用的混合器进行粗粉碎(粒径1～2mm左右)，继而，作为第2粉碎处理，使用专用的粉碎机(例如定向粉碎机股份有限公司制造)进行更细的微粉碎(粒径200μm以下)。

然后，在粉碎的鳗鱼头部添加酶，通过酶反应来进行溶解。

作为溶解所使用的酶，只要为通常使用的用来分解蛋白质的酶(肽键水解酶)，则并无特别限定，例如可列举包含蛋白酶的酶。

本实施形态中，包含蛋白酶的酶为分解动物系蛋白质的酶，只要为包含蛋白酶类的酶，则并无特别限定。作为蛋白酶，例如可列举木瓜酶、菠萝酶、无花果酶、内切蛋白酶、肽链内切酶等。

酶反应中，必须将粉碎的鳗鱼头部的温度调整到适合所使用的酶的种类的温度。

例如，在30℃～65℃等温度下，在控制在适合所使用的酶的温度的状态下，维持特定时间(例如30～90分钟)，来进行鳗鱼头部的溶解反应。

该酶反应中，较佳为调整到最适的PH值，本实施形态中，例如较佳为调整到pH值6左右。

接着，为了停止酶反应，加热桶内的溶解物。

加热温度及加热时间可适当选择所使用的酶失活的温度及时间，例如，通过在90℃以上维持20～40分钟(本实施例中90℃×30分钟)来使酶失活，停止酶反应。

另外，通过在90℃以上维持20～40分钟，也可以杀死鳗鱼血液中所含的沙氏捍菌。

继而，用过滤器过滤酶反应中所获得的反应物(溶解而成为黏稠状态的液体)，通过前述酶反应来将未溶解的固形物和滤液分离。该步骤中，分离的固形物主要为鳗鱼骨头部分。未溶解的骨部分也可以根据需要在后续步骤中进行干燥粉碎而制成钙原料。

接着，将脂质白滤液中分离而获得水溶液(组合物)。

作为脂质的分离方法，例如可使用离心分离器。或者，也可以将滤液静置，根据比重来分离回收在上层分离的脂质和在下层沉淀的水溶液(组合物)。所获得的水溶液(组合物)可直接保存、浓缩、干燥而制成粉末等。

接着，使用该水溶液(组合物)来说明包含来自鳗鱼的胶原蛋白及神经酰胺成分的粉末的制造方法。

为了调整包含所获得的来自鳗鱼的胶原蛋白及神经酰胺成分的水溶液的粘度并制成粉末，而添加糊精。糊精通常只要添加液体成为粉末时所使用的量即可。例如，按照质量比以成为组合物：糊精＝1：2～3的方式添加。

然后，通过使用喷雾干燥装置等使组合物成为粉末，可获得本实施形态的包含来自鳗鱼的胶原蛋白及神经酰胺成分的粉末。

实施例

其次，使用图式详细地说明本发明的实施例。

图1是表示本发明的实施例的包含来自鳗鱼的胶原蛋白及神经酰胺成分的粉末的制造方法的流程图。

像图1所示一样，

首先，在桶中投入冷冻状态的鳗鱼头(200kg)+水(800kg)合计1000kg，在90℃下用40分钟在桶的热水中通过旋转叶片粉碎鳗鱼头。

粉碎是最初以周速50m／秒粗粉碎10秒钟，然后继续粉碎直到成为200网孔左右为止。

其次，将粉碎的液体整体冷却到55℃，添加作为分解酶的蛋白酶，一面搅拌20分钟一面进行酶反应。

然后，将溶解物再次加热到90℃并维持30分钟，停止酶反应。

该阶段中，鳗鱼头部大致溶解并成为黏稠状态。

接着，用过滤器过滤该黏稠状态的溶解物，去除没有溶解的骨头等固形物。

将所获得的滤液注入到离心分离器中，将脂质分离而获得水溶液(组合物)。

在前述水溶液(组合物)中添加糊精20kg并混合。然后，用喷雾干燥装置使它成为粉末(SD粉末)，获得包含来自鳗鱼头的胶原蛋白及神经酰胺成分的粉末。所获得的粉末量约为28kg。

其次，通过以下的方式来验证本发明中所获得的来自鳗鱼的胶原蛋白及神经酰胺成分的存在。

通过以下的方式调查所获得的样品(通过喷雾干燥装置粉末化的粉末)中所含的神经酰胺成分(神经酰胺、单己糖基神经酰胺)。

图2是神经酰胺的化学结构(箭头表示串联质量分析时的断裂部位)。

像图2所示一样，

神经酰胺具有鞘氨醇(S)、脂肪酸(N)或α-羟基脂肪酸(A)缩合的结构。

包括人体的动物的组织中，前者(鞘氨醇(S))的量最多，是在任何脏器中都存在的神经酰胺(Cer)，简称为Cer(NS)。

后者(脂肪酸(N)或α-羟基脂肪酸(A)也大量存在于脑、皮肤、肾脏等中，简称为Cer(AS)。

(样品S1、S2的己糖基神经酰胺的比较)

将样品分成2份，分别提取各207mg放入到玻璃试管中，设为S1、S2。

首先，为了排除萃取效率不均等来进行更准确地定量，

在样品S1、S2中添加内部标准脂质(0.24nmol神经酰胺Cer(NS)18：1、0.12nmol葡萄糖基神经酰胺GlcCer(NS)12：0)，对该样品进行脂质萃取处理。

为了针对鞘脂进行分析，通过弱碱水解处理来除去磷脂质。

图3是表示从样品中萃取的神经酰胺的质量分析结果的图表。

*标记的波峰表示未确定的混入物或来自环境的物质，

IS表示内部标准物质。

图4是表示神经酰胺的分子种组成(每克组织的含量)的图表。

横轴表示构成神经酰胺的鞘氨醇及脂肪酸的碳数的和，纵轴表示S1及S2的测定的平均值。

像图3所示一样，

如果通过S1及S2中的神经酰胺的质谱的质量分析来调查结构，则存在主要是人体型鞘氨醇的Cer(NS)型，在量方面，长度(碳数)16的较多，人体内最多的长度(碳数)18的也存在相当多的量。

像图2所示一样，神经酰胺具有鞘氨醇及脂肪酸缩合的结构。根据MS／MS分析的结果，

C32及C34的波峰与脂肪酸的链长为16且鞘氨醇的链长分别为16及18的神经酰胺对应，

C40及C42的波峰与链长为24且具有1个双键的脂肪酸、及鞘氨醇的链长分别为16及18的神经酰胺对应。

将在鳗鱼神经酰胺中几乎不包含的Cer(NS)18：1的0.24nmol

添加到样品中(图3的IS]，算出神经酰胺组成及含量(图4)。

从这些结果，如果无视总碳数相同但鞘氨醇骨架的链长不同的各分子种的异构体的微量成分，则

具有链长16及18的鞘氨醇骨架的神经酰胺的大致比率成为3：2左右。

〈样品S1、S2的己糖基神经酰胺的比较〉

其次，调查己糖基神经酰胺(HexCer)的组成及含量。

键结在HexCer上的单糖通常为葡萄糖或半乳糖，可按顺序从相色谱分析的溶出位置推测所含有的单糖。葡萄糖基神经酰胺(GlcCer)中，

GlcCer(NS)较添加的内部标准GlcCer(NS)12.0更早地溶出，

半乳糖基神经酰胺GalCer与内部标准GlcCer(NS)12：0相同或更晚地溶出。

根据这些，在S1、S2样品HexCer中检测出两者，但GalCer占绝对多数。

像图2所示一样，键结在神经酰胺上的脂肪酸中，存在

不含羟基(-OH)的(N)、及它键结在2(α)位上的(A)。

图5是表示S1、S2样品GalCer的质谱的图表。

图5的左侧是GalCer(NS)的质谱，右侧是GalCer(AS)的质谱，分别表示从样品S1、S2中萃取的脂质的数据。

另外，波峰上部的标记上段表示

GalCer中所含的总碳数：含有鞘氨醇作为鞘氨醇碱时的脂肪酸中所含的双键数，

标记下段表示波峰的m／z值。

*标记表示在GalCer(AS)的溶出位置，为了峰拖尾而混合存在的GalCer(NS)的波峰。

像图5所示一样，可知S1、S2样品中同时存在HexCer(NS)及HexCer(AS)。

由串联质量分析所获得的产品离子光谱中，

HexCer的特征是，含有链长18的人体型鞘氨醇的C48、C50、C52(脂肪酸的链长分别为24、26、28)等长链侧的分子种组成比高于神经酰胺。

图6是表示样品S1、S2中所含的HexCer的的分子种组成的图表。

横轴表示总碳数：含有鞘氨醇作为鞘氨醇碱时的脂肪酸中所含的双键数。

纵轴表示每1g样品(S1、S2)的HexCer分子种中所含的神经酰胺部分的质量(μg)。

图6中，表示以水解前添加的天然完全不存在的GlcCer(NS)12：0(m／z＝644)作为内部标准，

研究HexCer分子种组成的结果。

GalCer(NS)的特征是，与神经酰胺中含量最高的C40：1(主要包含链长16的鞘氨醇及脂肪酸C24：1)对应的C46(糖的碳数仅大6)及与它相比链长仅长2的C48：1(主要包含链长18的鞘氨醇及脂肪酸C24：1)较多(后述的图7(a)及图5)。

此外，已知这种GalCer(NS)C48的结构与人体的GalCer(NS)的通常的主成分的结构相同。

已知，GalCer(AS)主要由C44至C50的长链分子种所构成，

具有神经酰胺分子种中含量最高的C40作为骨架的C46分子种的含量最高。从以上的结果获知，GalCer的长链分子种较多，人体型背链长18的神经酰胺的含量多于神经酰胺自身。

与GalCer相比，GlcCer为微量成分，有分子种分布类似的倾向。

〈样品(S1、S2)中所含的神经酰胺、HexCer的含量〉

表1中，表示从图4及图6的数据算出每1g样品中所含的神经酰胺的质量(μg)的结果。可以从表1获知，含有与神经酰胺相比多约4倍的HexCer。

[表1]

表1

〈考察〉

根据以上的结果获知，在从鳗鱼头部制造的粉末中，每1g样品含有6μg左右的神经酰胺成分。

图7是表示样品中所含的鞘磷脂的质谱的图表，标记表示总碳数(较对应的神经酰胺仅大5)：含有鞘氨醇作为鞘氨醇碱时的脂肪酸中所含的双键数。

在样品还含有较神经酰胺、HexCer更多的鞘磷脂成分，

鞘磷脂在这次使用的串联质量分析法中难以断裂，

现在，无法充分地获得鞘磷脂的神经酰胺骨架的结构信息，

像图7所示一样，表示和神经酰胺非常类似的波峰强度分布，经C45：1标记的波峰和神经酰胺的C40对应。如果含有来自鞘磷脂的神经酰胺，则样品中存在更多的神经酰胺。

链长18及16的总鞘氨醇的含量的准确比率可通过对分解鞘脂而获得的鞘氨醇进行定量来获得。

通过这次的调查，获知在样品中的神经酰胺的鞘氨醇骨架中含有链长18的人体型约40％。

神经酰胺等的鞘脂作为补充物而受到关注，包含人体型神经酰胺的原料缺乏。

在最近的研究中也报告了，消化非人体型神经酰胺并被小肠上皮所吸收，但吸收的非人体型鞘氨醇碱通过特异的运载体排泄到管腔侧，含有人体型神经酰胺的原料的开发较为重要。

本发明的包含来自鳗鱼的神经酰胺成分的粉末的意义是工业上的可利用性极高。

〈样品(经喷雾干燥装置粉末化的粉末)的分析〉

另外，以下表示依靠外部机构获得的经喷雾干燥装置粉末化的粉末的分析结果。

图8是财团法人浜松药剂师会的检查结果。

根据这份试验检查成绩单，报告了在100g样品中含有1960g羟基脯氨酸的结果。

羟基脯氨酸是胶原蛋白的主要成分，和脯氨酸一样负责胶原蛋白的稳定性。

胶原蛋白具有氨基酸连结成链状的分子量约10万的多肽分子聚集成3条链的螺旋结构，它形成纤维状或膜状的结构体。

现在，除特定蛋白质的定量困难以外，胶原蛋白的结构因起源等而不同，因此还无法测定胶原蛋白本身。

另一方面，构成胶原蛋白的氨基酸的种类及数极具特性性，作为它的特征之一，包含不包含在构成通常的蛋白质的20种基本氨基酸内的羟基脯氨酸或羟基离氨酸等氨基酸。

这些氨基酸是只包含在胶原蛋白及仅限和它类似的蛋白质中的特殊氨基酸，特别是羟基脯氨酸约占胶原蛋白中的所有氨基酸的10％。因此，可认为羟基脯氨酸为胶原蛋白量的标准。

本申请案中，前述样品的分析结果达成包含羟基脯氨酸的结果，因此，可确认胶原蛋白的存在。

另外，图9～图11是针对相同样品的一般财团法人日本食品分析中心的检查结果。

根据这份分析试验成绩单，报告了在分子量范围内区分样品来测定各自的分子量分布的结果(图9)。

也就是，像图10所示一样，在分析样品中添加预先设想的6种标准溶液，通过高效液相色谱法测定溶出时间(图11)。从该结果获知，样品中，分子量大的(例如1000以上)为57％，分子量小的(例如未达1000)为43％。

分子量大的从图8的结果推测为胶原蛋白，

分子量小的从图3～图7的结果推测为神经酰胺。

因此，获知本发明的来自鳗鱼的粉末包含胶原蛋白及人体型神经酰胺。

在本发明的来自鳗鱼的粉末中，包含相同的来自鳗鱼的胶原蛋白及人体型神经酰胺的两者，可用在补充物或化妆品中。在使用本发明的来自鳗鱼的粉末的情形下，可同时摄取胶原蛋白及人体型神经酰胺，因此较佳。

[产业上的可利用性]

鳗鱼头部及骨部的处理也是废弃物处理的重要手段，本发明也是有效利用未使用资源的重要技术。本发明也提供廉价且高效地制造包含胶原蛋白及神经酰胺成分的粉末的方法、及有效地使用包含所获得的胶原蛋白及神经酰胺成分的粉末的方法，产业上的可利用性较高。