本发明属于食品技术领域，具体涉及食品工程和食品发酵工程和食品添加工程，更具体地，涉及一种保肝普洱茶及其制备方法和应用。
技术背景：
乙醇又名酒精，属全球性的饮料及食品添加剂。每年因过量饮酒导致的死亡人数高达250万。肝脏是人体代谢乙醇的主要器官，很容易遭受乙醇损伤。并且，酒精性肝损伤通常是导致酒精性脂肪肝、肝炎、肝硬化的元凶，严重威胁着乙醇接触者的健康。尽管现代医学高速发展，肝病的治疗仍然是一个没有解决的世界难题。因此，一些保肝产品的开发应用，对预防和减轻酒精肝损伤具有重要的意义。
普洱茶是以云南特产大叶种茶的晒青毛茶为原料，在微生物的作用下经过自然或人工辅助发酵过程形成的一类特殊的后发酵茶类。由于其独特的风味、汤色以及显著的抗氧化、降血脂、保护心血管、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性和保健功效而备受青睐，是中国乃至东南亚地区非酒精类饮料的主流产品。
梁王茶为五加科异参属(Metapanax)植物，主要分布于云贵川三省，其叶及嫩茎是当地普遍食用的野生蔬菜和代茶用植物，含有丰富的齐墩果烷型三萜皂苷和黄酮苷，具有清热解毒、活血化瘀的功效。此外，该植物的水提物和乙醇提取物还具有很强的预防和降低肝细胞损伤的功能。
将普洱茶与梁王茶提取物或梁王茶条形茶进行合理搭配，既保证了普洱茶的风味又为普洱茶增加了保护酒精性肝损伤的新功效。目前，现有技术中未见有上述将普洱茶与梁王茶提取物或梁王茶条形茶有机结合所制得的新型保健饮品的报道。
技术实现要素：
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本发明旨在提供一种功能型普洱茶，该普洱茶是在传统优质普洱茶中添加适当比例的梁王茶提取物或梁王茶条形茶，该普洱茶除具有传统普洱茶的风味及功效外，更增添了对酒精性肝细胞损伤的预防和保护作用。同时提供该功能性普洱茶的制备和应用方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种保肝普洱茶，在固态发酵的普洱茶中加入占普洱茶和梁王茶提取物总重量的5-10％重量百分比的梁王茶提取物。
根据所述的一种保肝普洱茶，所述的梁王茶为掌叶梁王茶(Metapanaxdelavayi)和异叶梁王茶(Metapanax davidii)。
根据所述的一种保肝普洱茶，其中所述的梁王茶提取物是由下述方法制备而得：
取掌叶梁王茶和异叶梁王茶鲜叶，清洗、晾干表面水分、粉碎；将粉碎后的新鲜梁王茶叶碎末置于回流提取装置内，于70％乙醇在70℃下加热回流提取3小时，梁王茶叶碎末体积∶70％乙醇体积为1∶2；回流提取液冷却，离心，上清液减压浓缩去除乙醇，得水溶液；水溶液经D-101大孔树脂色谱柱，乙醇∶水体积比为6-8∶4-2的溶液洗脱，洗脱液减压浓缩至干。
根据所述的一种保肝普洱茶，其中所述的梁王茶提取物中含有丰富的三萜皂苷和黄酮苷：3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖基-28-O-β-D-葡萄吡喃糖基(6→1)-O-β-D-葡萄吡喃糖基-3β-羟基齐墩果烷-12-烯-28,29-二烯酸，3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖基-3β-羟基齐墩果烷-12-烯-28,29-二羧酸，3-O-β-D-木吡喃糖基-3β-羟基齐墩果烷-12-烯-28，29-二羧酸，3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖基-3β-羟基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸，3-O-α-(2'-O-乙酰基)-L-阿拉伯吡喃糖基-3β-羟基齐墩果-12-烯-28,29–二羧酸，3-O-α-(4'-O-乙酰基)-L-阿拉伯吡喃糖基-28-O-α-L鼠李糖基(4→1)-O-β-D-葡萄吡喃糖基(6→1)-O-β-D-葡萄吡喃糖基-3β-羟基齐墩果-12-烯-28,29-二羧酸,3-O-α-(2'-O-乙酰基)-L-阿拉伯吡喃糖基-28-O-α-L鼠李糖基(4→1)-O-β-D-葡萄吡喃糖基(6→1)-O-β-D-葡萄吡喃糖基-3β-羟基齐墩果-12-烯-28,29-二羧酸,4,5-O-双咖啡酰基奎宁酸，3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷吡喃糖苷，槲皮素-3-O-β-D-半乳吡喃糖基(1→6)葡萄糖吡喃糖苷，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基吡喃糖苷等齐墩果烷型三萜皂苷和黄酮苷。
本发明还提供了另外一种保肝普洱茶，在固态发酵的普洱茶中加入占普洱茶和梁王茶条形茶总重量的20-30％重量百分比的梁王茶条形茶。
根据所述的一种保肝普洱茶，所述的梁王茶条形茶是指以掌叶梁王茶和异叶梁王茶的鲜叶为原料，经杀青、揉捻、干燥制成。
根据所述的一种保肝普洱茶，所述普洱茶是由云南特产大叶种茶的芽及嫩叶，经“杀青”、揉捻，人工干燥或日光干燥后得到晒青毛茶，用普洱茶后发酵优势菌的菌悬液、粗酶提取液将晒青毛茶潮水至35-45％，于38‐40℃条件下控温发酵25‐45天，发酵完成后取出、晾干、筛检后放置于20-25℃通风、干燥的条件下陈化3-5月，在陈化后的普洱茶中加入占普洱茶和梁王茶提取物总重量5-10％重量百分比的梁王茶提取物或占普洱茶和梁王茶条形茶总重量20-30％重量百分比的梁王茶条形茶，即得保肝普洱茶。
根据所述的一种保肝普洱茶，所述的云南特产大叶种茶是指云南栽培、野生和半野生的大叶种茶的基原及近缘植物中儿茶素类成分含量较高的种类：大叶茶或大理茶或厚轴茶或马关茶；所述的普洱茶后发酵优势菌株为帚状曲霉Aspergillus penicilliodes Speg.KZ1630；臭曲霉A.foetidus Thom&Raper.KZ1633；日本曲霉原变种A.japonicus Saito var.japonicus.KZ1634；局限灰曲霉A.restrictus Smith.KZ1636；多育曲霉A.proliferans Smith.KZ1637；寄生曲霉A.parasiticus Speare.KZ-1638；合阳曲霉A.heyangensis Qi et al.KZ1639；米曲霉(A.oryzae KZ1640)中的一种或多种组合。
根据所述的一种保肝普洱茶，所述的普洱茶后发酵优势菌的菌悬液中菌体与菌液的体积比为0.2-0.5％；普洱茶后发酵优势菌粗酶提取液中纤维素酶活性3-4U/mL、蛋白酶活性4-5U/mL、多酚氧化酶活性≥2.5U/g。
根据所述的一种保肝普洱茶，所述的普洱茶具有降低酒精对肝细胞的损伤作用，其作用效果是姜黄素的1.6倍以上。
根据所述的一种保肝普洱茶，其进一步为由该普洱茶进一步加工成的袋泡茶、速溶茶及其它饮用方式的茶类。
本发明另外还提供了所述的一种保肝普洱茶在制备保肝药物或保健品中的应用。
此外，本发明还提供了所述的一种保肝普洱茶的制备方法，该方法包括优质普洱茶的生产、梁王茶提取物的制备、梁王茶条形茶的制备、普洱茶与梁王茶提取物及与梁王茶条形茶的组合、普洱茶属性特征的评价及降低酒精性肝细胞损伤的活性评价步骤：
所述的普洱茶由下述方法制备：晒青毛茶的制备、发酵菌液的制备、发酵用菌酶液的制备、渥堆、干燥和陈化而得；
所述的晒青毛茶是指采用云南栽培、野生和半野生的大叶种茶的基原及近缘植物中儿茶素类成分含量较高的种类：大叶茶或大理茶或厚轴茶或马关茶的芽及幼嫩茎叶，经杀青、揉捻、日光干燥等过程获得；
所述的发酵菌液的制备是指采用传统的真菌液体培养方法，将普洱茶后发酵优势菌株在液体马铃薯葡萄糖培养基中悬浮培养待球状菌丝体长至80％V/V的菌丝体/菌液时，收获菌丝体，匀浆，用无菌水配成含有0.2-0.5菌体的菌悬液，所述的菌丝体/菌液是指菌丝体体积占菌液总体积的比值；
所述的发酵菌酶液的制备是指普洱茶后发酵优势菌株依照微生物液体发酵的规范技术要求，在液体马铃薯葡萄糖培养基中添加0.3-0.5％的茶多酚、以摇床悬浮培养的方式对菌株和菌群进行悬浮培养，待球状菌丝体长至80％V/V的菌丝体/菌液时，将菌悬液进行匀浆，在pH7.2的磷酸缓冲溶液于室温下震荡提取1h，缓冲液与菌体匀浆液的体积比为2∶1，8000r/min离心10min，上清液为发酵用的菌酶液，所述的菌丝体/菌液是指菌丝体体积占菌液总体积的比值；
所述的晒青毛茶渥堆发酵是指将发酵用菌酶提取液稀释至纤维素酶活性3-4U/mL、蛋白酶活性4-5U/mL、多酚氧化酶活性≥2.5U/g的葡萄糖水溶液，其中葡萄糖含量为0.1％，用小型喷雾器将上述特制外源生物酶即特制粗酶提取液均匀喷洒于发酵槽和发酵框内的晒青毛茶表面，边喷洒边搅动，至茶叶含水量为35-38％，发酵温度保持在35-40℃，发酵湿度保持在35-38％；
所述的普洱茶干燥和陈化是指将后发酵完毕的普洱茶叶进行晾晒或风干、筛检、紧压或散装后置于阴凉、通风、干燥环境中进行陈化2-3个月；
所述的梁王茶提取物由下述方法制备：取掌叶梁王茶和异叶梁王茶鲜叶，清洗、晾干表面水分、粉碎；将粉碎后的新鲜梁王茶叶碎末置于回流提取装置内，于70％乙醇在70℃下加热回流提取3次，每次1小时，梁王茶叶碎末体积∶70％乙醇体积为1∶2；回流提取液冷却，离心，上清液减压浓缩去除乙醇，得水溶液；水溶液经D-101大孔树脂色谱柱，乙醇∶水体积比为6-8∶4-2的溶液洗脱，洗脱液减压浓缩至干，得梁王茶提取物；
所述的梁王茶条形茶由以下方法制备所得：采摘梁王茶新鲜叶片，瞬时加热杀青，手工或机械揉捻，晒干、或烘干、或炒干，即得到梁王茶制作的梁王茶条形茶；
所述的普洱茶与梁王茶提取物的组合是指将梁王茶提取物按占普洱茶和梁王茶提取物总重量5-10％的重量百分比与陈化完成后的普洱茶进行组合，用60℃热水溶解后均匀喷洒于事前制备的普洱茶表面，充分混匀并干燥；
所述的普洱茶与梁王茶条形茶组合是指将制备好的梁王茶条形茶按照占普洱茶和梁王茶条形茶总重量20-30％的重量百分比与陈化完成后的普洱茶进行充分混匀；
所述的普洱茶属性特征评价，指的是按照常规方法冲泡，对其汤色、香气、滋味和叶底指标进行感官评价；同时，结合采用HPLC、LC-MS分析方法对普洱茶特征成分没食子酸、儿茶素、咖啡因含量变化进行检测，采用UV方法对普洱茶特征指标总多酚、总多糖、茶色素、明亮度进行检测，采用GC-MS检测方法对后发酵过程中的普洱茶进行芳香族类香气成分占总香气成分的含量进行检测，芳香族类香气成分是指棕榈酸、十八烷-9,12-二烯酸、1,2,3-三甲氧基苯、5-甲基-1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、2,3-二甲氧基苯；
所述的保肝普洱茶降低酒精性肝细胞损伤的活性评价是指，精密称取保肝普洱茶10g，粉碎后用70％乙醇100ml于80℃水浴中提取60min，冷却、过滤、滤液真空浓缩干燥，得标准提取物，取对数生长期的HepG2细胞8x104cells/100μl.well接种于96孔细胞板中，37℃、5％CO2条件培养44小时，取浓度为50μg/ml的保肝普洱茶标准提取物溶液10μl加入孔内，同时设有以姜黄素25μM为阳性对照，于37℃、5％CO2条件培养4小时，每孔加入100μl含有8％乙醇的培养基，相同培养条件下继续培养24小时，控干培养基，加入200μl 10％ALamar blue的培养溶液，充分混匀，相同条件下继续培养3小时，测定570nm的OD值，并按下述公式计算细胞存活率：
细胞成活率(％)＝[(实验组OD值–对照组OD值)/(模型组OD值–对照组OD值)]*100％。
与现有研究相比，本发明具有如下的有异性：
1.本发明所提供的一种保肝普洱茶是由传统优质普洱茶与民间常用作茶饮的梁王茶有机结合；
2.本发明所提供的一种保肝普洱茶的制备方法简便，成本低廉，适合工业化生产，一般的茶叶加工厂均可采用，具有很高的实用性；
3.本发明所提供的一种保肝普洱茶不仅保留了传统优质普洱茶的风味特征，更具有预防和降低酒精性肝损伤的功能。
具体实施方式：
下面以本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
步骤1：优质普洱茶的生产：
将200公斤澜沧古茶(Camellia sinensis var.assamica)制成的晒青毛茶80℃热风处理1小时，冷却后均匀铺撒于拌样槽中，臭曲霉(Aspergillus foetidus Thom&Raper.KZ1633)+日本曲霉原变种(A.japonicus Saito var.japonicus.KZ1634)两个单一菌株按1∶1的接种量悬浮培养于含茶多酚(0.4％)的改良马铃薯葡萄糖茶多酚液体培养基中，待菌丝体生长至浓度为80％V/V(菌丝体/菌液)时，对菌悬液进行匀浆，再用pH7.2的磷酸缓冲溶液于室温下震荡提取1h(缓冲液与菌体匀浆液的体积比为2∶1)，8000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。用0.1％的葡萄糖水溶液调制粗酶液，使其纤维素酶活性3-4U/mL、蛋白酶活性4-5U/mL、多酚氧化酶活性≥2.5U/g，即得发酵用粗酶液。用该调制好的发酵用粗酶液70公斤，多次均匀的喷洒于晒青毛茶中，至晒青毛茶含水量为35-38％，将混拌好的晒青毛茶转移至发酵槽内(长；1.20m，宽：0.60m，高：0.20m)，用麻布盖严发酵槽上方，于40-45℃进行发酵。发酵40天后取出、晾干、筛检后放置于20-25℃条件下通风陈化3个月，即得优质普洱茶产品。
步骤2：梁王茶标准提取物的制备：
取掌叶梁王茶鲜叶150kg，清洗、晾干表面水分、粉碎；将粉碎后的新鲜掌叶梁王茶碎叶末置于回流提取装置内，于70％乙醇在70℃下加热回流提取3次，每次1小时，掌叶梁王茶叶碎末体积：70％乙醇体积为1：2；回流提取液冷却，3层棉纱过滤、滤液离心，上清液减压浓缩去除乙醇，得水溶液；水溶液经D-101大孔树脂色谱柱，乙醇：水体积比为6-8：4-2的溶液洗脱，洗脱液减压浓缩至干，即得梁王茶提取物。
步骤3：保肝普洱茶的制备：
精密称取步骤2所得的掌叶梁王茶提取物10kg，溶解于60L温度为60℃的热水中，将配制好的掌叶梁王茶提取物水溶液均匀喷洒于步骤1所得的200kg普洱茶中，边喷洒边翻动，使掌叶梁王茶提取物溶液与普洱茶混合均匀，于40℃条件下进行低温通风干燥。
步骤4：保肝普洱茶品质特征及活性评价：
品质特征评价：采用高效液相色谱法、分光光度法、挥发油提取法对步骤3所得产品呈味物质(总多酚、总多糖、没食子酸和咖啡因)含量，呈色物质(茶黄素、茶红素、茶褐素及明亮度)，香气成分含量进行检测。结果得出该产品含有总多酚9.03％；总多糖4.35％；没食子酸1.03％；咖啡因3.22％；茶黄素0.13％、茶红素2.01％、茶褐素6.21％；明亮度2.05；芳香族类香气成分占香气成分的16％。
保肝活性评价：精密称取步骤3所得的保肝普洱茶10g，粉碎后用70％乙醇100ml于80℃水浴中提取60min，冷却、过滤、滤液真空浓缩干燥，得标准提取物。取对数生长期的HepG2细胞(8x104cells/100μl.well)接种于96孔细胞板中，37℃、5％CO2条件培养44小时，取10μl保肝普洱茶标准提取物溶液(50μg/ml)加入孔内，同时设有以姜黄素(25μM)为阳性对照，于37℃、5％CO2条件培养4小时，每孔加入100μl含有8％乙醇的培养基，相同培养条件下继续培养24小时，控干培养基，加入200μl10％ALamar blue的培养溶液，充分混匀，相同条件下继续培养3小时，测定570nm的OD值，并按下述公式计算细胞存活率。
细胞成活率(％)＝[(实验组OD值–对照组OD值)/(模型组OD值–对照组OD值)]*100％(注：实验组，指采用10μl保肝普洱茶标准提取物溶液(50μg/ml)提前干预4h培养的HepG2细胞；对照组，指正常培养的HepG2细胞；模型组，指采用100μl含有8％乙醇的培养基干预24h培养的HepG2细胞。)
表1本实施例保肝普洱茶的活性评价结果
实施例2
步骤1：优质普洱茶的生产：
将100公斤澜沧生态茶(Camellia sinensis var.assamica)制成的晒青毛茶80℃热风处理1小时，冷却后均匀铺撒于拌样槽中，臭曲霉(A.foetidus Thom&Raper.KZ1633)+米曲霉(A.oryzae KZ1640)两个单一菌株按1∶1的接种量悬浮培养于含茶多酚(0.4％)的改良马铃薯葡萄糖茶多酚液体培养基中，待菌丝体生长至浓度为80％V/V(菌丝体/菌液)时，对菌悬液进行匀浆，匀浆液用无菌水按1:200进行稀释。取稀释好的臭曲霉+米曲霉混合菌液25升，用喷壶均匀喷洒在热风经热风处理、冷却后的澜沧生态晒青毛茶表面，至晒青毛茶含水量为35-38％，将混拌好的晒青毛茶转移至发酵槽内(长；1.20m，宽：0.60m，高：0.20m)，用麻布盖严发酵槽上方，于40-45℃进行发酵。发酵30天后取出、晾干、筛检后放置于20-25℃条件下通风陈化3个月，即得优质普洱茶产品。
步骤2：梁王茶条形茶的制备：
取掌叶梁王茶鲜叶150kg，清洗、晾干表面水分，瞬时加热杀青，用制茶机械揉捻机揉捻成型、烘干后即得到掌叶梁王茶制作的梁王茶条形茶。
步骤3：保肝普洱茶的制备：
精密称取步骤1制备的普洱茶80kg，步骤2制备的掌叶梁王茶条形茶20kg，充分混匀即得保肝普洱茶散茶。将混合均匀的保肝普洱茶散茶采用蒸汽加热回软，在普洱茶饼、沱、珠等模具中压制成型并干燥，即得保肝普洱茶饼茶、沱茶和珠茶。
步骤4：保肝普洱茶品质特征及活性评价：
品质特征评价：采用高效液相色谱法、分光光度法、挥发油提取法对步骤3所得产品呈味物质(总多酚、总多糖、没食子酸和咖啡因)含量，呈色物质(茶黄素、茶红素、茶褐素及明亮度)，香气成分含量进行检测。结果得出该产品含有总多酚7.23％；总多糖3.35％；没食子酸0.73％；咖啡因2.52％；茶黄素0.09％、茶红素1.6％、茶褐素5.21％；明亮度2.55；芳香族类香气成分占香气成分的12％。
保肝活性评价：精密称取步骤3所得的保肝普洱茶10g，粉碎后用70％乙醇100ml于80℃水浴中提取60min，冷却、过滤、滤液真空浓缩干燥，得标准提取物。取对数生长期的HepG2细胞(8x104cells/100μl.well)接种于96孔细胞板中，37℃、5％CO2条件培养44小时，取10μl保肝普洱茶标准提取物溶液(50μg/ml)加入孔内，同时设有以姜黄素(25μM)为阳性对照，于37℃、5％CO2条件培养4小时，每孔加入100μl含有8％乙醇的培养基，相同培养条件下继续培养24小时，控干培养基，加入200μl10％ALamar blue的培养溶液，充分混匀，相同条件下继续培养3小时，测定570nm的OD值，并按下述公式计算细胞存活率。
细胞成活率(％)＝[(实验组OD值–对照组OD值)/(模型组OD值–对照组OD值)]*100％(注：实验组，指采用10μl保肝普洱茶标准提取物溶液(50μg/ml)提前干预4h培养的HepG2细胞；对照组，指正常培养的HepG2细胞；模型组，指采用100μl含有8％乙醇的培养基干预24h培养的HepG2细胞。)
表2本实施例保肝普洱茶活性评价结果
实施例3
步骤1：优质普洱茶的生产：
同实施例1中的步骤1制备得优质普洱茶。
步骤2：梁王茶标准提取物的制备：
取异叶梁王茶鲜叶150kg，清洗、晾干表面水分、粉碎；将粉碎后的新鲜异叶梁王茶碎叶末置于回流提取装置内，于70％乙醇在70℃下加热回流提取3次，每次1小时，异叶梁王茶叶碎末体积：70％乙醇体积为1：2；回流提取液冷却，3层棉纱过滤、滤液离心，上清液减压浓缩去除乙醇，得水溶液；水溶液经D-101大孔树脂色谱柱，乙醇：水体积比为6-8：4-2的溶液洗脱，洗脱液减压浓缩至干，即得梁王茶提取物。
步骤3：保肝普洱茶的制备：
精密称取步骤2中制备的异叶梁王茶提取物10kg，溶解于60L温度为60℃的热水中，将配制好的异叶梁王茶提取物水溶液均匀喷洒于步骤1中制备的200kg普洱茶中，边喷洒边翻动，使异叶梁王茶提取物溶液与普洱茶混合均匀，于40℃条件下进行低温通风干燥。
步骤4：保肝普洱茶品质特征及活性评价：
品质特征评价：采用高效液相色谱法、分光光度法、挥发油提取法对步骤3所得产品呈味物质(总多酚、总多糖、没食子酸和咖啡因)含量，呈色物质(茶黄素、茶红素、茶褐素及明亮度)，香气成分含量进行检测。结果得出该产品含有总多酚9.13％；总多糖4.25％；没食子酸1.06％；咖啡因3.12％；茶黄素0.12％、茶红素2.11％、茶褐素6.23％；明亮度2.07；芳香族类香气成分占香气成分的16％。
保肝活性评价：精密称取步骤3所得的保肝普洱茶10g，粉碎后用70％乙醇100ml于80℃水浴中提取60min，冷却、过滤、滤液真空浓缩干燥，得标准提取物。取对数生长期的HepG2细胞(8x104cells/100μl.well)接种于96孔细胞板中，37℃、5％CO2条件培养44小时，取10μl保肝普洱茶标准提取物溶液(50μg/ml)加入孔内，同时设有以姜黄素(25μM)为阳性对照，于37℃、5％CO2条件培养4小时，每孔加入100μl含有8％乙醇的培养基，相同培养条件下继续培养24小时，控干培养基，加入200μl10％ALamar blue的培养溶液，充分混匀，相同条件下继续培养3小时，测定570nm的OD值，并按下述公式计算细胞存活率。
细胞成活率(％)＝[(实验组OD值–对照组OD值)/(模型组OD值–对照组OD值)]*100％(注：实验组，指采用10μl保肝普洱茶标准提取物溶液(50μg/ml)提前干预4h培养的HepG2细胞；对照组，指正常培养的HepG2细胞；模型组，指采用100μl含有8％乙醇的培养基干预24h培养的HepG2细胞。)
表3本实施例保肝普洱茶活性评价结果
实施例4
步骤1：优质普洱茶的生产。
同实施例2，步骤1方法获得优质普洱茶。
步骤2：梁王茶条形茶的制备：
取异叶梁王茶鲜叶150kg，清洗、晾干表面水分，瞬时加热杀青，用制茶机械揉捻机揉捻成型、烘干后即得到异叶梁王茶制作的梁王茶条形茶。
步骤3：保肝普洱茶的制备：
精密称取步骤1制备的普洱茶80kg，步骤2制备的异叶梁王茶条形茶20kg，充分混匀即得保肝普洱茶散茶。将混合均匀的保肝普洱茶散茶采用蒸汽加热回软，在普洱茶饼、沱、珠等模具中压制成型并干燥，即得保肝普洱茶饼茶、沱茶和珠茶。
步骤4：保肝普洱茶品质特征及活性评价：
品质特征评价：采用高效液相色谱法、分光光度法、挥发油提取法对该产品呈味物质(总多酚、总多糖、没食子酸和咖啡因)含量，呈色物质(茶黄素、茶红素、茶褐素及明亮度)，香气成分含量进行检测。结果得出该产品含有总多酚6.93％；总多糖3.37％；没食子酸0.83％；咖啡因2.62％；茶黄素0.09％、茶红素1.61％、茶褐素5.24％；明亮度2.56；芳香族类香气成分占香气成分的12％。
保肝活性评价：精密称取步骤3所得保肝普洱茶10g，粉碎后用70％乙醇100ml于80℃水浴中提取60min，冷却、过滤、滤液真空浓缩干燥，得标准提取物。取对数生长期的HepG2细胞(8x104cells/100μl.well)接种于96孔细胞板中，37℃、5％CO2条件培养44小时，取10μl保肝普洱茶标准提取物溶液(50μg/ml)加入孔内，同时设有以姜黄素(25μM)为阳性对照，于37℃、5％CO2条件培养4小时，每孔加入100μl含有8％乙醇的培养基，相同培养条件下继续培养24小时，控干培养基，加入200μl10％ALamar blue的培养溶液，充分混匀，相同条件下继续培养3小时，测定570nm的OD值，并按下述公式计算细胞存活率。
细胞成活率(％)＝[(实验组OD值–对照组OD值)/(模型组OD值–对照组OD值)]*100％(注：实验组，指采用10μl保肝普洱茶标准提取物溶液(50μg/ml)提前干预4h培养的HepG2细胞；对照组，指正常培养的HepG2细胞；模型组，指采用100μl含有8％乙醇的培养基干预24h培养的HepG2细胞。)
表4本实施例保肝普洱茶活性评价结果