本发明涉及一种可有效促进钙吸收的益生菌发酵补钙制剂及其制备方法，属于功能食品技术领域。
背景技术：
钙是人体含量最丰富、不可或缺的无机元素。 人体中的钙99％沉积在骨骼和牙齿中，促进其生长发育，维持其形态与硬度。 l％存在于血液和软组织细胞中，如钙离子对血液凝固有重要作用，缺钙时血凝发生障碍，人体会出现各种出血症状；钙离子对神经、肌肉的兴奋和神经冲动的传导有重要作用，缺钙时人体会出现神经传导阻滞和肌张力异常等症状；钙离子对细胞的粘着、细胞膜功能的维持有重要作用，缺钙时则不能保证细胞膜顺利地把营养物质“泵”到细胞内；钙离子对人体内的酶反应有激活作用，钙缺乏即会影响正常的生理代谢过程。
目前我国城市居民平均每日钙摄入量只有４００毫克左右，距中国营养学会制定的推荐摄入量８００毫克至１０００毫克相差甚远，９０％左右人群钙摄入量严重不足，出现这种现象的因素很多，如膳食结构不合理，蔬菜中的草酸、膳食纤维也会阻止钙质的吸收；不良的饮食习惯，吸烟、喝酒、常喝碳酸饮料（这些都能造成人体酸性化，使人体中的钙流失；而碳酸饮料中还含有磷酸，能造成体内钙磷比例失调，直接阻止钙的吸收。），常喝浓茶（茶水中的茶碱能阻止人体对钙的吸收），常喝咖啡（咖啡因能促使体内钙的流失和尿钙排出增多），高盐摄食（使尿钙排出增多而大量流失）；特殊的生理病理需求，更年期的妇女（雌激素水平突然减少，骨钙被溶解，脱离骨骼的速度就会加快），糖尿病会引起骨质疏松（糖尿病患者血液中的胰岛素水平很低，而胰岛素可刺激骨胶原蛋白的形成，帮助骨骼留住钙质和重建）。
因此，增加人们的钙的摄入和吸收，刻不容缓。现有钙产品主要分为无机钙和有机钙，无机钙包括碳酸钙、氯化钙、磷酸钙等，其优点是含钙量高，缺点是其吸收要靠胃酸的参与，对胃有刺激作用；有机钙包括柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄酸钙、醋酸钙、胶原蛋白络合钙等，其含钙低，但吸收好。另外，含钙产品中往往添加一些促吸收因子，如维生素D、大豆异黄酮、酪蛋白磷酸肽、水苏糖、益生元、双歧因子等。
现有与补钙相关的专利虽多，但存在的问题亦很多。有的专利产品中所用原料含不同动物的骨骼，因为重金属等有毒物质易沉积于动物骨骼中，人若长期服用，易造成二次中毒，如：公布号 CN104397359（一种氨基酸螯合钙组合物及其制备方法）、CN1181244（一种保健口服液）、CN100534329（一种钙营养强化剂及其生产工艺）、CN103330128（一种促进女性补钙及吸收的生食谷疏营养米粉及其生产工艺）、CN103340413（一种骨外壁乳酸菌发酵骨钙粉的制备方法）等。
有的专利产品则盲目的加入钙、铁、锌等矿物元素，以求同补或相互促进吸收，但研究发现钙、铁、锌等元素在吸收过程中相互竞争抑制，彼此干扰，不宜同时补充，如：公布号CN104522657（一种补充多种矿物质的保健食品）、CN1568798（易吸收自动调节强化骨钙药食兼用钙营养素产品及制造方法）、CN101513259（一种补钙产品）等。
有的专利产品是将无机钙或有机钙与能促进钙吸收的物质进行调配，促进吸收的物质主要为维生素D、酪蛋白磷酸肽、大豆异黄酮、益生元、益生菌等，但其产品是将各种原料进行简单的配比、混合，口感、功效往往不尽人意，亦有许多适用人群的限制，如：公布号CN1209047（大豆异黄酮饮料的加工方法）是将乳酸钙与大豆异黄酮调配；CN101322835（一种复合型补钙制剂）由碳酸钙、盐酸氨基葡萄糖、酪蛋白磷酸肽、大豆异黄酮调配；CN102302116（一种补钙、锁钙保健食品及其制备方法）由钙、初乳碱性蛋白、硫酸软骨素、D-氨基葡萄糖、维生素D、酪蛋白磷酸肽组成；CN102630946（一种适用于女性的珍珠大豆钙软胶囊及其制备方法）由大豆提取物、碳酸钙、珍珠粉组成；CN103750310（一种补钙、促进钙吸收的植物钙及其制备方法）由无水葡萄糖、乳粉、白砂糖、麦芽糊精、柠檬酸钙、聚葡萄糖、低聚半乳糖、氧化镁、酪蛋白磷酸肽、山药、黄瓜籽混合制成；CN105166938（一种酪蛋白骨元钙复合益生菌制剂）由低聚半乳糖、酪蛋白磷酸肽、骨元钙、益生菌混合制成；CN105055458（防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方法）由纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉、碳酸钙组成。
另外专利CN104211826（一种低聚果糖钙及含有低聚果糖钙的口服液）、CN104223067（一种菊粉钙及含有菊粉钙的口服液）是将低聚果糖或菊粉依次进行碱化、醚化后，与钙离子螯合制得，为化工合成的产品，不宜被人们所接受。
现有专利中也有通过添加益生菌菌粉来促进钙吸收，而益生菌要想发挥作用，必须能定殖于人体肠道内，大多数菌体很难有效定殖，势必影响钙的吸收效果。
技术实现要素：
为了解决现有钙产品有副作用、安全隐患、功效价值有限等缺点，本发明提供了一种益生菌发酵补钙制剂，所述制剂由精选黄豆生芽处理，经胶体磨磨碎，添加一定量的水，高压提取后经酶解处理，添加葡萄糖、蛋白胨、碳酸钙，灭菌后经多株益生菌发酵，离心取离心液，添加甜味剂、益生元，灭菌即得到益生菌发酵补钙制剂。
所述制剂中精选黄豆在益生菌发酵补钙制剂中的重量g/体积ml百分比为2~6%。
所述葡萄糖的加入量为重量g/体积ml百分比4~10%，蛋白胨的加入量为重量g/体积ml百分比0.1~0.5%，碳酸钙的加入量为重量g/体积ml百分比1~5%。
所述益生菌为双歧杆菌和乳杆菌。
所述双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌或婴儿双歧杆菌；所述乳杆菌选自干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌。
所述甜味剂为塔格糖，益生元为低聚果糖浆。
所述塔格糖的加入量为重量g/体积ml百分比3%；所述低聚果糖浆含量规格为G 55L，加入量为重量g/体积ml比0.1~0.7%。
本发明的另一个目的是提供一种益生菌发酵补钙制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）提取：精选干黄豆，生芽处理，向豆芽中加入适量水，经胶体磨磨碎，115℃高压提取60分钟；
（2）酶解：待温度降至45±2℃时，维持恒温，用氢氧化钠调节pH至8.0，加入胰酶，当pH降至7.5时，加入中性蛋白酶，当pH降至7.0时，结束酶解，按比例加入葡萄糖、蛋白胨、碳酸钙，115℃高压灭菌60分钟，得无菌酶解液；
（3）接种、发酵：当无菌酶解液温度降至39±2℃时，于无菌条件下接种预培养的体积百分比为1%的一种双歧杆菌菌液和体积百分比各为0.5%的两种乳杆菌菌液，37℃培养48~72小时，当pH值降至4.2时，降低发酵温度至28℃，继续发酵至pH值降至4.0，结束发酵，即得益生菌发酵液；
（4）离心、灭活：将步骤（3）得到的益生菌发酵液过管式离心机过滤、离心，得益生菌发酵液离心液；向益生菌发酵液离心液中加入甜味剂、益生元，搅匀溶解，定容，121℃灭菌30分钟，无菌灌装，即得益生菌发酵补钙制剂。
上述制备方法中，在步骤（1）中所述生芽处理是指将精选黄豆在水中室温浸泡5~10小时，于28℃培育，当芽长2~4厘米时，结束发芽。
上述制备方法中，在步骤（2）中所述的胰酶、中性蛋白酶均为市售；其中胰酶用量为干黄豆重量的1%，中性蛋白酶用量为干黄豆重量的0.1%。
通过上述制备方法制备的补钙制剂，以元素钙计算含量约为6~10mg/ml，总异黄酮苷原的含量为0.09~0.15mg/ml。（见实验例1）
可将本发明的益生菌发酵补钙制剂，按照已知的常规方法，添加一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他功能成份或其混合物，如维生素D、大豆异黄酮、酪蛋白磷酸肽、水苏糖、益生元、双歧因子等促钙吸收剂，配制成适于口服的合剂、乳剂等。
也可将本发明的益生菌发酵补钙制剂通过适当的干燥方法，制得固体粉末，添加一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他功能成份或混合物，如维生素D、大豆异黄酮、酪蛋白磷酸肽、水苏糖、益生元、双歧因子等促钙吸收剂，配制成适于口服的胶囊、片剂、颗粒剂等剂型。
本发明的有益效果：
1、本发明将黄豆进行发芽处理，发芽黄豆的异黄酮含量比未发芽黄豆增加约4倍；以黄豆芽磨碎后作为益生菌发酵培养基，带原料渣进行发酵，将异黄酮转化为异黄酮苷原，直接被人体吸收，将更加有效的促进钙的吸收。
2、本发明利用现代酶解技术，将黄豆经发芽磨碎高压提取后，进行酶解，使豆芽中的高分子物质分解为小分子物质，一方面易于人体吸收，另一方面可使制剂的状态稳定。
3、本发明利用益生菌乳杆菌发酵将无机碳酸钙转化为有机乳酸钙，更易于人体对钙的吸收，安全、无副作用。
4、本发明模拟人体肠道环境，利用多株益生菌共生发酵技术，体外发酵代谢，次级代谢产物直接作用于人体肠道，有效解决了益生菌难于定殖肠道发挥作用的弊端，起到调节肠道环境，促进钙吸收。
5、本发明所选甜味剂为塔格糖，其甜度为蔗糖的92%，热量为蔗糖的1/3，还具有降血糖的功效，既满足了甜度的要求，又可被对血糖有严格控制的特殊人群饮用，使得本补钙制剂适用人群更加广泛。
6、本发明未添加任何添加剂和防腐剂，经高温灭菌、无菌灌装，保质期长，是安全、绿色、环保的有机健康补钙制剂。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内，实施例中所述物料，均符合相应国家标准。
实施例1：益生菌发酵补钙制剂A的制备
具体制备方法如下：
（1）提取：精选干黄豆2kg，生芽处理，向豆芽中加入100L水，经胶体磨磨碎，115℃高压提取60分钟；
（2）酶解：待温度降至45±2℃时，维持恒温，用氢氧化钠调节pH至8.0，加入胰酶20g，当pH降至7.5时，加入中性蛋白酶2g，当pH降至7.0时，结束酶解，加入葡萄糖10%（重量g/体积ml），蛋白胨0.2%（重量g/体积ml），碳酸钙2%（重量g/体积ml），115℃高压灭菌60分钟，得无菌酶解液；
（3）接种、发酵：当无菌酶解液温度降至39±2℃时，于无菌条件下接种预培养的短双歧杆菌（AS 1.2213）菌液1%（体积百分比）、鼠李糖乳杆菌（AS 1.22）菌液0.5%（体积百分比）、植物乳杆菌（AS 1.19）菌液0.5%（体积百分比），37℃培养60小时，pH值降至4.2，降低发酵温度至28℃，继续发酵至pH值降至4.0，结束发酵，即得益生菌发酵液；
（4）离心、灭活：将步骤（3）得到的益生菌发酵液过管式离心机过滤、离心，得益生菌发酵液离心液；向益生菌发酵液离心液中加入塔格糖3%（重量g/体积ml）、低聚果糖0.2%（重量g/体积ml），搅匀溶解，定容，121℃灭菌30分钟，无菌灌装，即得益生菌发酵补钙制剂A。
实施例2：益生菌发酵补钙制剂B的制备
具体制备方法如下：
（1）提取：精选干黄豆4kg，生芽处理，向豆芽中加入100L水，经胶体磨磨碎，115℃高压提取60分钟；
（2）酶解：待温度降至45±2℃时，维持恒温，用氢氧化钠调节pH至8.0，加入胰酶40g，当pH降至7.5时，加入中性蛋白酶4g，当pH降至7.0时，结束酶解，加入葡萄糖8%（重量g/体积ml），蛋白胨0.4%（重量g/体积ml），碳酸钙3%（重量g/体积ml），115℃高压灭菌60分钟，得无菌酶解液；
（3）接种、发酵：当无菌酶解液温度降至39±2℃时，于无菌条件下接种预培养的青春双歧杆菌（AS 1.2190）菌液1%（体积百分比）、植物乳杆菌（AS 1.19）菌液0.5%（体积百分比）、干酪乳杆菌（CGMCC1.2884）菌液0.5%（体积百分比），37℃培养48小时，pH值降至4.2，降低发酵温度至28℃，继续发酵至pH值降至4.0，结束发酵，即得益生菌发酵液；
（4）离心、灭活：将步骤（3）得到的益生菌发酵液过管式离心机过滤、离心，得益生菌发酵液离心液；向益生菌发酵液离心液中加入塔格糖3%（重量g/体积ml）、低聚果糖0.4%（重量g/体积ml），搅匀溶解，定容，121℃灭菌30分钟，无菌灌装，即得益生菌发酵补钙制剂B。
实施例3：益生菌发酵补钙制剂C的制备
具体制备方法如下：
（1）提取：精选干黄豆6kg，生芽处理，向豆芽中加入100L水，经胶体磨磨碎，115℃高压提取60分钟；
（2）酶解：待温度降至45±2℃时，维持恒温，用氢氧化钠调节pH至8.0，加入胰酶60g，当pH降至7.5时，加入中性蛋白酶6g，当pH降至7.0时，结束酶解，加入葡萄糖6%（重量g/体积ml），蛋白胨0.5%（重量g/体积ml），碳酸钙4%（重量g/体积ml），115℃高压灭菌60分钟，得无菌酶解液；
（3）接种、发酵：当无菌酶解液温度降至39±2℃时，于无菌条件下接种预培养的短双歧杆菌（AS 1.2213）菌液1%（体积百分比）、干酪乳杆菌（CGMCC1.2884）菌液0.5%（体积百分比）、鼠李糖乳杆菌（AS 1.22）菌液0.5%（体积百分比），37℃培养72小时，pH值降至4.2，降低发酵温度至28℃，继续发酵至pH值降至4.0，结束发酵，即得益生菌发酵液；
（4）离心、灭活：将步骤（3）得到的益生菌发酵液过管式离心机过滤、离心，得益生菌发酵液离心液；向益生菌发酵液离心液中加入塔格糖3%（重量g/体积ml）、低聚果糖0.6%（重量g/体积ml），搅匀溶解，定容，121℃灭菌30分钟，无菌灌装，即得益生菌发酵补钙制剂C。
实验例1：
本实验例旨在通过对本发明的益生菌发酵补钙制剂进行功效成分含量测定，以确定本发明补钙制剂的人体使用量。
1. 元素钙含量测定
本实验参照GB 25555-2010 L-乳酸钙标准进行，略有改进，原理为在碱性条件下，样品消耗络合剂乙二胺四乙酸二钠标准滴定液的体积计算元素钙含量，用钙试剂羧酸钠指示剂的颜色变化判断滴定的终点。具体操作如下：
1.1 试剂和材料
氢氧化钠溶液：100g/L；
盐酸溶液：1+4；
乙二胺四乙酸二钠标准滴定液：c=0.05mol/L；
钙试剂羧酸钠指示剂：称取0.1g钙试剂羧酸钠盐，加10g在约110℃干燥过的氯化钠研磨，混匀。
1.2 实验步骤
量取样品7ml，加入已加有2ml盐酸溶液的50ml水中，边搅拌边滴加15ml乙二胺四乙酸二钠标准滴定液，再加5ml氢氧化钠溶液和0.1g钙试剂羧酸钠指示剂，用乙二胺四乙酸二钠标准滴定液滴定至溶液呈蓝色为终点。
1.3结果计算
元素钙的重量mg/体积ml百分比为w%：
w%=(V1*cM/1000*V2)*100%
注：V1：样品消耗乙二胺四乙酸二钠标准滴定液的体积（单位ml）；
V2：样品体积（单位ml）；
c：乙二胺四乙酸二钠标准滴定液摩尔浓度（单位mol/L）；
M：元素钙的摩尔质量（单位g/mol）。
1.4结果
由表1可知：三个实施例制剂A、B、C中元素钙的含量（mg/ml）分别为9.81、8.56、6.38，其含量范围约为6~10mg/ml，根据中国营养学会制定的推荐摄入量８００毫克至１０００毫克，可确定本品的饮用量为100ml/天，便可满足人体钙的需求量。
表1 益生菌发酵补钙制剂A、B、C元素钙的含量
2 总异黄酮苷原含量测定
本实验参照GB/T 23788-2009（保健食品中大豆异黄酮的测定方法-高效液相色谱法）标准进行，以大豆素、大豆黄素、染料木素为标准品进行总异黄酮苷原含量测定，以未发酵与实施例1-3相同浓度的黄豆提取液分别作为对照组A、对照组B和对照组C。
2.1方法
采用HPLC法进行测定，色谱条件为C18柱（250mm×4.6mm，5um）；柱温：30℃；流动相A：乙腈；流动相B：磷酸水溶液（pH3.0）；流速：1.0ml/min；测定波长：260nm；进样量：10ul。
2.2 结果
由表2可知：三个实施例制剂A、B、C中总异黄酮苷原的含量（mg/ml）分别为0.09、0.12、0.15，其含量范围约为0.09~0.15mg/ml，而对照组异黄酮苷原的含量均为0，表明益生菌可将大豆异黄酮转化为异黄酮苷原，直接被人体吸收，提高了促进钙吸收的效率。
表2 益生菌发酵补钙制剂A、B、C总异黄酮苷原的含量
实验例2：
本实验例旨在通过测定本发明的黄豆经发芽、酶解处理前后的总可溶性小分子物质的变化，来说明本发明可将高分子物质转化为易于人体吸收的小分子物质。
本实验参照GB 22494-2008 大豆肽粉标准进行，略有改进，其原理为高分子蛋白质在酸性条件下易被沉淀，相对分子质量较小的蛋白质水解物可溶于酸性溶液（包括肽和游离氨基酸），经酸化后，去除沉淀，比较样品处理前后总可溶性含氮物质的多少，以确定变化情况。
1 方法
取相同重量的干黄豆，一组进行发芽，胶体磨破碎，高温提取，酶解处理；一组胶体磨破碎，高温提取；取相同体积的处理液，加入适量15%三氯乙酸，混匀并静置5min，离心去除沉淀，滤液备用，按GB 22494-2008中B.4.1.2~B.4.1.4操作步骤进行，测定计算总可溶性含氮物质。
2 结果
由表3可知，处理前小分子的可溶性肽和游离氨基酸的总量为2.1mg/g(干黄豆)，处理后含量为20.2mg/g(干黄豆)，是未处理组的约10倍，说明本发明可将高分子物质转化为易于人体吸收的小分子物质。
表 3 黄豆经发芽、酶解处理前后总可溶性含氮物质含量