一种超临界流体降低脂肪酶活性的方法与流程

本发明涉及一种食品保鲜技术领域，尤其涉及一种超临界流体处理脂肪酶的技术。

背景技术：

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，主要的发酵微生物有根霉、曲霉和假丝酵母等等。作为一种生物催化剂，脂肪酶具有一般催化剂高效性、高选择性、反应条件温和等共同优点，是绿色环保的催化剂，越来越受到各个领域的关注。在食品工业方面，主要用于乳制品的增香、鱼片脱脂和食用油加工；在纺织领域中主要用于羊毛防缩、丝绸除油去蜡以及改善涤纶亲水性等方面；在化工工业中主要用于生产芥酸及其衍生物。同时，脂肪酶在洗涤添加剂、废水处理添加剂、医药、造纸行业以及手性药物的合成等方面也有相应的应用。

在乳制品生产和加工过程中,原料乳从收集到加工常常需要存放一段时间。为了防止乳酸菌或病原菌等微生物引起原料乳的腐败,常用的方式是利用冷藏方法保存鲜乳。将挤出的乳迅速冷却是保证鲜乳较长时间保持新鲜状态的必要条件，但一般的冷藏温度对嗜冷菌(嗜冷菌被定义为在7℃或7℃以下能够繁殖的一类细菌,是一类常见的能引起乳品腐败的微生物)的抑制作用很小。一般地讲，嗜冷菌的繁殖本身不会引起乳的严重腐败，嗜冷菌能产生耐热的脂肪酶，这些耐热的脂肪酶在巴氏消毒过程中基本不受影响，即使经过超高温处理仍会有部分残留，而残留的脂肪酶则是使乳制品出现凝集、蛋白质酸化以及出现腐败变味的主要原因。因此，为了保证乳制品的质量，降低脂肪酶的活性是十分必要的。

目前，工业中常采用的是巴氏灭菌和超高温瞬时灭活的方法，虽能杀死大多数细菌，但对于其他一些细菌产生的脂肪酶的灭活效果不佳，成本较高，且达不到预期的效果。因此，开发一种能有效降低脂肪酶活性的方法是解决上述问题的关键之一。

由于超临界流体技术具有无水、无毒、节能减排、生态环保等诸多优势，近年来受到了社会各界越来越多的关注。超临界流体技术实现了污水的零排放，在源头上解决了环境及处理产品自身被污染的问题，大大减少了生产成本和能耗。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种超临界流体降低脂肪酶活性的方法，该方法可有效降低脂肪酶的活性，可应用于食品保鲜加工技术领域，以解决食品贮藏过程中微生物产生的脂肪酶破坏其品质。

本发明的一种超临界流体降低脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)将脂肪酶直接散装置于由纤维材料制成的处理容器中。

(2)将装有脂肪酶的处理容器置于超临界流体系统的处理釜中进行超临界流体处理。

(3)将上述处理后的脂肪酶进行封装，放入冰箱中进行冷藏保存备用。

进一步的，步骤(1)中，所述脂肪酶来自猪胰腺的酶制剂。

进一步的，步骤(1)中，所述脂肪酶为固体粉末。

进一步的，所述处理容器通过网状框架支撑在所述处理釜中，优选金属丝网状框架。

进一步的，所述处理容器罩设在所述框架外/设置在所述网状框架内。

进一步的，步骤(2)中，处理温度为30-90℃。

进一步的，步骤(2)中，超临界流体的压强为8-23MPa。

进一步的，步骤(2)中，处理时间为1-4h。

进一步的，步骤(2)中，所述超临界流体系统还设有超临界流体循环装置。

进一步的，步骤(2)中，所述超临界流体为超临界二氧化碳流体、超临界正己烷流体和超临界丙烷流体中的一种或几种，优选超临界二氧化碳流体。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明的超临界流体降低脂肪酶活性的方法，将脂肪酶直接散装于专用处理容器中并封装固定于超临界流体系统的处理釜中，通过改变不同的超临界流体条件实现对脂肪酶的处理，从而降低脂肪酶的活性及稳定性；

2、本发明的处理方法工艺简单，操作简便，能够有效地降低脂肪酶的活性，从而可应用于改善乳制品贮藏过程中出现变质的问题，且不会破坏乳制品的风味并节约成本；

3、避免了超高温瞬时灭活的高能耗和产品品质变化及其自身被污染等问题；

4、金属丝组成的网状框架和纤维材料制成的封装袋构成处理容器，不但利于超临界流体通过，使脂肪酶的处理效果更好，而且方便固定于处理釜中；

5、超临界二氧化碳流体具有绿色环保、节能减排等优点。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1图示了本发明的实施例1、2、3中处理压强对脂肪酶活性及活性降低率的影响；

图2图示了本发明的实施例4、5、6、7中处理温度对脂肪酶活性及活性降低率的影响；

图3图示了本发明的实施例8、9、10中处理时间对脂肪酶活性及活性降低率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下列实施例中所涉及的试剂如下：乙醇、磷酸二氢钾、十二水磷酸二氢钠、氢氧化钠、均为分析纯，聚乙烯醇、橄榄油均为化学纯，酚酞指示剂，邻苯二甲酸氢钾为工作基准试剂，脂肪酶为生物纯。

实施例1

一种超临界流体降低脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)称取0.500g脂肪酶，散装于专用处理容器中并封装；

(2)将处理容器固定于超临界二氧化碳流体系统的处理釜内，将处理釜置于超临界二氧化碳流体系统中，密闭系统后，在超临界二氧化碳流体压强为8MPa，温度为40℃的条件下对脂肪酶进行处理1.0h；将上述经过处理后的脂肪酶放入冰箱中进行冷藏保存备用，并根据脂肪酶的活性测试方法进行活性测试。

处理后的脂肪酶的活性测试方法包括以下步骤：

(1)溶液配制：

底物溶液：称取聚乙烯醇40.000g于烧杯中，缓慢加入900ml水，室温下浸泡48h后，在沸水中不断搅拌直至聚乙烯醇颗粒完全溶解，待溶液冷却后定容至1000ml，用干净纱布过滤后将滤液储存备用；量取上述滤液150ml于烧杯中，再加橄榄油50ml，用高速剪切乳化机处理10min(分两次处理，间隔5min)，既得乳白色PVA乳化液，该溶液现配现用。

氢氧化钠标准溶液(C＝0.05mol/L，按GB/T 601配制)：先称取氢氧化钠110.000g，溶于100ml水中，取27ml稀释定容到1000ml；再准确称取烘至恒定重量的邻苯二甲酸氢钾(工作基准试剂)3.600g，加入80ml水溶解，再滴入2滴酚酞溶液，用标准氢氧化钠溶液滴定至粉红色，并保持30s，记下此时消耗的氢氧化钠的体积(V)，同时做空白试验，以此标定氢氧化钠的浓度；最后准确量取上述氢氧化钠溶液100ml，定容至1000ml，计算氢氧化钠的实际浓度，计算稀释后的氢氧化钠实际浓度为0.051mol/L。

酚酞指示液(10g/L，按GB/T 603配制)：称取酚酞1.000g，加乙醇完全溶解后定容至100ml。

磷酸缓冲液(pH＝7.5)：准确称取磷酸二氢钾1.960g和十二水磷酸氢二钠39.620g于烧杯中，加水溶解定容到500ml，并用pH计校准。

脂肪酶溶液：准确称取脂肪酶0.077g，用磷酸缓冲液溶解并定容至25ml。

(2)脂肪酶活性测试

开始前先用pH校正液校正pH计。取两个100ml烧杯，向空白杯和样品杯中各加入底物溶液4ml和缓冲液5ml，再向空白杯中加入15ml乙醇溶液。将空白被和样品杯置于40℃水浴中预热5min，然后向两杯中各加待测酶液1ml，立即混匀计时。准确反应15min后，立即向样品杯中加入15ml乙醇摇匀以终止反应，取出烧杯后用氢氧化钠标准溶液滴定，以pH计显示pH值为10.3作为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

(3)脂肪酶活性计算

脂肪酶活性定义：1g固体脂肪酶在40℃和pH为7.5的条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸为一个活力单位，单位Ug^-1。活性计算公式(Ⅰ)如下：

式中：X表示脂肪活性，单位：Ug^-1；

V₁：滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位：ml；

V₀：滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位：ml；

C：氢氧化钠标准溶液浓度，单位：mol/L；

50：0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00ml相当于脂肪酸50umol；

n：酶的稀释倍数；

0.05：氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；

1/15：反应时间15min，以1min计。

活性降低率R的计算公式(Ⅱ)如下：

式中：R表示脂肪酶的活性降低率；

X₁表示超临界流体处理后脂肪酶的活性，单位为Ug^-1；

X₀表示超临界流体处理前脂肪酶的活性，单位为Ug^-1。

根据上述方案中的方法和步骤测得超临界流体处理前脂肪酶的活性为25807Ug^-1；根据上述方案中的方法和步骤测定本实施例处理后的脂肪酶的活性为18053Ug^-1，活性降低率为30.0％。由于脂肪酶的活性降低率表示的是脂肪酶处理前后脂肪酶的活性的损失率，亦即反映脂肪酶在处理前后活性的稳定性，故经过实施例1的工艺处理后，脂肪酶的活性大幅降低，其稳定性也显著降低，所得实验结果如图1所示。

实施例2

本实施例步骤与实施例1基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：压强为10MPa。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得的脂肪酶活性为18164Ug^-1，活性降低率为29.6％，脂肪酶的活性及稳定性均有明显地降低，所得实验结果如图1所示。

实施例3

本实施例步骤与实施例1基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：压强为20MPa。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得的脂肪酶活性为18940Ug^-1，活性降低率为26.6％，脂肪酶的活性及稳定性均有所降低，所得实验结果如图1所示。

实施例4

本实施例步骤与实施例1基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：压强为15MPa，温度为60℃。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得的脂肪酶活性为18829Ug^-1，活性降低率为27.0％，脂肪酶的活性及稳定性均有所降低，所得实验结果如图2所示。

实施例5

本实施例步骤与实施例4基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：温度为70℃。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得的脂肪酶活性为17832Ug^-1，活性降低率为30.9％，脂肪酶的活性及稳定性均有明显降低，所得实验结果如图2所示。

实施例6

本实施例步骤与实施例4基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：温度为80℃。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得的脂肪酶活性为16060Ug^-1，活性降低率为37.8％，脂肪酶的活性及稳定性均有所降低，所得实验结果如图2所示。

实施例7

本实施例步骤与实施例4基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：温度为90℃。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得的脂肪酶活性为13069Ug^-1，活性降低率为49.4％，脂肪酶的活性及稳定性均有大幅的降低，所得实验结果如图2所示。

实施例8

本实施例步骤与实施例1基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：压强为15MPa，温度为50℃，处理时间为1.5h。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得的脂肪酶活性为18607Ug-¹，活性降低率为27.9％，脂肪酶的活性及稳定性均有所降低，所得实验结果如图3所示。

实施例9

本实施例步骤与实施例8基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：处理时间为2.0h。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得的脂肪酶活性为18829Ug^-1，活性降低率为27.0％，脂肪酶的活性及稳定性均有所降低，所得实验结果如图3所示。

实施例10

本实施例步骤与实施例8基本相同，其区别在于：采用的超临界二氧化碳流体的处理条件为：处理时间为2.5h。

对本实施例处理后的脂肪酶进行同实施例1方法和条件相同的活性测试，测得其活性为19383Ug^-1，活性降低率为24.9％。脂肪酶的活性和稳定性均有所降低，所得实验结果如图3所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。