本发明属于食品保健领域，涉及一种果蔬酵素的制备方法及应用，具体涉及一种姜黄果蔬酵素的制备方法及应用。
背景技术：
果蔬是人们日常膳食的重要组成部分，无论是鲜食还是加工品在日常生活中都占有重要的地位。果蔬作为植物性原料，富含多种功能活性成分，包括膳食纤维、酚类、类胡萝卜素、植物固醇等。多酚是植物体内的一种次生代谢产物，现代研究表明具有抗氧化、抗癌、抗辐射、降血压、预防心脑血管疾病等多种功能活性。多酚类成分一般存在于细胞液泡中或与纤维类成分紧密结合构成细胞壁。因此，要高效的把多酚从果蔬细胞中释放出来难度较大，传统的物理破壁、溶剂提取方法效率低下、成本高昂。此外，大部分多酚类物质的天然存在形式都是多聚体，分子量大、难以解聚。对于大分子多酚类物质，由于人体缺乏相应的消化酶系，不能将之降解消化，只能通过肠道中的微生物来降解处理(氧化、还原、水解等反应)，从而产生对机体有益的代谢产物。然而，膳食食物在肠道中停留的时间一般在24-48小时内，意味着肠道中微生物对多酚类成分的降解作用时间是非常有限，产生的有益代谢产物少，未能充分利用多酚类成分的全部益处。因此，将果蔬在体外进行微生物发酵是提高果蔬中多酚类成分的生物学价值的重要方法之一。
肝脏是人体中重要的器官，能够防御、分解外来和代谢产生的毒素，对维持机体平衡和健康起着至关重要的作用。化学性肝损伤是通过由多种因素造成的，如受污染的空气、水、食物以及日常生活中药物、酒精等。近年来，脂肪肝、酒精肝炎、非酒精性肝炎已成为一种常见疾病，严重威胁人们的身体健康。流行病学调查表明：肝脏损伤人数在中国已高达1.3亿，每年将近50万人死于肝损伤病症。其中脂肪肝及酒精肝是国内外仅次于病毒性肝炎的第二大常见肝损伤疾病。因此，开发一种能长期服用、安全性高、对化学性肝损伤有预防和保健作用的产品具有十分重要的意义。
技术实现要素：
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有护肝作用的姜黄果蔬酵素的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制得的姜黄果蔬酵素。
本发明的再一目的在于提供上述姜黄果蔬酵素的用途。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种具有护肝作用的姜黄果蔬酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)将果蔬清洗、晾干，然后粉碎成20～40目，得混合果蔬液；
(2)向步骤(1)制得的混合果蔬液中加入混合果蔬液重量百分比1～8％的糖，接种混合果蔬液重量百分比0.01～0.05％的酵母菌，密封发酵，当pH<4.3时，得一次果蔬发酵液；
(3)向步骤(2)制得的一次果蔬发酵液中按一次果蔬发酵液体积以100～1000CFU/ml接种复合乳酸菌进行二次发酵，所述复合乳酸菌包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌和醋酸杆菌；密封发酵，当pH<3.8时，向果蔬发酵液中加入发酵液重量百分比1.0～3.0％的姜黄提取物，继续发酵10天，得二次发酵液；
(4)将步骤(3)制得的二次发酵液过滤或离心，对滤液或离心上清液进行均质、灭菌后，制得姜黄果蔬酵素制品。
优选的，如上所述的姜黄果蔬酵素制备方法中，在步骤(1)中，所述果蔬包括火龙果、木瓜、桑椹、杨桃、葡萄、苹果、李子、梅子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋葱、花椰菜和甘蓝中的多种。果蔬的选择可根据蔬菜丰收季节。
优选的，在步骤(2)中加入的糖是蔗糖、葡萄糖和果葡糖浆中的一种或几种。
优选的，在步骤(2)中所述发酵温度为15～45℃，发酵时间为10～30天。
优选的，在步骤(3)中加入的姜黄提取物是来自姜黄，规格从姜黄素质量含量10％到20％。
优选的，在步骤(3)中所述复合乳酸菌的制备方法是植物乳杆菌、干酪乳杆菌、醋酸杆菌等数量比例混合。
优选的，在步骤(3)中，所述发酵的条件为20～40℃，密闭发酵30～90天。
本发明还提供了上述方法制得的姜黄果蔬酵素在制备保护化学性肝损伤保健食品、功能食品或特殊医学用途食品中的应用。
通过常规制剂工艺和辅料、食品添加剂，上述姜黄果蔬酵素可以制成保健食品、功能食品和特殊医学用途食品中的多种剂型/形态：软胶囊剂、硬胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、口服液、饮料、果冻、糖果或软糖。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明姜黄果蔬酵素的制备方法简单，制得的姜黄果蔬酵素能长期服用、安全性高、对化学性肝损伤有预防和保健作用。
姜黄素与果蔬发酵产物如蛋白质、氨基酸、有机酸的螯合，可提升姜黄素的水溶性和生物利用率，增强姜黄素的生物活性。
本发明制得的姜黄果蔬酵素能通过常规制剂工艺和辅料、食品添加剂，可以制成保健食品、功能食品和特殊医学用途中食品的多种剂型/形态(如软胶囊剂、硬胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、口服液、饮料、果冻、糖果、软糖等)，服用方便。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
在未作说明的情况下，本发明涉及的原料与方法均为本领域的常规原料和方法。实施例中使用的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)购自安琪酵母，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)购自上海交大昂立生物，干酪乳杆菌(lactobacillus casei)购自上海交大昂立生物，醋酸杆菌(Acetobacteraceti)购自广东省微生物研究所。
实施例1
(1)果蔬的清洗、破碎
将火龙果、木瓜、杨桃、梅子、草莓、柑橘、洋葱、花椰菜、以及甘蓝洗净、去皮、晾干，用剪切式粉碎机破碎至20目，得混合果蔬液。
(2)一次发酵
加入混合果蔬液重量百分比2％的蔗糖和0.02％的酵母菌，混合搅拌均匀后，室温25～30℃，密封发酵20天，每天搅拌发酵液1小时，取发酵液测得pH为4.2，得一次果蔬发酵液。
(3)二次发酵
向一次果蔬发酵液中按发酵液体积以1000CFU/ml接入复合乳酸菌进行第二发酵，复合乳酸菌由植物乳杆菌、干酪乳杆菌、醋酸杆菌等数量比例混合配制。室温25～35℃，密封发酵60天，每天搅拌发酵液1小时，取发酵液测得pH为3.7。加入发酵液重量百分比1.0％的姜黄提取物(姜黄素质量含量20％)，继续发酵10天，得二次发酵液。
(4)姜黄果蔬酵素获得
将二次发酵液用离心机分离，以1000g离心力离心10分钟，取上清液均质、500ml玻璃瓶罐装灭菌后，制得姜黄果蔬酵素制品。
实施例2
(1)果蔬的清洗、破碎
将火龙果、木瓜、桑椹、杨桃、葡萄、苹果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋葱、花椰菜、甘蓝洗净、去皮和核、晾干，用剪切式粉碎机破碎至30目，得混合果蔬液。
(2)一次发酵
加入混合果蔬液重量百分比8％的葡萄糖和0.05％的酵母菌，混合搅拌均匀后，室温25～35℃，密封发酵15天，取发酵液测得pH为4.2，得一次果蔬发酵液。
(3)二次发酵
向一次果蔬发酵液中按发酵液体积以100CFU/ml接入复合乳酸菌进行第二发酵，复合乳酸菌由植物乳杆菌、干酪乳杆菌、醋酸杆菌等数量比例混合配制。保温在25～37℃，密封发酵60天，每天搅拌一小时，取发酵液测得pH为3.5。随后，加入发酵液重量百分比2.0％的姜黄提取物(姜黄素质量含量15％)，继续发酵10天，得二次发酵液。
(4)姜黄果蔬酵素获得
将二次发酵液用离心机分离，以1000g离心力离心10分钟，取上清液过均质机、500ml玻璃瓶罐装灭菌后，制得姜黄果蔬酵素制品。
实施例3
(1)果蔬的清洗、破碎
将葡萄、苹果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋葱、甘蓝洗净、晾干，用剪切式粉碎机破碎至20目，得混合果蔬液。
(2)一次发酵
加入混合果蔬液重量百分比8％的果葡糖浆和0.04％的酵母菌，混合搅拌均匀后，室温20～35℃，密封发酵15天，每天搅拌发酵液1小时，取发酵液测得pH为4.2，得一次果蔬发酵液。
(3)二次发酵
向一次果蔬发酵液中按发酵液体积以600CFU/ml接入复合乳酸菌进行第二发酵，复合乳酸菌由植物乳杆菌、干酪乳杆菌、醋酸杆菌等数量比例混合配制。保温25～35℃，密封发酵80天，每天搅拌发酵液1小时，取发酵液测得pH为3.3。随后加入发酵液重量百分比3.0％的姜黄提取物(姜黄素质量含量20％)，继续发酵10天，得二次发酵液。
(4)姜黄果蔬酵素制得
将二次发酵液用离心机分离，以1000g离心力离心10分钟，取上清液均质、500ml玻璃瓶罐装灭菌后，制得姜黄果蔬酵素制品。
实施例4
(1)果蔬的清洗、破碎
将葡萄、苹果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋葱、甘蓝洗净、去皮和核后，晾干，用剪切式粉碎机破碎至40目，得混合果蔬液。
(2)一次发酵
加入混合果蔬液重量百分比5％的果葡糖浆和0.02％的酵母菌，混合搅拌均匀后，室温20～35℃，密封发酵10天，每天搅拌发酵液1小时，取发酵液测得pH为4.2，得一次果蔬发酵液。
(3)二次发酵
向一次果蔬发酵液中按发酵液体积以1000CFU/ml接入复合乳酸菌进行第二发酵，复合乳酸菌由植物乳杆菌、干酪乳杆菌、醋酸杆菌等数量比例混合配制。室温25～35℃，密封发酵50天，每天搅拌发酵液1小时，取发酵液测得pH为3.5。随后，加入发酵液重量百分比1.5％的姜黄提取物(姜黄素质量含量10％)，继续发酵10天，得二次发酵液。
(4)姜黄果蔬酵素获得
将二次发酵液用100目板框过滤机过滤，取滤液均质、500ml玻璃瓶罐装灭菌后，制得姜黄果蔬酵素制品。
实施例5
(1)果蔬的清洗、破碎
将梅子、火龙果、木瓜、杨桃、洋葱、花椰菜、甘蓝洗净、晾干，用剪切式粉碎机破碎至20目，得混合果蔬液。
(2)一次发酵
加入混合果蔬液重量百分比3％的蔗糖和2％的葡萄糖，接种混合果蔬液重量百分比0.04％的酵母菌，混合搅拌均匀后，室温25～40℃，密封发酵15天，每天搅拌发酵液1小时，取发酵液测得pH为4.1，得一次果蔬发酵液。
(3)二次发酵
向一次果蔬发酵液中按发酵液体积以600CFU/ml接入复合乳酸菌进行第二发酵，复合乳酸菌由植物乳杆菌、干酪乳杆菌、醋酸杆菌等数量比例混合配制。室温25～35℃，密封发酵60天，每天搅拌发酵液1小时，60天后取发酵液测得pH为3.4。随后，再加入发酵液重量百分比2.0％的姜黄提取物(姜黄素质量含量20％)，继续发酵10天，得二次发酵液。
(4)姜黄果蔬酵素获得
将二次发酵液用100目板框过滤机过滤，取滤液均质、500ml玻璃瓶罐装灭菌后，制得姜黄果蔬酵素制品。
姜黄果蔬酵素的护肝效果验证实验：
实验方法：参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中化学性肝损伤的方法。分组及操作：将80只小鼠适应性喂养2周后，分正常组、模型组、姜黄素组、S1、S2、S3、S4、S5组，其中S1-5分别代表实施例1-5。除正常组和模型组外，其余组用50％的食用酒精12ml/kg·day灌胃连续4周，姜黄素组灌胃姜黄素50mg/kg·day。S1-S5组灌胃各实施例配方姜黄果蔬酵素液6ml/kg·day。每天1次共4周，正常组和模型灌胃同体积蒸馏水。最后1d灌胃给酒精后，禁食不禁水12h，各组动物称重，眼球取血，静置1h后，分离血清，用于检测ALT、AST。动物脱颈椎处死后，取肝脏组织约1g制备成10％肝脏匀浆用于检测MDA、GSH、SOD。用试剂盒检测相关指标。
结果处理：采用SPSS统计软件对数据进行处理，计量资料结果均以x±s表示，多组间均数比较首先采用方差齐性检验后用单因素方差分析进行统计学分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：对酒精性肝损伤小鼠血清中转氨酶的影响，如表1和表2所示。
由表1中数据可知，模型组小鼠血清中ALT、AST水平明显升高，与正常组比较有显著性差异(P<0.05)，提示造模成功。与模型组相比，姜黄素组有降低ALT、AST的趋势，而S1-S5五个组别均能显著降低小鼠血清中ALT、AST的水平，与模型组相比具有统计学意义，表明S1、S2、S3、S4、S5具有保护肝细胞的作用。
表1对酒精性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响x±s
ΔΔp<0.01,*P<0.05,**p<0.01
由表2可知，与模型组相比，姜黄素组具有降低肝组织中MDA的含量及升高组织SOD和GSH的趋势，而S1-S5组能明显的降低组织中MDA的含量及升高组织SOD和GSH的水平(P<0.05-0.01)，由此提示各实施例样品对肝脏的氧化损伤有保护作用。
表2对酒精性肝损伤小鼠肝组织中SOD、MDA和GSH活性的影响(x±s)
ΔΔp<0.01,*P<0.05,**p<0.01
综上所述，姜黄果蔬酵素对化学性肝损伤具有保护作用，且比姜黄素的护肝作用效果好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。