本发明涉及毛皮动物微生态制剂技术领域，具体涉及一种毛皮动物复合微生态制剂的制备方法。
背景技术：
养殖场(户)在养殖毛皮动物过程中长期在饲料中添加抗生素，再加上不注重养殖环境的控制，造成污染严重，不能使毛皮动物完全抵御病菌、病毒的侵染，使毛皮动物长期处于亚健康状态。大量实验研究表明，复合微生态制剂具有动态调节动物胃肠道菌群生态系统的作用。具有促进动物生长发育、提高饲料转化率、提高畜禽产品质量、增强动物免疫力、提高抗病菌和抗病毒的能力。
目前现有技术中对毛皮动物复合微生态制剂的研究比较鲜见，如能研究一种复合微生态制剂，并将它用于养殖场，养殖场长期使用复合微生态制剂将进一步提高毛皮动物的免疫力，提高产品品质，取代抗生素防病、治病，减少兽药残留，无疑将增强我国毛皮动物的国际市场竞争力，增加农民收入水平。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种毛皮动物复合微生态制剂的制备方法，在原料的选取上，选用多种菌和纤维素酶复配而成，该复合微生态制剂在治疗细菌性、病毒性疾病的同时还能提高毛皮动物机体免疫力。
其技术解决方案包括：
一种毛皮动物复合微生态制剂的制备方法，依次包括以下步骤：
a活化保存斜面菌种，用LB培养基分别培养酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶，在pH为7-7.5、100-130℃高压灭菌一段时间、在一定的培养温度下培养一段时间；
b对步骤a培养得到的酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶分别进行一级液体扩大培养；
c对步骤b一级液体扩大培养后的酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶接着分别进行二级液体扩大培养；
d将二级液体扩大培养后得到的酵母菌液、乳酸菌液、白腐菌液、枯草芽孢杆菌液、双歧杆菌液、霉菌液和纤维素酶液按照重量比2:2:2:1:1:1:2混合，即得复合微生态制剂。
作为本发明的一个优选方案，步骤a中，高压灭菌时间为20-40分钟，培养温度为30-38℃，培养时间为12-20小时。
作为本发明的另一个优选方案，步骤b和步骤c中的接种量均为10％-20％。
本发明所带来的有益技术效果：
在原料的选取上，本发明选取酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶为原料，并将这几种原料二级扩大培养后得到的菌液按照一定配比2:2:2:1:1:1:2混合制备得到复合微生态制剂，所得复合微生态制剂可以起到治养同步的目的，在治疗细菌性、病毒性疾病的同时提高毛皮动物机体免疫力；可在一定范围内代替抗生素和化学抗病药物，达到真正的绿色生态养殖。
下面结合试验数据说明本发明复合微生态制剂的安全性与治病防病效果。
本发明复合微生态制剂在青岛农业大学实验室经大鼠急性毒性试验，实验组为50只大鼠，按0.6ml/10g体重饲喂21天；空白对照组为50只大鼠，按照常规饲养。
结果表明实验组大鼠全部存活,活动自如,毛发光滑,饮食正常,呼吸道、眼及口腔等处无分泌物外，未发现任何中毒症状，体重均有增加。与空白对照组比较，实验组的大鼠体重明显增加(P＜0.001)。21天观察期结束，将大鼠脱臼处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、小肠等脏器均未见明显异常表现。另外，大鼠胸腺系数和脾脏系数结果表明，实验组与空白对照组比较，实验组大鼠脾脏系数明显增加(P＜0.01)，提示本发明的复合微生态制剂具有免疫增强作用，属实际无毒类物质，安全度大。
具体实施方式
本发明提出了一种毛皮动物复合微生态制剂的制备方法，为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
首先，本发明中LB培养基的配方如下:
胰蛋白胨(Tryptone)10g/L
酵母提取物(Yeast extract)5g/L
氯化钠(NaCl)10g/L。
实施例1：
复合微生态制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)活化保存的各斜面菌种，分别摇瓶培养，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶用LB培养基，pH7-7.5，100-130℃高压灭菌20分钟，在38℃培养12小时；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶的一级液体扩大培养(50L罐)，接种量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶的二级液体扩大培养(500L罐),接种量10％-20％；
(4)将酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶发酵液按以下配比混合：酵母菌20份、乳酸菌20份、白腐菌20份、枯草芽孢杆菌10份、双歧杆菌10份、霉菌10份和纤维素酶20份。无菌装罐，包装得到复合微生态制剂。
实施例2：
复合微生态制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)活化保存的各斜面菌种，分别摇瓶培养，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶用LB培养基，pH7-7.5，100-130℃高压灭菌40分钟，在30℃培养15小时；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶的一级液体扩大培养(50L罐)，接种量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶的二级液体扩大培养(500L罐),接种量10％-20％；
(4)将酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶发酵液按以下配比混合：酵母菌30份、乳酸菌30份、白腐菌30份、枯草芽孢杆菌15份、双歧杆菌15份、霉菌15份和纤维素酶30份。无菌装罐，包装得到复合微生态制剂。
实施例3：
复合微生态制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)活化保存的各斜面菌种，分别摇瓶培养，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶用LB培养基，pH7-7.5，100-130℃高压灭菌30分钟，在35℃培养16小时；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶的一级液体扩大培养(50L罐)，接种量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶的二级液体扩大培养(500L罐),接种量10％-20％；
(4)将酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、霉菌和纤维素酶发酵液按以下配比混合：酵母菌40份、乳酸菌40份、白腐菌40份、枯草芽孢杆菌20份、双歧杆菌20份、霉菌20份和纤维素酶40份。无菌装罐，包装得到复合微生态制剂。
对比例1：
与实施例1不同之处在于：原料的选取上不同，以下分为五组，
A组：生理盐水；
B组：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢杆菌液；
C组：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢杆菌液、白腐菌液；
D组：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢杆菌液、白腐菌液、霉菌液；
E组：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢杆菌液、白腐菌液、双歧杆菌液、霉菌液
为了进一步验证上述实施例1-3和对比例1制备得到的复合微生态制剂对毛皮动物的作用效果，下面结合具体实验及实验结果来说明。
毛皮动物以水貂为例，复合微生态制剂对水貂体重、免疫力和肠道健康的影响，以下对水貂进行分组对照。
试验水貂，为大连黑，由青岛某农业科技有限公司毛皮动物养殖基地提供。选取150日龄仔貂60只，按性别和体重随机分成6组，每组5个重复，每重复2只，公母各半，试验从2016年4月20日起，5月24日结束，共计35天。每组小水貂分笼喂养，自由采食和饮水。由青岛某大学动物微生物与免疫实验室分离保存的乳酸菌和芽孢杆菌的活菌株。
菌落计数(平板计数法)
在超净台内用经过高压的量筒取25mL菌液置于盛有250mL生理盐水的广口瓶内，充分摇匀成比例为1:10的稀释液。用容积为1.0mL的经过高压的吸管吸取1.0mL置于盛有9mL的生理盐水内，进行十倍稀释，重复上述操作直至菌液稀释倍数为109。用吸管吸取1.0mL的菌液置于经过高压、烘烤后的平皿内，同时将冷却至46℃左右的营养琼脂倒入平皿内，同时移动平皿使溶液充分混合。将平板置于恒温箱内培养24h计数，重复做三次。
免疫注射
将试验动物随机分成A、B、C、D、E、F六组，每组5个重复。对水貂进行免疫，第一次每只水貂注射等体积混合的抗原与弗氏完全佐剂0.1mL。一个星期后每只水貂注射等体积混合的抗原与弗氏不完全佐剂佐剂0.1mL，间隔一周后每只水貂重复注射等体积混合的抗原与弗氏不完全佐剂佐剂0.1mL。
对水貂灌胃处理，见表1。
表1为对试验水貂的不同处理方式
不同试验组对水貂体重的影响，见表2。
表2试验期水貂的体重增长情况(单位：g)
备注：同一行中出现小写字母相同上标的表示差异不显著(P＞0.05)，具有不同小写字母的表示差异性显著(P＜0.05)。
结果分析：从表2中可以看出试验前水貂的体重大题一致。试验期间，对照组和试验组的水貂体重都有大幅增长，试验组水貂的体重普遍比对照组增长的快。对试验前后水貂的体重增长情况进行分析，得出试验组水貂在试验前后的平均日增重比对照组增长的快，尤其是公貂，平均日增重达到了22.44g。
不同试验组对水貂内脏指数的影响，见表3。
表3不同处理组小水貂的内脏指数(n＝5)
数据分析：用spss软件对水貂的内脏器官进行统计分析，采用多重比较的方法。由表3得出，F组(实施例1)的水貂各内脏指数与对照组相比极显著(P＜0.01)且显著高于其他实验组(P＜0.05)，芽孢杆菌、乳酸菌、中药组单独作用组各内脏器官的重量也显著高于对照组(P＜0.05)，F组显著高于对照组及益生菌和中药组(P＜0.05)。
血清免疫琼扩结果，表4为血清法氏囊病毒抗体效价。
表4血清法氏囊病毒抗体效价
由表4计算得出：每个试验组血清效价较对照组分别升高了29％，24％，11％，17％，14％；30％，26％，15％，8％，12％。可以得出复合微生态制剂组水貂血清法氏囊抗体含量与其它试验组相比有比较明显的促进作用。
ELISA试验结果分析见表5。
表5为不同处理组小水貂的OD值
由表5可以得出第一次测得的OD值除了E组之外其它试验组均比较接近，即在第一次免疫后水貂体内的抗体含量差异不明显；第二次由试验测得的OD值仍然比较接近，即水貂体内的抗体含量相差不大；第三次免疫后复合微生态制剂组OD数值明显高于其它试验组，说明其体内抗体含量与其它试验组相比数值升高的更大。
不同试验组对水貂空肠的粘膜厚度、绒毛长度的影响
在光镜下观察得出，芽孢杆菌组、中药组、复合微生态制剂组和对照组水貂空肠粘膜结构均比较完整，并且层次分明，肠绒毛完整整齐。可见有明显的支部，小肠粘膜上皮表面的纹状缘结构整齐均匀。与对照组相比，复合微生态制剂组小水貂空肠粘膜绒毛排列更加紧密，绒毛比较长。
本次试验结果表明，无论给水貂灌胃芽孢杆菌组、乳酸菌组、中药组，还是复合微生态制剂组均能促进水貂的增长，但是复合微生态制剂组的水貂体重在两周后与其它试验组相比远大于其它试验组。
不同试验组对水貂内脏指数的影响：
由试验可以得出复合微生态制剂组在促进小水貂内脏器官的生长方面与对照组相比差异极显著(p<0.01)。灌胃乳酸菌组、芽孢杆菌组和中药组对脏器指数的影响与对照组相比差异显著(p<0.05)。表明复合微生态制剂组对水貂的内脏指数方面效果更显著。
不同试验组对法氏囊抗体效价的影响：
本试验结果显示不同试验组的水貂抗体效价与对照组相比差异显著，但是复合微生态制剂组水貂的血清效价较对照组在第一次和第二次分别升高了29％和30％，与其它试验组相比数值变化较大。表明复合微生态制剂组在增强抗体的效价方面效果更显著。
综上所述，本发明制备得到的复合微生态制剂对水貂的生长增重，内脏器官的生长，鸡法氏囊抗体效价的升高以及肠道微绒毛的长度及肠壁厚度均有比较明显的促进作用，大幅度提高了水貂的性能。
需要说明的是，在本说明书的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式，或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。