一种营养增效型系列豆芽发酵乳饮料及其制备工艺的制作方法

本发明涉及一种利用乳酸菌发酵豆芽乳制备的营养增效型豆芽发酵乳饮料及其制备工艺，属于功能性发酵食品领域。

背景技术：

大豆是研发植物源营养品及发酵乳品理想的原材料。大豆中蛋白质含量为20-40%，并且富含赖氨酸。脂质中不饱和脂肪酸含量高，含丰富的维生素和钾、钠、钙、铁、磷等矿质元素，并且含有大豆低聚糖、大豆异黄酮、大豆皂甙等多种生理活性物质，营养价值非其它植物性食品可比。美国国家癌症研究所在为期五年的“设计食品”的研究计划中，把大豆列为最有希望预防癌症的六种食品之一。大豆在我国产量很高，其蛋白质含量与种类最接近牛乳中蛋白。因此充分发挥科研创新创造力，以大豆为原料，研究与发展豆乳产业，以满足更广泛人群营养与健康需求，符合市场消费需要以及国家食品产业结构调整需要。

在传统的大豆食品中，虽然其营养价值很高，但能够被人类有效吸收利用的营养物质仅占很少的部分，大量的蛋白、脂类以及矿物质被浪费。如植酸、脂肪氧化酶，难消化的 α-半乳糖基低聚糖，如棉籽糖和水苏糖，容易引发胀气；含有胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子。

大豆在发芽过程中其营养组成产生了巨大变化。首先，必需氨基酸和非必需氨基酸的显著增加。其次，发芽提高了蛋白质的消化率，一方面是因为胰蛋白酶抑制素和血球凝集素的活性降低，另一方面降解后的大豆蛋白质对酶的敏感性增强了。研究表明大豆发芽后其营养价值更高了，并且更容易被消化吸收。第三，发芽的大豆还有很大的药用价值。本草纲目中记载，豆芽具有健脾、宽中、润燥、消水、排脓、解毒、消肿止痛，又有清热利湿之功效，可用于暑湿发热，胸闷不舒，肢体疼痛及水肿等症的医治。另外的研究表明豆芽还有抗癌的作用，豆芽中维生素B，对人体的神经和肝脏有重要的作用，经常食用豆芽，还能保护皮肤和微血管，降低血浆胆固醇中的饱和脂肪酸，预防痔疮。

乳酸菌是公认的食品级微生物，已经被应用于食品中几千年了。近年来的研究表明乳酸菌具有很强的保健功能，利用乳酸菌发酵的乳制品、肉制品、泡菜类的制品被人们普遍认为是具有营养保健功能的食品，越来越受到人们的欢迎。乳酸菌还被证明具有增强免疫力、抗癌、缓解糖尿病、改善心血管疾病等的功效，已有乳酸菌的药物和保健品大量上市。已有的研究对豆芽乳和牛乳混合发酵进行了有益的探讨。但这些研究中发芽时间长，豆芽太长，由于豆芽在豆芽乳的磨制中容易损失，因而对营养的损失较大，同时由于发芽时间长使豆芽容易发生腐烂和产生异味。另一方面已报道的研究均使用了牛乳复配的方式进行了简单乳酸菌发酵的实验，没有考虑到市场对多种植物蛋白饮品的切实需求，这不利于豆芽发酵乳产品多样化研发以及市场化开发。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种将大豆发芽与多种乳酸菌发酵相结合制备的高营养豆芽发酵乳饮料及其制备方法。用本法制得的产品，营养丰富，质量稳定，风味浓郁，感官评价优秀（如图2所示）。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种营养增效型豆芽发酵乳饮料，包含如下成分：豆芽乳50-90%，脱脂牛乳0-40%，白砂糖4-8%，葡萄糖1-5%，乳酸菌0.5-1%，柠檬酸钠0.03-0.06%，高甲氧基果胶或食用琼脂0-0.15%，各成分均为质量体积百分比。

其中：豆芽乳为主要成分之一，采用当年大豆进行发芽，保证大豆发芽率>90%。添加纯净水后，经过磨制、过滤后即成豆芽乳。

乳酸菌为主要成分之一，所述乳酸菌由嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、双歧杆菌、戊糖乳杆菌、副干酪乳杆菌中的任意一种或几种的任意比例混合物与肠膜明串株菌组成，其中肠膜明串株菌占成品质量体积百分比为0.1-0.5%。乳酸菌均为活菌。

其他成分为必要成分，包括用于活化菌种的葡萄糖、白砂糖；调节风味的柠檬酸钠，调节体态的高甲氧基果胶与食用琼脂等。

所述豆芽发酵乳饮料的制备方法，包括以下步骤：

（1）原料选择：选择新鲜、无霉变、成熟度较高、胚芽完好，颗粒饱满成熟、没有破损的当年产大豆；

（2）发芽、磨浆：将大豆洗净后用0.04%次氯酸钠溶液浸泡0.5h，浸泡后的大豆彻底洗净后于25℃发芽36-48h；将获得的豆芽与水按质量体积比为1:6-10混合后用胶体磨磨浆5-10min，获得初级豆芽乳；

（3）过滤、脱脂：初级豆芽乳依次通过80-200目滤网逐级过滤，再煮沸脱脂；

（4）调配：将葡萄糖、白砂糖、高甲氧基果胶或食用琼脂混合加水后，加热溶解，并与煮沸的初级豆芽乳混合，加入柠檬酸钠，充分搅拌，使各组分混合混匀；

（5）均质：将步骤（4）所得混合液直接送入高压均质机中均质3-5min，均质温度为40-50℃，均质压力为30-35MPa；

（6）杀菌、冷却：将步骤（5）所得均质混合液进行巴氏杀菌后，再冷却到40℃；

（7）接种、发酵：将乳酸菌接种到步骤（6）所得混合液中，恒温培养4-12h；

（8）后熟：发酵豆芽乳冷却后，放入冰箱保温16-24h，使产品具有良好的口感和风味；

（9）冷藏：将成品置于冷库内贮藏。

优选地，大豆可替换为黄豆、绿豆、黑豆、豌豆、槐豆等。

优选地，在豆芽发酵乳中添加果酱、果粒、果仁、蔬菜汁等制备风味豆芽发酵乳。

本发明的有益效果：

1、本发明中肠膜明串株菌的使用具有提高产品酸度，改善风味，去除豆腥味的作用；

2、乳酸菌发酵豆乳后，非消化性低聚糖、胰蛋白酶抑制剂、醛类等发生降解，有效提高了大豆蛋白的吸收率。乳酸菌产生的酶对大豆糖类、有机酸、蛋白质、脂肪及脂肪酸、矿物质、维生素、大豆异黄酮进行了降解或转化，既使营养价值提高，又增加了风味成分和保健因子，因而乳酸菌发酵豆乳的保健功能也获得了极大提高；

3、本发明创新的将发芽大豆与乳酸菌发酵相结合运用到植物蛋白发酵饮品中，并不断优化加工工艺，有效解决了豆乳豆腥味的问题，在保证产品风味和口感的同时还确保了益生菌豆乳中的活性以及功效。本发明所制备的发酵豆乳系列饮品是兼具口感风味以及保健营养功能的新型植物蛋白饮料，为大豆等豆类食品营养的高效利用提供了良好的开发思路。

附图说明

图1为豆芽发酵乳制品的工艺流程图；

图2为豆芽发酵乳制品的成品展示图；

图3A为大豆发芽过程中蛋白酶活性的变化；

图3B为豆芽乳在发酵过程中的蛋白酶活性变化；

图4A为大豆发芽过程中游离氨基酸的变化；

图4B为豆芽乳发酵过程中游离氨基酸的变化；

图5为大豆发芽后几种氨基酸分析。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例一：凝固型豆芽酸乳的制备

豆芽酸乳是一种以优质大豆为主要原料，经过发芽和乳酸菌发酵两种生物处理过程制备的营养性饮料。本实例中使用大豆芽为唯一发酵营养基质，制备凝固型全植物蛋白饮料。该配方及工艺为素食者和对动物乳制品不适的人群提供了全新的营养方案，也是进一步开发其他类型豆芽发酵乳的基础配方和基础工艺。该工艺中大豆经过48h发芽后，磨浆制成豆芽乳，经过滤、脱脂、调配、均质、杀菌、冷却、接种、发酵、后熟制成后冷藏，具体步骤如下：

1、原料选择：选择新鲜、无霉变、成熟度较高、胚芽完好，颗粒饱满成熟、没有破损的当年产大豆；

2、发芽、磨浆：将大豆洗净后用0.04%次氯酸钠溶液浸泡0.5h，浸泡后的大豆彻底洗净后于25℃发芽48h，每隔24h换一次水；将获得的豆芽与水按质量体积比为1:6混合后放入胶体磨中磨浆5min，获得初级豆芽乳；

3、过滤、脱脂：将初级豆芽乳依次通过80-160目滤布逐级过滤，再煮沸脱脂；

4、调配：将2%葡萄糖、7%白砂糖混合加水后，加热溶解，并与煮沸的初级豆芽乳（90%）混合，加入0.03%柠檬酸钠，充分搅拌，使各组分混合混匀；

5、均质：将步骤4所得混合液直接送入高压均质机中均质3min，均质温度为40℃，均质压力为35MPa；

6、杀菌、冷却：将步骤5所得均质混合液进行巴氏杀菌后，再冷却到40℃；

7、接种、发酵：将嗜热链球菌（CICC 20174）和保加利亚乳杆菌（CICC 20358）以及肠膜明串珠菌（CICC 20713）按成品量的0.47%、0.4%和0.1%接种到步骤6所得混合液中，在40℃恒温培养箱中培养4h至豆芽乳凝固；

8、后熟：发酵豆芽乳冷却到室温，放入4℃冰箱中保温16h，使产品具有良好的口感和风味；

9、冷藏：将成品置于2-6℃的冷库内贮藏。

实施例二：牛乳豆芽乳混合发酵酸乳的制备

在豆芽乳中混合了新鲜牛乳后再通过乳酸菌发酵制备的混合发酵乳兼顾了豆芽乳与牛乳的营养组成，既保持了二者共有的蛋白，脂肪等营养，又包含了豆芽乳中特有的大豆皂甙、异黄酮、卵磷脂等几十种对人体有利的物质和牛乳中特有的生物钙质，B族维生素以及增强免疫力的抗体物质。对于幼儿和老年人具有优秀的保健功能。本实例中以优质黄豆和牛乳为主要原料，经48h发芽，磨浆制成豆芽乳，将豆芽乳50%与脱脂乳40%混合或将豆芽乳60%与脱脂乳粉30%混合，经过滤、脱脂、调配、均质、杀菌、冷却、接种、发酵、后熟制成后冷藏，具体步骤如下：

1、原料选择：选择新鲜、无霉变、成熟度较高、胚芽完好，颗粒饱满成熟、没有破损的当年产黄豆；

2、发芽、磨浆：将黄豆洗净后用0.04%次氯酸钠溶液浸泡0.5h，浸泡后的黄豆彻底洗净后于25℃发芽48h，每隔24h换一次水；将获得的豆芽与水按质量体积比为1:6混合后放入胶体磨中磨浆6min，获得初级豆芽乳；

3、过滤、脱脂：将初级豆芽乳依次通过80-160目滤布逐级过滤，再煮沸脱脂；

4、调配：将3%葡萄糖、6.2%白砂糖、0.15%食用琼脂混合加水后，加热溶解，并与煮沸的初级豆芽乳（50%）与脱脂牛乳（40%）的混合液或初级豆芽乳（60%）与脱脂乳粉（30%）的混合液混合，加入0.05%柠檬酸钠，充分搅拌，使各组分混合混匀；

5、均质：将步骤4所得混合液直接送入高压均质机中均质4min，均质温度为45℃，均质压力为33MPa；

6、杀菌、冷却：将步骤5所得均质混合液进行巴氏杀菌后，再冷却到40℃；

7、接种、发酵：将嗜热链球菌（CICC 20174）和保加利亚乳杆菌（CICC 20358）以及肠膜明串珠菌（CICC 20713）按成品量的0.15%，0.2%和0.25%接入到步骤6所得混合液中，在40℃恒温培养箱中培养5h至豆芽乳凝固；

8、后熟：发酵豆芽乳冷却到室温，放入4℃冰箱中保温18h，使产品具有良好的口感和风味；

9、冷藏：将成品置于2-6℃的冷库内贮藏。

实施例三：灭菌型绿豆芽酸乳的制备

为适应豆芽发酵乳产品的不同储存条件与市场需求，采用了灭菌型绿豆芽发酵酸乳的制备工艺方法。灭菌型豆芽酸乳在保持其营养组成与优秀风味的前提下，能够满足常温较长时间的储存。在本实例中以优质绿豆为主要原料，经36h发芽，磨浆制成豆芽乳，经过滤、脱脂、调配、均质、杀菌、冷却、接种、发酵、后熟、灭菌后制成，具体步骤如下：

1、原料选择：选择新鲜、无霉变、成熟度较高、胚芽完好，颗粒饱满成熟、没有破损的的当年产绿豆；

2、发芽、磨浆：将绿豆洗净后用0.04%次氯酸钠溶液浸泡0.5h，浸泡后的绿豆彻底洗净后于25℃发芽36h，每隔12h换一次水；将获得的豆芽与水按质量体积比为1:8混合后放入胶体磨中磨浆8min，获得初级豆芽乳；

3、过滤、脱脂：将初级豆芽乳依次通过80-200目滤布逐级过滤，再煮沸脱脂；

4、调配：将3%葡萄糖、6%白砂糖、0.08%食用琼脂混合加水后，加热溶解，并与煮沸的初级豆芽乳（90%）混合，加入0.06%柠檬酸钠，充分搅拌，使各组分混合混匀；

5、均质：将步骤4所得混合液直接送入高压均质机中均质5min，均质温度为50℃，均质压力为30MPa；

6、杀菌、冷却：将步骤5所得均质混合液进行巴氏杀菌后，再冷却到40℃；

7、接种、发酵：将嗜热链球菌（CICC 20174）和保加利亚乳杆菌（CICC 20358）以及肠膜明串珠菌（CICC 20713）按成品量的0.2%，0.16%和0.5%接入到步骤6所得混合液中，在40℃恒温培养箱中培养6h至豆芽乳凝固；

8、后熟：发酵豆芽乳冷却到4℃，放入冰箱中在此温度下保温20h，使产品具有良好的口感和风味；

9、灭菌：将经过后熟的豆芽酸乳置于72℃恒温箱中保持20s后，冷却至室温。

实施例四：黑豆与云南小粒黄豆豆芽发酵乳的制备

黑豆与小粒黄豆也是大豆种子，但是其蛋白质含量比普通大豆还要高，而且其种皮中含有更丰富的花青素、铁等矿质元素和Vit E等维生素。使用黑豆与小粒黄豆制备的豆芽发酵乳具有特殊的外观，具有更加丰富的营养。由于黑豆与小粒黄豆在中医上具有诸多功能，因而制备的豆芽发酵乳更具保健功能，是中老年人群的绝佳营养保健食品。本实例中使用黑豆芽与云南小粒黄豆芽为唯一发酵营养基质，制备凝固型全植物蛋白饮料。该工艺中黑豆和小粒黄豆分别经过36h和48h发芽后，磨浆制成豆芽乳，经过滤、脱脂、调配、均质、杀菌、冷却、接种、发酵、后熟制成后冷藏，具体步骤如下：

1、原料选择：选择新鲜、无霉变、成熟度较高、胚芽完好，颗粒饱满成熟、没有破损的当年产黑豆与小粒黄豆；

2、发芽、磨浆：将黑豆与小粒黄豆洗净后用0.04%次氯酸钠溶液浸泡0.5h，浸泡后的黑豆与小粒黄豆彻底洗净后于25℃分别发芽36h和48h，每隔12h换一次水；将获得的豆芽与水按质量体积比为1:8混合后放入胶体磨中磨浆5min，获得初级豆芽乳；

3、过滤、脱脂：将初级豆芽乳依次通过80-160目滤布逐级过滤，再煮沸脱脂；

4、调配：将1%葡萄糖、8%白砂糖混合加水后，加热溶解，并与煮沸的初级豆芽乳（90%）混合，加入0.03%柠檬酸钠，充分搅拌，使各组分混合混匀；

5、均质：将步骤4所得混合液直接送入高压均质机中均质3min，均质温度为40℃，均质压力为32MPa；

6、杀菌、冷却：将步骤5所得均质混合液进行巴氏杀菌后，再冷却到40℃；

7、接种、发酵：将嗜热链球菌（CICC 20174）和保加利亚乳杆菌（CICC 20358）以及肠膜明串珠菌（CICC 20713）按成品量的0.3%，0.3%和0.37%接种到步骤6所得混合液中，在40℃恒温培养箱中培养5h至豆芽乳凝固；

8、后熟：发酵豆芽乳冷却到室温，放入4℃冰箱中保温24h，使产品具有良好的口感和风味；

9、冷藏：将成品置于2-6℃的冷库内贮藏。

实施例五：多种乳酸菌混合发酵豆芽乳的制备

乳酸菌是公认的食品级微生物，研究表明多种乳酸菌具有很强的保健功能，如增强免疫力、抗癌、缓解糖尿病、改善心血管疾病等的功效。本实例中尝试使用了肠膜明串珠菌结合不同的乳酸菌进行豆芽发酵乳的制备。该工艺中大豆经过48h发芽后，磨浆制成豆芽乳，经过滤、脱脂、调配、均质、杀菌、冷却、接种、发酵、后熟制成后冷藏，具体步骤如下：

1、原料选择：选择新鲜、无霉变、成熟度较高、胚芽完好，颗粒饱满成熟、没有破损的当年产大豆；

2、发芽、磨浆：将大豆洗净后用0.04%次氯酸钠溶液浸泡0.5h，浸泡后的大豆彻底洗净后于25℃发芽48h，每隔12h换一次水；将获得的豆芽与水按质量体积比为1:6混合后放入胶体磨中磨浆5min，获得初级豆芽乳；

3、过滤、脱脂：将初级豆芽乳依次通过80-200目滤布逐级过滤，再煮沸脱脂；

4、调配：将2%葡萄糖、7.45%白砂糖混合加水后，加热溶解，并与煮沸的初级豆芽乳（90%）混合，加入0.05%柠檬酸钠，充分搅拌，使各组分混合混匀；

5、均质：将步骤4所得混合液直接送入高压均质机中均质3min，均质温度为40℃，均质压力为35MPa；

6、杀菌、冷却：将步骤5所得均质混合液进行巴氏杀菌后，再冷却到40℃；

7、接种、发酵：将植物乳杆菌（CICC 20265）、罗伊氏乳杆菌（CICC 6120）以及肠膜明串珠菌（CICC 20713）按成品量的0.15%，0.1%和0.25%接入到步骤6所得混合液中为第一组，将长双歧杆菌（CICC 6068）、戊糖乳杆菌（CICC 22174）以及肠膜明串珠菌（CICC 20713）按成品量的0.2%，0.2%和0.1%接入到步骤6所得混合液中为第二组，分别在40℃恒温培养箱中培养4h至豆芽乳凝固；

8、后熟：发酵豆芽乳冷却到室温，放入4℃冰箱中保温16h，使产品具有良好的口感和风味；

9、冷藏：将成品置于2-6℃的冷库内贮藏。

实施例六：添加果粒的风味豆芽乳的制备

果粒型酸豆芽乳是经过调配，添加了不同水果果肉或者果汁而得到的风味豆芽发酵乳。通过调配赋予了发酵豆芽乳水果的风味，同时增加了水果中的膳食纤维与维生素。更加丰富了发酵豆芽乳的产品类型。本实例中首先使用大豆芽为唯一发酵营养基质，制备凝固型全植物蛋白饮料。在其发酵结束后，添加经过杀菌处理的水果果粒并混匀后进行后熟，所得到的风味豆芽发酵乳因其口味丰富，营养健康，适合青少年人群和学生。该工艺中大豆经过48h发芽后，磨浆制成豆芽乳，经过滤、脱脂、调配、均质、杀菌、冷却、接种、发酵、添加果粒、后熟制成后冷藏，具体步骤如下：

1、原料选择：选择新鲜、无霉变、成熟度较高、胚芽完好，颗粒饱满成熟、没有破损的当年产大豆；

2、发芽、磨浆：将大豆洗净后用0.04%次氯酸钠溶液浸泡0.5h，浸泡后的大豆彻底洗净后于25℃发芽48h，每隔12h换一次水；将获得的豆芽与水按质量体积比为1:6混合后放入胶体磨中磨浆5min，获得初级豆芽乳；

3、过滤、脱脂：将初级豆芽乳依次通过80-160目滤布逐级过滤，再煮沸脱脂；

4、调配：将5%葡萄糖、4%白砂糖混合加水后，加热溶解，并与煮沸的初级豆芽乳（90%）混合，加入0.03%柠檬酸钠，充分搅拌，使各组分混合混匀；

5、均质：将步骤4所得混合液直接送入高压均质机中均质3min，均质温度为40℃，均质压力为35MPa；

6、杀菌、冷却：将步骤5所得均质混合液进行巴氏杀菌后，再冷却到40℃；

7、接种、发酵：将嗜热链球菌（CICC 20174）和保加利亚乳杆菌（CICC 20358）以及肠膜明串珠菌（CICC 20713）按成品量的0.42%，0.3%和0.25%接种到步骤6所得混合液中，在40℃恒温培养箱中培养4h至豆芽乳凝固；

8、添加果粒：将葡萄、蓝莓、草莓、黄桃和山药经过清洗、切块、腌制、漂烫灭菌、冷却后加入凝固的豆芽发酵乳中充分搅拌均匀；

9、后熟：发酵豆芽乳冷却到室温，放入4℃冰箱中保温16h，使产品具有良好的口感和特殊的水果风味；

10、冷藏：将成品置于2-6℃的冷库内贮藏。

实施例七：发酵豆芽乳饮料的制备

液体活菌型营养饮料中豆乳的含量较低，而乳酸菌的含量很高，是乳酸菌发挥益生功能的优秀饮料，是优秀的休闲饮品和运动饮料。本实例中以优质大豆为主要原料，经48h发芽后，按豆芽与水质量体积比为1:10进行混合磨浆，制成初级豆芽乳，后再将初级豆芽乳与水进行1:2混合。经过滤、脱脂、调配、均质、杀菌、冷却、接种、发酵、后熟制成后冷藏，具体步骤如下：

1、原料选择：选择新鲜、无霉变、成熟度较高、胚芽完好，颗粒饱满成熟、没有破损的的当年产大豆；

2、发芽、磨浆：将大豆洗净后用0.04%次氯酸钠溶液浸泡0.5h；浸泡后的豆子彻底洗净后置于25℃发芽48h，每隔24h换一次水；再将获得的豆芽与水按质量体积比为1:10混合后放入胶体磨中磨浆10min，获得初级豆芽乳；

3、过滤、脱脂：将初级豆芽乳与水按1:2的比例混合均匀制成稀豆芽乳，依次通过80-200目滤布逐级过滤，再煮沸脱脂；

4、调配：将3.8%葡萄糖、5%白砂糖、0.15%高甲氧基果胶与0.05%柠檬酸钠混合加水后，加热溶解，并与煮沸的稀豆芽乳90%混合，充分搅拌，使各组分混合混匀；

5、均质：将步骤4所得混合液直接送入高压均质机中均质3min，均质温度为50℃，均质压力为30MPa；

6、杀菌、冷却：将步骤5所得均质混合液进行巴氏杀菌后，再冷却到40℃；

7、接种、发酵：将0.5%干酪乳杆菌（CICC 20284）、0.4%副干酪乳杆菌（CICC 22166）0.1%肠膜明串珠菌（CICC 20713）接入到步骤6所得混合液中，在37℃恒温培养箱中培养12h使之具有浓郁的酸味，检测乳酸菌的活菌数达到10⁹/mL；

8、果蔬汁的添加：将橙子、菠菜清洗、榨汁后过滤所得浓滤液经过巴氏灭菌，添加入发酵产物中进行调配使其获得特殊的水果蔬菜风味；

9、后熟：发酵豆乳冷却到室温，放入4℃冰箱中保温24h，使产品形成良好的口感和风味；

10、冷藏 ：将成品置于2-6℃的冷库内贮藏。

实施例八：大豆发芽及发酵过程中蛋白酶活性的测定

在大豆发芽过程以及乳酸菌发酵过程中大豆蛋白进行了复杂的转化，从而使大豆蛋白更容易被人体消化吸收，而这种转化过程是基于大豆发芽过程与乳酸菌发酵过程中各种蛋白酶作用的结果。因而对工艺过程中蛋白酶活性的测定是评价豆芽发酵乳生产工艺的重要部分，这也为发酵豆芽乳的调配制作提供有力的理论基础。测定方法如下：

在一定温度与pH条件下的蛋白酶，由含有酚类的氨基酸水解产生酪蛋白（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，产生钼蓝和钨蓝，采用紫外分光光度法测定，于波长680nm下测定溶液的吸光度。酶的活力与吸光度成比例，由此可以计算出蛋白酶活力。具体步骤如下：

1、试剂配制：

L-酪氨酸标准储备溶液（100µg/mL）

福林试剂 1000mL

碳酸钠溶液（42.4g/L）

硼酸缓冲溶液（pH=10.5，适于碱性蛋白酶测定）

磷酸缓冲溶液（pH=7.5，适于中性蛋白酶测定）

乳酸缓冲溶液（pH=3.0，适于酸性蛋白酶测定）

酪蛋白溶液（10.0g/L）

2、样品制备：准确称取干样品4.0g（样液12.0g），于100mL烧杯中，加入40mL对应缓冲溶液，搅拌均匀，将样品在磁力搅拌器上进行搅拌30min。再将样品转移至50mL离心管中，于8000r/min条件下离心15min，取上清液25mL冷冻干燥。用适量对应的缓冲溶液将样品溶解并将定容至10mL，为待检测酶液。

3、检测流程：待测样品1mL → 40℃预热2min → 加入2%酪蛋白1mL → 40℃精确反应10min →加入0.4M三氯乙酸 2mL立即混匀 → 40℃保持30min → 降至室温 →用11cm Whatman43号滤纸过滤 → 取滤液1mL加入0.5M碳酸钠5mL → 加入福林试剂1mL混匀 →30℃恒温显色20min → 测定680nm波长下的吸光值。

空白对照为待测酶液先加入2mL三氯乙酸灭活后再加入酪蛋白溶液进行反应。

4、酶活的计算：酶活单位=Å×4×n/10/m

其中 Å-酶活力测定的光吸收值，4-反应的总体积，10-反应10min，n-酶液的稀释倍数，m-样品的质量（g）。

5、结果分析：测定结果见图3A和图3B，结果表明三种蛋白酶活性在大豆发芽和豆芽乳发酵过程中均得到了极大的提高。其中以酸性蛋白酶活性的提高最为明显，这与乳酸菌发酵后的豆芽乳呈酸性是相符合的，也是有利于酸性蛋白酶活力的发挥。

实施例九：大豆发芽及豆芽乳发酵过程中游离氨基酸分析

蛋白质是大豆中最重要的营养成分，因而对于其在大豆发芽和豆芽乳发酵后的变化研究尤为重要。在大豆发芽和豆芽乳发酵过程中，蛋白质在蛋白酶的作用下转化为更容易被机体吸收利用的氨基酸和多肽。这种蛋白质由贮藏蛋白向结构蛋白的转化过程中不仅为自身的发育提供了必要的组分，也同时为人类更好的应用提供了有效的营养。游离氨基酸是蛋白质经过复杂代谢后所产生的氨基酸与多肽的总和，在此我们通过测定游离氨基酸的变化来初步反映蛋白质在发芽和豆芽乳发酵过程中的代谢与转化。

本发明使用了国标GB/T 30987-2014第一法分析了大豆发芽前后以及豆芽乳发酵前后的游离氨基酸含量。具体步骤如下：

1、主要试剂：

5%三氯乙酸，柠檬酸，硼氢化钠，无水乙酸钠，聚乙烯月桂醚，冰乙酸，0.25mol/L乙酸锌溶液，1mol/L亚铁氰化钾溶液，三氯甲烷，混合氨基酸标准工作液，茚三酮溶液（现用现配）。

2、样品制备：2g大豆粉或豆芽粉，于200mL沸水中提取10min，离心取上清液，使用三氯甲烷脱脂两次，样品冷冻干燥后溶于200mL 5%三氯乙酸，静置60min并离心除去溶液中的蛋白质，取上清液定容至250mL后经0.45µm滤膜过滤后，为待测样品。

2mL发酵前后豆芽乳样品，加入200mL 5%三氯乙酸，静置60min并离心除去溶液中的蛋白质，取上清液定容至250mL后经0.45µm滤膜过滤后，为待测样品。

3、仪器参数设定：使用日立L-8900型氨基酸分析仪，配备双通道可见光检测器。使用日立生理体液分析住PF，4.6mm×60mm。柱温38-70℃。样品进样量为20µL，流动相使用柠檬酸锂、柠檬酸、氯化锂体系。流速为0.35mL/min。

4、矫正曲线的绘制：用不同梯度浓度的混合氨基酸标准液进行测定，得到每一种氨基酸的峰面积，以峰面积为纵坐标，氨基酸浓度为横坐标建立矫正曲线，保留时间的不同标定出不同的氨基酸峰。

5、游离氨基酸含量计算：W=[（c-ck）×V×M×10^-6]/[m×m1]×100%

其中，W-氨基酸含量（mg/100g），c-试样中氨基酸浓度（nmol/mL）ck-空白中氨基酸浓度（nmol/mL），V-试样体积（mL），M-每种氨基酸分子量（g/mol），m-样品质量（g），m1-试样干物率。每个样品测定两次，取平均值。

结果分析：通过氨基酸分析仪分析了大豆和大豆芽的氨基酸组成和含量，结果表明大豆经过发芽后游离氨基酸含量大大增加。图5列举了其中几种变化最大的氨基酸，从图中我们可以看出丙氨酸、天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的含量均有明显的增加，而含量增加最明显的是γ-氨基丁酸和β-氨基异丁酸。研究表明这两种氨基酸具有较强的保健功能，在功能性保健食品研发中很受欢迎，也是本发明成为保健食品的重要内容。