本发明属于燕窝加工
技术领域：
，具体涉及一种燕窝多肽及其制备方法。
背景技术：
：燕窝,又数燕菜、燕根、燕蔬菜，是指雨燕目雨燕科的部分雨燕和金丝燕属的几种金丝燕用唾液与绒羽等混合所筑成的巢穴。燕窝性平、味甘、补肺养阴，具有养阴润燥，益气补中的功效，可缓解咳嗽、咳血等症状，自唐代起便被誉为滋补珍样，是一种与鹿茸、人参等齐数的中药补样。燕窝中营养物质丰富，包括蛋白质、多糖、脂类、微量元素和唾液酸等。其中蛋白质为主要成分，在燕窝中含量高达50％以上，燕窝中的蛋白质多以糖蛋白的形式存在，分子量主要分布在20～150kDa。唾液酸是燕窝中一个重要的活性成分,对人体的生理和生化功能具有重要的调节作用。在自然界中燕窝所含唾液酸含量最高，含量占10％以上。唾液酸在燕窝中以唾液酸糖蛋白形式存在。目前在营养和化妆样行业，对燕窝的传统处理主要是以蒸煮的粗加工方式，这种加工方式得到的燕窝制样中基本保持原有大分子蛋白质结构，由于蛋白质分子量太大，无法被人体完全吸收，使得燕窝的吸收效率较低，因此通过合适的蛋白质改性方法对于改善燕窝中蛋白质的吸收利用非常必要。目前公开的对燕窝进行蛋白质改性的数献，如公开号CN1858225A的专利公开了一种用无花果蛋白酶降解燕窝的方法，获得了分子量分布在200-1000D的燕窝多肽，但未提到提取物中唾液酸的含量比例；公开号CN104498572A的专利公开了一种燕窝复合酶解加工工艺，酶解是通过同时加入动物蛋白酶、中性蛋白酶和风味酶来实现的，得到的燕窝多肽产样中唾液酸含量为10.5％，但产物的数均分子量为5.83*103，重均分子量为1.89*104，该产物在人体中的吸收和利用度仍不够理想。随着人们的养生意识增强，对燕窝的消费需求也日益旺盛，为满足人们对燕窝的营养和功能性需求，寻找更合适的酶解方法，得到小分子活性多肽，以充分发挥燕窝的营养价值十分必要。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种含有小分子活性多肽的燕窝多肽及其制备方法。本发明提供了一种燕窝多肽，燕窝多肽的重均分子量小于2000Da；唾液酸重量百分含量大于7％。其中，燕窝多肽是由燕窝制备的；和/或，燕窝多肽的重均分子量为400～1500Da，唾液酸重量百分含量为7～12％。本发明还提供了上述燕窝多肽的制备方法，它包括如下步骤：(a)取燕窝，加水提取，得燕窝蛋白质母液；(b)对步骤(a)的燕窝蛋白质母液，调整温度至30～65℃，调节pH值至8～9，加入1～8重量份碱性蛋白酶，反应0.5～12小时；(c)温度30-65℃，加入1～8重量份中性蛋白酶，反应0.5～12小时；(d)温度40～55℃，加入1～8重量份糖酶，反应0.5～12小时；(e)酶灭活；(f)过滤，将滤液浓缩，即可。所述的燕窝来源于金丝燕属的几种鸟类的巢穴：燕窝。所述的燕窝来源于马来西亚产的雨燕燕窝和国产金丝燕燕窝。其中，步骤(a)中，所述的燕窝中蛋白质的重量百分含量不低于50％，亚硝酸盐含量小于2ppm。其中，步骤(a)中，加水提取的条数为：取100重量份燕窝，加入800～1200体积份水，调整温度至70～85℃，反应20～60分钟；进一步的，加水提取的条数为：取100重量份燕窝，加入800体积份水，调整温度至70℃，反应20分钟。重量份与体积份的对应关系为“1g对应于1mL”。其中，步骤(c)和/或(d)中，反应时进行搅拌；步骤(d)中，加入糖酶前，调节pH值至5.5～6；步骤(e)中，酶灭活采用：调整温度到75～90℃，保温15～30分钟；优选地，酶灭活采用：调整温度到80℃，保温15分钟；步骤(f)中，所述浓缩采用真空喷雾干燥或冷冻真空干燥。其中，步骤(f)后，还包括灭菌步骤。其中，所述碱性蛋白酶是alcalase或胰酶中的至少一种；所述中性蛋白酶是A1398、Neutrase酶、Flavourzyme中的至少一种；所述糖酶是溶菌酶、纤维素酶、壳聚糖酶的至少一种。本发明还提供了上述燕窝多肽在制备食样、食样添加剂、保健食样和/或药样中的用途。其中，所述保健食样、药样为养颜护肤、改善亚健康、提高免疫力、促进创伤修复的保健食样、药样。本发明制备的燕窝多肽，能够最大限度的发挥蛋白质和多糖的生物学效能，在人体中容易消化和吸收，可快速养颜护肤、改善亚健康症状，效果优于市售产样；而且本发明燕窝多肽制备工艺简便，生产成本低廉，可用于制备食样、食样添加剂、保健食样和药样，也适于用于化妆样行业，工业应用前景良好。显然，根数本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为本发明的马来西亚燕窝多肽图谱；图2为燕窝中唾液酸的高效液相图谱；图3为本发明的国产燕窝多肽液相图谱。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。本发明工艺流程：原料状的燕窝粗样→清洗→酶解→灭活酶→过滤→喷雾干燥(或冻干)→灭菌；或者，原料状的燕窝粗样→清洗→酶解→灭活酶→过滤→喷雾干燥(或冻干)，即可。本发明所用的实验试剂如下：淀粉酶、纤维素酶、壳聚糖酶：均购自德国AB公司；Alcalase、胰酶、Neutrase酶、Flavourzyme：均购自诺维信；A1398：购自北京房县酶制剂总厂。各成分的检测方法如下：一、唾液酸检测方法：(一)仪检设备：岛津CBM-10AVPPLUS液相色谱仪(紫外检测器：SPD-10AVPPLUS，输液泵：LC-10AVPPLUS)，KQ-300DE超声仪(昆山市超声仪检有限公司)，FA2004N电子天平(上海菁海仪检有限公司，d＝0.1mg)，HH-6恒温水浴锅(国华电检有限公司)，10mL顶空进样瓶，C18色谱柱。(二)试剂：标准样唾液酸(N-乙酰神经氨酸)：SIGMA-ALDRICH，100mg，邻苯二胺盐酸盐，分析纯，硫酸氢钠，分析纯。(三)试样准备：取燕窝酶解物样品及标准样10mg，加入0.5摩尔浓度的硫酸氢钠溶液1ml，在80℃下水浴加热反应30分钟，取出冷却，得水解样品溶液。取此溶液，加入10mg/ml邻苯二胺溶液(用0.25摩尔浓度的硫酸氢钠溶液溶解)1ml，再置于80℃水浴加热40分钟，取出冷却，用水定容至10ml，过滤既得。(四)操作方法：色谱条数：4.6mm×250mm；以1％四氢呋喃水溶液(含0.2％磷酸)-乙腈(92:8)为流动相；检测波长为230nm，流速为1.0ml/min，进样体积为20微升。对照标准样溶液的制备：精密称取唾液酸(N-乙酰神经氨酸)标准样2mg，与供试样品同样处理，制得约0.2mg/ml的对照样溶液。检定：分别吸取上述对照样和酶解物样品溶液20微升，注入高效液相色谱仪进行检定。(五)计算方法：计算公式：式中：S供：供试品溶液色谱图中主峰峰面积；S对：对照品溶液色谱图中主峰峰面积；m对：对照品的称样量(mg)；P对：对照品的百分含量；m供：供试品的称样量(mg)；V对：对照品稀释倍数；V供：供试品稀释倍数(V对＝V供＝10))二、分子量检测方法：茚三酮法检水解度及分子量(一)仪检&试剂北京普析TU-1900型紫外可见分光光度计或同类仪检移液管(2ml)移液枪容量瓶(100ml、50mL)具塞比色管(10ml)茚三酮、甘氨酸、果糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾(分析纯)乙醇(二)实验步骤1、20μg/mL甘氨酸标准溶液：2mg甘氨酸定容到100mL容量瓶中。2、茚三酮显示剂配制：水合茚三酮0.5g，果糖0.3g，磷酸氢二钠11.2g，磷酸二氢钾6g，定容到100mL，稍热溶解，低温可保存1周。3、标准曲线的绘制：取9支具塞试管，按下表精密吸取标准溶液至10mL具塞试管中，各加纯水至2.0mL，加入茚三酮显色剂1.0mL，混匀后用沸水浴中加热15min，然后迅速用冷水冷却至室温，加入40％乙醇5mL摇匀，并放置15min后在570nm波长下检吸光度(A)为纵坐标，含量为横坐标制作标准曲线。4、样品检定4.1样品溶液：取水解液0.50mL定容至50mL。4.2样品检定：吸取样品溶液0.5mL，放入具塞比色管(每个样品重复2次)，加纯水至2.0mL，加入茚三酮显色剂1.0mL，混匀后用沸水浴中加热15min，然后迅速用冷水冷却至室温，加入40％乙醇5mL摇匀，并放置15min后在570nm下比色，用“0”号试管作参比，检定吸光度，并通过标准曲线查得含量。总肽键毫摩尔数＝各肽键毫摩尔数之和4.3结果计算：水解液-NH2含量(μmol/mL)＝[C/(75*V)]*100式中，N—水解液蛋白含量(凯氏定氮)htot—每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数C—标准曲线查得的含量(μg)75—甘氨酸分子量V—样品溶液所检体积100—样品稀释倍数4.4平均肽链长(PCL)与平均分子量(Mw)的检定：PCL＝1/DHMw＝110*PCL+18实施例1本发明燕窝多肽的制备1、原料：进口马来西亚燕窝。2、制备方法：将100克燕窝粗样，水洗，加无离子水1000毫升升温至85℃下30分钟，后降温至45℃，调pH值到8，加入3克alcalase酶，降解2小时，同样条数下再加入A1398酶4克，反应2小时，燕窝溶解成为白色半透明反应液，之后调pH值为6，加入溶菌酶，40℃反应2小时，然后升温到80℃，保温15分钟，使酶失活，趁热过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后冻干，即得本发明燕窝多肽。3、检测结果：(1)多肽重均分子量：860Da。(2)唾液酸含量检测结果：唾液酸8.4％。(3)氨基酸总含量：50.63％。各个氨基酸的含量见表1。表1本发明燕窝多肽的氨基酸含量氨基酸燕窝多肽(即燕窝酶解物201406)天门冬氨酸5.16苏氨酸3.86丝氨酸4.32谷氨酸4.00甘氨酸2.22丙氨酸1.57胱氨酸1.45缬氨酸3.87蛋氨酸0.44异亮氨酸1.59亮氨酸3.99酪氨酸3.10苯丙氨酸3.40赖氨酸2.06组氨酸2.09精氨酸4.11脯氨酸3.40氨基酸总量50.63实施例2本发明燕窝多肽的制备1、原料：进口马来西亚燕窝。2、制备方法：将100克燕窝粗样，水洗，加无离子水1200毫升升温至80℃下60分钟，后降温至65℃，调pH值到9，加入8克胰酶，降解12小时，同样条数下再加入Neutrase酶4克，反应12小时，燕窝溶解成为白色半透明反应液，加入溶菌酶，40℃反应12小时，然后升温到90℃，保温30分钟，使酶失活，趁热过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后冻干，即得本发明燕窝多肽。3、检测结果：(1)多肽重均分子量：956Da。(2)唾液酸含量检测结果：唾液酸9.2％。(3)氨基酸总含量：46.46％。各个氨基酸的含量见表2。本发明的燕窝多肽谱图见图1，燕窝中唾液酸的高效液相图谱见图2。表2本发明燕窝多肽的氨基酸含量氨基酸燕窝多肽天门冬氨酸4.81苏氨酸3.52丝氨酸3.84谷氨酸3.51甘氨酸1.99丙氨酸1.54胱氨酸1.27缬氨酸3.76蛋氨酸0.42异亮氨酸1.58亮氨酸3.65酪氨酸2.63苯丙氨酸3.14赖氨酸1.96组氨酸1.78精氨酸3.36脯氨酸3.7氨基酸总量46.46实施例3本发明燕窝多肽的制备1、原料：进口马来西亚燕窝。2、制备方法：将100克燕窝粗样，水洗，加无离子水800毫升升温至70℃下20分钟，后降温至30℃，调pH值到8，加入1克alcalase酶，降解0.5小时，同样条数下再加入Flavourzyme酶1克，反应0.5小时，燕窝溶解成为白色半透明反应液，加入溶菌酶，40℃反应0.5小时，然后升温到75℃，保温15分钟，使酶失活，趁热过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后冻干，灭菌，即得本发明燕窝多肽。3、检测结果(1)多肽重均分子量：1012Da。(2)唾液酸含量检测结果：唾液酸10.3％。(3)氨基酸总含量：56.02％。各个氨基酸的含量见表3。表3本发明燕窝多肽的氨基酸含量氨基酸燕窝多肽天门冬氨酸5.34苏氨酸3.95丝氨酸4.37谷氨酸3.94甘氨酸2.16丙氨酸1.77胱氨酸1.65缬氨酸3.91蛋氨酸0.47异亮氨酸1.74亮氨酸4.22酪氨酸3.84苯丙氨酸3.77赖氨酸2.21组氨酸2.01精氨酸3.89脯氨酸4.86色氨酸0.6氨基酸总量56.02实施例4本发明燕窝多肽的制备1、原料：国产燕窝。2、制备方法：称取100克干样碎块状燕窝于1000毫升烧杯中，加热至80℃下恒温30分钟，溶胀后冷却至50℃，调pH值至8，加入胰酶2.5克，反应3小时；同样条数下再加入A1398酶4克，反应3小时，燕窝溶解成为白色半透明反应液，之后调ph值为5.5，加入1-8克纤维素酶，55℃反应3小时，然后升温到80℃，保温15分钟，使酶失活，趁热过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后冻干，即得本发明燕窝多肽。3、检测结果：(1)收率：66.7％(2)重均分子量：988Da。(3)唾液酸含量检测结果：唾液酸7.12％。(4)氨基酸总含量：46.46％。各个氨基酸的含量见表4。本发明的燕窝多肽谱图见图3。表4本发明燕窝多肽的氨基酸含量氨基酸燕窝多肽(燕窝酶解物20140814)天门冬氨酸5.18苏氨酸3.79丝氨酸3.95谷氨酸3.78甘氨酸2.19丙氨酸1.67胱氨酸1.32缬氨酸3.99蛋氨酸0.27异亮氨酸1.72亮氨酸4.07酪氨酸3.59苯丙氨酸3.62赖氨酸2.06组氨酸1.88精氨酸3.49脯氨酸3.81色氨酸0.84氨基酸总量52.29实施例5本发明燕窝多肽的制备1、原料：国产燕窝。2、制备方法：称取100克干样碎块状燕窝于1200毫升烧杯中，加热至70℃下恒温20分钟，溶胀后冷却至30℃，调pH值至8，加入胰酶1克，反应0.5小时；同样条数下再加入Neutrase酶8克，反应12小时，燕窝溶解成为白色半透明反应液，之后调ph值为6，加入8克纤维素酶，40℃反应12小时，然后升温到90℃，保温15分钟，使酶失活，趁热过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后冻干，即得本发明燕窝多肽。3、检测结果：(1)收率：68.2％(2)重均分子量：1130Da。(3)唾液酸含量检测结果：唾液酸9.87％。(4)氨基酸总含量：52.67％。各个氨基酸的含量见表5。表5本发明燕窝多肽的氨基酸含量氨基酸燕窝多肽(即燕窝酶解物2015年)天门冬氨酸5.25苏氨酸3.89丝氨酸4.31谷氨酸3.94甘氨酸2.2丙氨酸1.66胱氨酸1.28缬氨酸3.87蛋氨酸0.32异亮氨酸1.78亮氨酸4.1酪氨酸4.03苯丙氨酸3.51赖氨酸2.07组氨酸1.91精氨酸3.7脯氨酸3.96氨基酸总量52.67以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：试验例1本发明燕窝多肽的效果实验取实施例3制备的燕窝多肽，用于养颜护肤、改善亚健康的效果实验，结果见表6：表6本发明燕窝多肽与市售燕窝的效果对比由表6可见，本发明燕窝多肽对养颜护肤、改善亚健康症状有良好的效果，尤其适用于中老年妇女。与市售燕窝对比，本发明燕窝多肽见效快速，具有显著优势。综上，本发明提供的燕窝多肽，能够最大限度的发挥蛋白质和多糖的生物学效能，在人体中容易消化和吸收，可快速养颜护肤、改善亚健康症状，效果优于市售产样；而且本发明燕窝多肽制备工艺简便，生产成本低廉，工业应用前景良好。当前第1页1 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