具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液及其制备与应用的制作方法

本发明属于保健的技术领域，涉及一种具有抗氧化、抗肿瘤活性的复合多糖口服液及其制备方法与应用。

背景技术：

香菇、银耳等食用菌不但有丰富的营养物质，还含有较多的功能性组分，含有种类多样的矿质元素，丰富微量元素以及多种生物大分子。真菌中含有多种药物成分，譬如多糖、氨基酸、黄酮类、维生素、生物碱、甾醇和抗生素等，因而食用菌对人体健康大有好处，这使其成为天然产物化学研究的热门领域。真菌多糖及其衍生物具有多种生物学功能，例如抗氧化功能、活化免疫细胞、细胞特异性识别、细胞表面受体对抗原和药物的耐受性等。综上，真菌营养丰富，各功能性物质齐全，具有较好的药用和保健价值。我国食用菌种类多，产量大，而且随着人口老化，相关保健品的发展前景大，食用菌具有很大的发展潜力。真菌多糖以其多方面的生物活性和安全无毒副作用而备受青睐，人们近年来开始重视真菌多糖的开发，研制出一系列药品和保健品，在传统的丸、汤剂基础上又开发了针剂、冲剂、片剂、胶囊、糖浆乃至保健口服液、饮品、速溶茶、酒饮料等各种产品。

真菌多糖由于其具有显著的抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗炎、降压降脂、抗衰老的等作用，而越发受到国内外研究的关注，进而推动了其在食品、保健品、医药、生物等领域的应用。以往的研究，各方面更多是局限在对单一种类真菌多糖的抗肿瘤、抗氧化的活性研究，而有关复合真菌多糖的研究还比较少。但一种真菌多糖通常只对某一种生理效应有作用或效果不明显。而复合多糖的作用并非是单味多糖成分的简单相加，各成分间存在着相辅相成、相互为用的关系，其相加、协同或拮抗作用不容忽视。多糖口服液的生产主要集中在单一组分，而未见香菇、银耳、茯苓、雪莲等复合多糖生产的口服液，这种复合多糖口服液的方法具有纯度高和功效好等多种优越性，对开发一种复合多糖口服液法具有重要意义；对于物质的效价分析，目前的研究多集中在某种物质中单一成分具有的功能性，而对于产品具有的功效的研究很少见，但是进入市场的是以产品的方式，因此产品的功效更加具有价值。

技术实现要素：

针对目前少有对功能性复合多糖口服液进行研究分析的现状，本发明的目的在于提供一种具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液。所述复合多糖口服液具有纯度高、抗氧化，抗肿瘤功效好等多种优越性。

本发明的另一目的在于提供上述具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液，由复合多糖、甜味剂、酸味剂、防腐剂和水组成。

所述复合多糖由以下按重量份数计的原料制备而成：

香菇10～30份、银耳10～30份、枸杞10～30份、黄芪10～30份。

所述香菇、银耳、枸杞、黄芪的质量比优选为1:1:2:2。

所述复合多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：

将香菇、银耳、枸杞、黄芪分别进行烘干、粉碎，得到各原料的干粉，备用；

步骤(1)中所述烘干是指在40～60℃烘干至恒重；

(2)粗多糖提取：

将香菇、枸杞、黄芪的干粉进行混合，得到混合料；将混合料加入水中加热提取，取上层清液，抽滤，得到粗多糖提取液；

步骤(2)中所述混合料与水的质量体积比为1g：(30～50)ml；所述加热提取的条件为80～100℃下微沸后调温至50～70℃提取2～4h；

(3)银耳多糖提取：

将银耳干粉加入水中加热提取，取上层清液，抽滤，得到银耳多糖提取液；

步骤(3)中所述银耳干粉与水的质量体积比为1g：(30～50)ml；所述加热提取的条件为80～100℃下微沸后调温至50～70℃提取2～4h；

(4)将步骤(2)的粗多糖提取液和步骤(3)的银耳多糖提取液进行混合，浓缩，脱色，脱蛋白、去除小分子低聚糖、离心、将沉淀物干燥，得到干品复合多糖。

步骤(4)中所述干燥的温度为55～70℃，所述干燥的时间为24～36h。

步骤(4)中所述脱色是指将浓缩后的浓缩液加入D354FD树脂中，于50～70℃水浴2～4h，每隔一段时间进行搅拌脱色。所述D354FD树脂与浓缩液的体积比为1:1。

步骤(4)中所述脱蛋白是指将脱色后的复合多糖溶液与Sevag试剂混合，剧烈震荡20～30min，静置至溶液分三层，上层为多糖溶液、中间层为变性蛋白、下层为有机试剂；收集上层多糖溶液，重复上述步骤直到无变性蛋白出现。所述脱色后的复合多糖溶液与Sevag试剂的体积比为4:1。

步骤(4)中所述去除小分子低聚糖是指将脱蛋白的多糖溶液加入无水乙醇，低温放置，析出多糖并除去小分子低聚糖。所述脱蛋白的多糖溶液与无水乙醇的体积比1:4。所述低温放置是指4℃冰箱中静置12～18h。

步骤(4)中所述离心的条件为于3000～4000rpm离心5～10min。

所述具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液，由复合多糖、甜味剂、酸味剂、防腐剂和水组成；其中复合多糖的含量为(1.0～3.0)g/100mL、甜味剂的含量为(4.0～6.0)g/100mL、酸味剂的含量为(0.16～0.18)g/100mL、防腐剂的含量为(0.01～0.02)g/100mL。

所述具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合多糖的制备

(2)将复合多糖、甜味剂、酸味剂、防腐剂和水进行混合，调节PH到5～6后进行均质，灭菌，灌装，得到具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液。

步骤(2)中所述的甜味剂为蔗糖，酸味剂为柠檬酸，所述防腐剂为山梨酸钾。所述调节pH的物质为柠檬酸。

所述具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液在抗氧化抗肿瘤活性领域的应用，特别用于抗氧化抗肿瘤活性药品和保健品领域。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)通过对本发明的复合多糖口服液产品的效价分析，本发明制备的复合多糖口服液具有明显抗氧化作用和抗肿瘤活性；

(2)本发明的复合多糖口服液具有纯度高和功效好等多种优越性；并且本发明的方法简单，可操作性强。

附图说明

图1为实施例1(即配方1)和对比例1～3制备的复合多糖口服液的抗氧化活性效果对比图，其中(a)为实施例1和对比例1～3制备的复合多糖口服液对DPPH·自由基以及OH·自由基的清除率的对比图，(b)为实施例1和对比例1～3制备的复合多糖口服液FRAP值对比图；

图2为实施例1(即配方1)和对比例1～3制备的复合多糖口服液对肝癌细胞抑制作用对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步阐明本发明，但本发明的实施方式不限于此。

本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备

主要材料：香菇、银耳、枸杞、黄芪、蒸馏水、山梨酸钾、蔗糖、柠檬酸。

主要仪器与试剂：粉碎机、玻璃棒、旋转蒸发仪、恒温水浴锅、加热套、PH电极；D354FD、无水乙醇、DMEM完全培养基。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1

一种具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将香菇、银耳、枸杞、黄芪分别于50℃烘干至恒重、粉碎，得到各原料的干粉，备用；

(2)粗多糖提取：将10g香菇、20g枸杞、20g黄芪的干粉进行混合，得到混合料；将混合料加入水中加热提取(100℃条件下微沸后调温至50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到粗多糖提取液；所述混合料与水的质量体积比为1g:30ml；

(3)银耳多糖提取：将10g银耳干粉加入水中加热提取(100℃条件下微沸后调温至50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到银耳多糖提取液；所述银耳干粉与水的质量体积比为1g：30ml；

(4)将步骤(2)的粗多糖提取液和步骤(3)的银耳多糖提取液进行混合，真空浓缩至200ml，加入等体积的预处理过的D354FD树脂中，60℃水浴脱色3h，每隔20min进行搅拌；将脱色后的复合多糖溶液与Sevag试剂按体积比4:1混合，剧烈震荡20～30min，静置到溶液分三层，上层为多糖溶液、中间层为变性蛋白、下层为有机试剂，收集上层多糖溶液，重复脱色后的步骤直到无变性蛋白出现；将脱色、脱蛋白后的复合多糖溶液浓缩至200ml，加入无水乙醇中(浓缩液与乙醇的体积比1:4)，4℃冰箱过夜(12h)，析出多糖并除去小分子低聚糖，4000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀絮状物收集在55℃干燥箱中干燥至恒重，得到干品的复合多糖；

(5)将复合多糖、蔗糖、柠檬酸、山梨酸钾进行调配，调节PH到5.5后进行均质，余量为水，配制100ml溶液；将配制好的溶液于高温高压灭菌后灌装于灭菌后的10mL棕色玻璃瓶，封口，即得复合多糖口服液；所述复合多糖口服液具体配方为：2.0g复合多糖、5.0g的蔗糖、0.17g的柠檬酸、0.01g的山梨酸钾，计为配方1。

本实施例制备的复合多糖口服液(配方1)具有如下典型的质量指标和相应的口感指标：

感官指标：澄清的淡黄色液体，微甜；

理化指标：相对密度：1.09；口服液pH值：5.5

微生物限度：细菌数每1ml未超过100cfu；霉菌和酵母菌数每1ml未超过100cfu；大肠埃希菌每1ml未检出；均符合口服溶液限度规定。

配方1对DPPH·自由基、OH·自由基的清除率分别为69.23％，61.71％，FRAP值为3.93mmol/L；对肝癌细胞的抑制率为63.98％。

实施例2

一种具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将香菇、银耳、枸杞、黄芪分别于50℃烘干至恒重、粉碎，得到各原料的干粉，备用；

(2)粗多糖提取：将15g香菇、15g枸杞、15g黄芪的干粉进行混合，得到混合料；将混合料加入水中加热提取(100℃条件下微沸后调温至50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到粗多糖提取液；所述混合料与水的质量体积比为1g:30ml；

(3)银耳多糖提取：将15g银耳干粉加入水中加热提取(100℃条件下微沸后调温至50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到银耳多糖提取液；所述银耳干粉与水的质量体积比为1g:30ml；

(4)将步骤(2)的粗多糖提取液和步骤(3)的银耳多糖提取液进行混合，真空浓缩至200ml，加入等体积的预处理过的D354FD树脂中，60℃水浴脱色3h，每隔20min进行搅拌；将脱色后的复合多糖溶液与Sevag试剂按体积比4:1混合，剧烈震荡20～30min，静置到溶液分三层，上层为多糖溶液、中间层为变性蛋白、下层为有机试剂，收集上层多糖溶液，重复脱色后的步骤直到无变性蛋白出现；将脱色、脱蛋白后的复合多糖溶液浓缩至200ml，再按体积比1:4加入无水乙醇中，4℃冰箱过夜(12h)，析出多糖并除去小分子低聚糖，4000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀絮状物收集在55℃干燥箱中干燥至恒重(36h)，得到干品的复合多糖；

(5)将复合多糖、蔗糖、柠檬酸、山梨酸钾进行调配，调节PH到5.5后进行均质，余量为水，配制100ml溶液；将配制好的溶液于高温高压灭菌后灌装于灭菌后的10mL棕色玻璃瓶，封口，即得复合多糖口服液；所述复合多糖口服液具体配方为：2.0g复合多糖、5.0g的蔗糖、0.17g的柠檬酸、0.01g的山梨酸钾，计为配方2。

配方2对DPPH·自由基、OH·自由基的清除率分别为52.41％，48.65％，FRAP值为2.78mmol/L；对肝癌细胞的抑制率为52.75％。

实施例3

一种具有抗氧化抗肿瘤活性的复合多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将香菇、银耳、枸杞、黄芪分别于50℃烘干至恒重、粉碎，得到各原料的干粉，备用；

(2)粗多糖提取：将20g香菇、20g枸杞、10g黄芪莲的干粉进行混合，得到混合料；将混合料加入水中加热提取(100℃条件下微沸后调温至50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到粗多糖提取液；所述混合料与水的质量体积比为1g:30ml；

(3)银耳多糖提取：将10g银耳干粉加入水中加热提取(100℃条件下微沸后转到50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到银耳多糖提取液；所述银耳干粉与水的质量体积比为1g:30ml；

(4)将步骤(2)的粗多糖提取液和步骤(3)的银耳多糖提取液进行混合，真空浓缩至200ml，加入等体积的预处理过的D354FD树脂中，60℃水浴脱色3h，每隔20min进行搅拌；将脱色后的复合多糖溶液与Sevag试剂按体积比4:1混合，剧烈震荡20～30min，静置到溶液分三层，上层为多糖溶液、中间层为变性蛋白、下层为有机试剂，收集上层多糖溶液，重复脱色后的步骤直到无变性蛋白出现；将脱色、脱蛋白后的复合多糖溶液浓缩至200ml，加入无水乙醇中(复合多糖浓缩液与乙醇的体积比1:4)，4℃冰箱过夜(12h)，析出多糖并除去小分子低聚糖，4000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀絮状物收集在55℃干燥箱中干燥至恒重(36h)，得到干品的复合多糖；

(5)将复合多糖、蔗糖、柠檬酸、山梨酸钾行调配，调节PH到5.5后进行均质，余量为水，配制100ml溶液；将配制好的溶液于高温高压灭菌后灌装于灭菌后的10mL棕色玻璃瓶，封口，即得复合多糖口服液；所述复合多糖口服液具体配方为：2.0g复合多糖、5.0g的蔗糖、0.17g的柠檬酸、0.01g的山梨酸钾，计为配方3。

配方3对DPPH·自由基、OH·自由基的清除率分别为50.35％，49.73％，FRAP值为3.26mmol/L；对肝癌细胞的抑制率为55.62％。

对比例1

一种复合多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将香菇、银耳分别于50℃烘干至恒重、粉碎，得到各原料的干粉，备用；

(2)粗多糖提取：将30g香菇的干粉加入水中加热提取(100℃条件下微沸后转到50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到粗多糖提取液；所述混合料与水的质量体积比为1g:30ml；

(3)银耳多糖提取：将30g银耳干粉加入水中加热提取(100℃条件下微沸后转到50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到银耳多糖提取液；所述银耳干粉与水的质量体积比为1g:30ml；

(4)步骤(2)的步骤(3)的真空缩至200ml，加入等体积的预处理过的D354FD树脂中，60℃水浴脱色3h，每隔20min进行搅拌；将脱色后的复合多糖溶液与Sevag试剂按体积比4:1混合，剧烈震荡20～30min，静置到溶液分三层，上层为多糖溶液、中间层为变性蛋白、下层为有机试剂，收集上层多糖溶液，重复步骤直到无变性蛋白出现；将脱色、脱蛋白后的复合多糖溶液浓缩至200ml，再按体积比1:4加入无水乙醇中，4℃冰箱过夜(12h)，析出多糖并除去小分子低聚糖，4000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀絮状物收集在55℃干燥箱中干燥至恒重(36h)，得到复合多糖干品；

(5)将2.0g复合多糖、5.0g的蔗糖、0.17g的柠檬酸、0.01g的山梨酸钾行调配，调节PH到5.5后进行均质，余量为水，配制100ml溶液；将配制好的溶液于高温高压灭菌后灌装于灭菌后的10mL棕色玻璃瓶，封口，即得复合多糖口服液。

对比例1对DPPH·自由基、OH·自由基的清除率分别为25.58％，20.55％，FRAP值为1.42mmol/L；对肝癌细胞的抑制率为25.55％。

对比例2

一种枸杞多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将枸杞于50℃烘干至恒重、粉碎，得到原料的干粉，备用；

(2)粗多糖提取：将60g枸杞加入水中加热提取(100℃条件下微沸后调温至50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到多糖提取液；所述枸杞与水的质量体积比为1g:30ml；

(3)将步骤(2)的多糖提取液真空浓缩至200ml，加入等体积的预处理过的D354FD树脂中，60℃水浴脱色3h，每隔20min进行搅拌；将脱色后的多糖溶液与Sevag试剂按体积比4:1混合，剧烈震荡20～30min，静置到溶液分三层，上层为多糖溶液、中间层为变性蛋白、下层为有机试剂，收集上层多糖溶液，重复步骤直到无变性蛋白出现；将脱色、脱蛋白后的多糖溶液浓缩至200ml，再按体积比1:4加入无水乙醇中，4℃冰箱过夜(12h)，析出多糖并除去小分子低聚糖，4000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀絮状物收集在55℃干燥箱中干燥至恒重(32h)，得到干品的多糖；

(5)将2.0g多糖、5.0g的蔗糖、0.17g的柠檬酸、0.01g的山梨酸钾行调配，调节PH到5.5后进行均质，余量为水，配制100ml溶液；将配制好的溶液于高温高压灭菌后灌装于灭菌后的10mL棕色玻璃瓶，封口，即得多糖口服液。

对比例2对DPPH·自由基、OH·自由基的清除率分别为15.37％，11.12％，FRAP值为0.74mmol/L；对肝癌细胞的抑制率为17.63％。

对比例3

一种黄芪多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将黄芪于50℃烘干至恒重、粉碎，得到原料的干粉，备用；

(2)粗多糖提取：将60g黄芪加入水中加热提取(100℃条件下微沸后转到50℃提取3h)，取上层清液，抽滤，得到多糖提取液；所述黄芪与水的质量体积比为1g:30ml；

(3)将步骤(2)的多糖提取液真空浓缩至200ml，加入等体积的预处理过的D354FD树脂中，60℃水浴脱色3h，每隔20min进行搅拌；将脱色后的复合多糖溶液与Sevag试剂按体积比4:1混合，剧烈震荡20～30min，静置到溶液分三层，上层为多糖溶液、中间层为变性蛋白、下层为有机试剂，收集上层多糖溶液，重复步骤直到无变性蛋白出现；将脱色、脱蛋白后的多糖溶液浓缩至200ml，再按体积比1:4加入无水乙醇中，4℃冰箱过夜，析出多糖并除去小分子低聚糖，4000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀絮状物收集在55℃干燥箱中干燥至恒重，得到干品的多糖；

(5)将2.0g多糖、5.0g的蔗糖、0.17g的柠檬酸、0.01g的山梨酸钾行调配，调节PH到5.5后进行均质，余量为水，配制100ml溶液；将配制好的溶液于高温高压灭菌后灌装于灭菌后的10mL棕色玻璃瓶，封口，即得复合多糖口服液。

对比例3对DPPH·自由基、OH·自由基的清除率分别为13.35％，10.27％，FRAP值为0.67mmol/L；对肝癌细胞的抑制率为18.91％。

实施例：复合多糖口服液的效价分析实验

(1)复合多糖口服液的抗氧化作用

将实施例1和对比例1～3制备的复合多糖口服液对DPPH·自由基、OH·自由基的清除能力，以及对Fe³⁺的还原能力进行测定，并以Vc作为阳性对照品，测试结果如图1所示。实施例1制备的复合多糖口服液对DPPH·自由基、OH·自由基具有显著的清除能力以及对Fe³⁺具有一定的还原能力，且显著高于对比例1、对比例2和对比例3，且实施例1的多糖口服液的抗氧化能力大于三者之和。表明本发明制备的复合多糖口服液明显对DPPH·自由基、OH·自由基具有清除能力和还原能力。

(2)复合多糖口服液的抗肿瘤活性

HepG-2细胞以5×10⁴个/mL的浓度接种到96孔板，37℃，5％CO₂，高糖DMEM完全培养基培养。24h后，分别加入多糖口服液100μL，继续培养24h，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，培养箱反应4h。培养结束后，除去上清液，加入150μL DMSO溶液，避光振荡10min。酶标仪上于490nm处检测OD，以5-Fu尿嘧啶为阳性对照，测试结果如图2所示。结果显示，实施例1的复合多糖口服液对HepG-2的抑制率达63.98％，高于对比例1、对比例2及对比例3对HepG-2的抑制率之和。因此表明本发明制备的复合多糖口服液明具有显著的抗肿瘤活性。

几种对比例制备的口服液抗氧化、抗肿瘤性能测试的数据叠加之和，也没有本发明的效果好，说明多糖复合作用时，效果比单味多糖更佳，且它们之间的药理作用呈现协同性。

以上阐述本发明中的实施例，并不是对本发明作其它形式上的限制，本专业的人员可以对上述阐述的技术内容进行变更等。但是只要是没有脱离本发明技术方案内容，根据本发明的技术实质，只是对以上实例进行简单修改、等同变化与改型，仍然属于本发明技术的保护范围。