本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种以鲍鱼蛋白质类似物和植物中药为原料制备的类鲍鱼蛋白质保健饮料的制备方法。
背景技术：
鲍自古被誉为海味珍品之冠，自古以来被视为佐膳佳肴及珍贵滋补品。现代研究结果表明，鲍鱼的营养价值极为丰富，含有二十多种氨基酸，每百克鲜鲍鱼肉含丰富蛋白质23.4 克，含量高达20%以上，鲍鱼不仅有滋补、保健作用，而且对于养阴、平肝、固肾、调节血压，润燥利肠等均有明显功效，深受消费者的喜爱。
鲍鱼的食用方法多种多样，有鲜食、干制以及冷冻保存后食用等多种方法。而鲍鱼饮料的制作方法，已有公开文献报道，例如，公开的CN104997097A、CN105011309A中国发明专利申请公开说明中均公开了鲍鱼饮料的制作方法，其均是采用鲍鱼进行蛋白酶解后与其他营养物质配伍。这种方法制备的饮料营养丰富，但价格一定昂贵，不符合普通的工薪阶层的需要。另外，由于海产品固有的腥味，使这种饮料的口感也大打折扣。因此，研发一种既具有鲍鱼营养价值，又能不给食用者造成经济压力、口感良好的的替代产品就显得十分必要。
技术实现要素：
为了克服现有技术中采用鲍鱼酶解制作饮料存在价格昂贵、口感欠缺的不足，本发明提供一种工艺合理、易于操作、原料生产成本低、口感好的类鲍鱼蛋白质保健饮料的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种类鲍鱼蛋白质保健饮料的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）、鲍鱼细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取100～200mg鲍鱼组织在液氮中磨碎，加入1～2ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温条件下静置3～5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于2～8℃条件下，10000g离心8～10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积10%～20%的氯仿，剧烈振荡15～20s，室温静置2～3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于2～8℃条件下，10000g离心10～15min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1～2的比例加入异丙醇，室温静置8～10min，于2～8℃条件下，10000g离心8～10min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1～1.5ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于2～8℃条件下，6000～7500g离心3～5min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥5～10min，然后加入25～200μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于55～60℃条件下静置8～10min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得鲍鱼细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的鲍鱼细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积10%～15%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8～12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h；将500ml菌液接种至50～80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.3～0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30～60s，用发酵液体积10%～20%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心30～60s，取上清液，即为鲍鱼RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的鲍鱼RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类鲍鱼蛋白质溶液；
（6）、中药提取液的提取
按重量份称取中药原料罗汉果6～8份、山楂8～10份、荷叶4～6份、薄荷3～5份、葛根2～4份、大枣4～6份，并将罗汉果、山楂、大枣用组织捣碎机捣碎，荷叶、薄荷和葛根粉碎后过200目筛；破碎的中药原料混合后加入其质量50～80倍的纯净水，加热蒸煮浸提30～60min；离心，取上清液，得中药提取液；
（7）、调配
称量步骤（5）中得到的类鲍鱼蛋白质溶液、步骤（6）中得到的中药提取液和市售的柠檬酸、木糖醇、蜂蜜、维生素c维生素、蒸馏水混合均匀，调整pH至7.0～7.5，得调配液；其中，在该调配液中，所述的类鲍鱼蛋白质溶液的重量百分比为30～40%、中药浸提液为20～30%、柠檬酸0.5～1%、木糖醇0.5～1%、蜂蜜0.2～0.5%、维生素c2～3%，余量为蒸馏水，各组分的重量百分比之和为100%；
（8）、杀菌
将步骤（7）中得到的调配液经精滤膜精滤后，进行高温瞬时灭菌；
（9）、灌装
将步骤（8）中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按预设重量进行分瓶真空灌装，封口，冷却至常温，即得类鲍鱼蛋白质保健饮料。
所述的匀浆后的混合物静置时的室温控制为15～30℃。
所述的高温瞬时灭菌的灭菌温度为120～140℃，灭菌时间为4～6s。
所述的真空灌装的真空度为0.04～0.05Mpa，灌装温度控制在60～75℃。
本发明先是选取鲍鱼组织通过氯仿抽提方法，获得鲍鱼细胞RNA；再采用RT-PCR的方法，得到鲍鱼细胞的cDNA，然后利用随机引物进行PCR，得到各种随机的基因片段，然后将得到的基因片段克隆入原核表达载体，进行诱导表达，得到随机基因编码的随机蛋白，这些蛋白有一个共同的特点，都是来源于鲍鱼细胞的RNA，即均为鲍鱼细胞中所含有蛋白或蛋白片段，随机蛋白的氨基酸组成与鲍鱼细胞的氨基酸组成基本类似，所得到的随机蛋白可用于后期产品使用，达到提供与鲍鱼营养类似的目的。本发明采用原核表达方法，技术成熟，生产成本低，易于操作。本发明采用罗汉果、山楂、荷叶、薄荷、葛根、大枣配伍的中药原料进行加热浸提，得到的中药提取液具有促进消化、降血压、降低血脂、预防心脑血管疾病等保健功效；其将类鲍鱼蛋白质溶液、中药提取液与其他辅料调配制备的保健饮料口感淳厚，酸甜适中。本发明的类鲍鱼蛋白质保健饮料的制备方法，其工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种类鲍鱼蛋白质保健饮料的制备方法，其经过下列工艺步骤：
（1）、鲍鱼细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取150mg鲍鱼组织在液氮中磨碎，加入1.5ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为20℃条件下静置4min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于5℃条件下，10000g离心9min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积16%的氯仿，剧烈振荡18s，室温静置3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于5℃条件下，10000g离心12min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1.6的比例加入异丙醇，室温静置9min，于5℃条件下，10000g离心9min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.2ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于5℃条件下，7000g离心4min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥8min，然后加入100μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于58℃条件下静置9min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得鲍鱼细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的鲍鱼细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积12%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养10h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养10h；将500ml菌液接种至65L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.5，向其中加入IPTG至终浓度为0.35mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心45s，用发酵液体积15%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心45s，取上清液，即为鲍鱼RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的鲍鱼RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类鲍鱼蛋白质溶液；
（6）、中药提取液的提取
按重量份称取中药原料罗汉果7份、山楂9份、荷叶5份、薄荷4份、葛根3份、大枣5份，并将罗汉果、山楂、大枣用组织捣碎机捣碎，荷叶、薄荷和葛根粉碎后过200目筛；破碎的中药原料混合后加入其质量60倍的纯净水，加热蒸煮浸提45min；离心，取上清液，得中药提取液；
（7）、调配
称量步骤（5）中得到的类鲍鱼蛋白质溶液、步骤（6）中得到的中药提取液和市售的柠檬酸、木糖醇、蜂蜜、维生素c维生素、蒸馏水混合均匀，调整pH至7.2，得调配液；其中，在该调配液中，所述的类鲍鱼蛋白质溶液的重量百分比为36%、中药浸提液为24%、柠檬酸0.6%、木糖醇0.8%、蜂蜜0.3%、维生素c2.7%和蒸馏水35.6%；
（8）、杀菌
将步骤（7）中得到的调配液经孔径为0.5微米的精滤膜精滤后，进行高温瞬时灭菌，其灭菌温度为130℃，灭菌时间为5s；
（9）、灌装
将步骤（8）中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按每瓶450g进行分瓶真空灌装，其真空度为0.045Mpa，灌装温度控制在70℃，封口，冷却至常温，即得类鲍鱼蛋白质保健饮料。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与鲍鱼细胞的氨基酸组成基本类似，原料成本低，所得到的类鲍鱼蛋白质营养价值高。其采用的原核表达方法技术成熟，价格低廉，易于操作。其采用罗汉果、山楂、荷叶、薄荷、葛根、大枣配伍的中药原料进行加热浸提，得到的中药提取液具有促进消化、降血压、降低血脂、预防心脑血管疾病等保健功效；其将类鲍鱼蛋白质溶液、中药提取液与其他辅料调配制备的保健饮料口感淳厚，酸甜适中。其制备方法工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。
实施例2
一种类鲍鱼蛋白质保健饮料的制备方法，其经过下列工艺步骤：
（1）、鲍鱼细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取200mg鲍鱼组织在液氮中磨碎，加入2ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为30℃条件下静置3min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于8℃条件下，10000g离心8min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积20%的氯仿，剧烈振荡20s，室温静置3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于8℃条件下，10000g离心15min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1: 2的比例加入异丙醇，室温静置10min，于8℃条件下，10000g离心10min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.5ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于8℃条件下，7500g离心3min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥10min，然后加入200μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于60℃条件下静置8min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得鲍鱼细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的鲍鱼细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积15%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养12h；将500ml菌液接种至80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心60s，用发酵液体积120%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心60s，取上清液，即为鲍鱼RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的鲍鱼RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类鲍鱼蛋白质溶液；
（6）、中药提取液的提取
按重量份称取中药原料罗汉果6份、山楂10份、荷叶4份、薄荷5份、葛根2份、大枣6份，并将罗汉果、山楂、大枣用组织捣碎机捣碎，荷叶、薄荷和葛根粉碎后过200目筛；破碎的中药原料混合后加入其质量80倍的纯净水，加热蒸煮浸提60min；离心，取上清液，得中药提取液；
（7）、调配
称量步骤（5）中得到的类鲍鱼蛋白质溶液、步骤（6）中得到的中药提取液和市售的柠檬酸、木糖醇、蜂蜜、维生素c维生素、蒸馏水混合均匀，调整pH至7.5，得调配液；其中，在该调配液中，所述的类鲍鱼蛋白质溶液的重量百分比为40%、中药浸提液为20%、柠檬酸1%、木糖醇0.5%、蜂蜜0.2%、维生素c3%和蒸馏水35.3%；
（8）、杀菌
将步骤（7）中得到的调配液经孔径为0.5微米的精滤膜精滤后，进行高温瞬时灭菌，其灭菌温度为120℃，灭菌时间为6s；
（9）、灌装
将步骤（8）中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按每瓶200g进行分瓶真空灌装，其真空度为0.05Mpa，灌装温度控制在60℃，封口，冷却至常温，即得类鲍鱼蛋白质保健饮料。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与鲍鱼细胞的氨基酸组成基本类似，原料成本低，所得到的类鲍鱼蛋白质营养价值高。其采用的原核表达方法技术成熟，易于操作。其采用罗汉果、山楂、荷叶、薄荷、葛根、大枣配伍得到的中药提取液具有促进消化、降血压、降低血脂、预防心脑血管疾病等保健功效；其将类鲍鱼蛋白质溶液、中药提取液与其他辅料调配，得到的保健饮料口感淳厚，酸甜适中。其制备方法工艺合理，易实现规模化生产。
实施例3
一种类鲍鱼蛋白质保健饮料的制备方法，其经过下列工艺步骤：
（1）、鲍鱼细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取100mg鲍鱼组织在液氮中磨碎，加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为15℃条件下静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于2℃条件下，10000g离心10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积10%的氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于2℃条件下，10000g离心10min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1的比例加入异丙醇，室温静置8min，于2℃条件下，10000g离心8min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于2℃条件下，6000g离心5min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥5min，然后加入25μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于55℃条件下静置10min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得鲍鱼细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的鲍鱼细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积10%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8h；将500ml菌液接种至50L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4，向其中加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30s，用发酵液体积10%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心30s，取上清液，即为鲍鱼RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的鲍鱼RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类鲍鱼蛋白质溶液；
（6）、中药提取液的提取
按重量份称取中药原料罗汉果8份、山楂8份、荷叶6份、薄荷3份、葛根4份、大枣4份，并将罗汉果、山楂、大枣用组织捣碎机捣碎，荷叶、薄荷和葛根粉碎后过200目筛；破碎的中药原料混合后加入其质量50倍的纯净水，加热蒸煮浸提30min；离心，取上清液，得中药提取液；
（7）、调配
称量步骤（5）中得到的类鲍鱼蛋白质溶液、步骤（6）中得到的中药提取液和市售的柠檬酸、木糖醇、蜂蜜、维生素c维生素、蒸馏水混合均匀，调整pH至7.0，得调配液；其中，在该调配液中，所述的类鲍鱼蛋白质溶液的重量百分比为30%、中药浸提液为30%、柠檬酸0.5%、木糖醇1%、蜂蜜0.5%、维生素c2%和蒸馏水36%；
（8）、杀菌
将步骤（7）中得到的调配液经孔径为0.5微米的精滤膜精滤后，进行高温瞬时灭菌，其灭菌温度为140℃，灭菌时间为4s；
（9）、灌装
将步骤（8）中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按每瓶250g进行分瓶真空灌装，其真空度为0.04Mpa，灌装温度控制在75℃，封口，冷却至常温，即得类鲍鱼蛋白质保健饮料。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与鲍鱼细胞的氨基酸组成基本类似，营养价值高，原料成本低。其采用罗汉果、山楂、荷叶、薄荷、葛根、大枣配伍加热浸提得到的中药提取液具有促进消化、降血压、降低血脂、预防心脑血管疾病等保健功效；其将类鲍鱼蛋白质溶液、中药提取液与其他辅料调配，制得的保健饮料口感淳厚，酸甜适中。其制备方法工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。