本发明蛋白质的加工技术领域，更具体的说，是涉及一种金属阳离子协同磷酸化改善虾蛄肌原纤维蛋白功能特性的方法。
背景技术
虾蛄(mantisshrimp)，又称为皮皮虾、琵琶虾、虾爬子等，是一种营养丰富、肉质鲜美嫩滑的海味产品，因其有着特殊诱人的味道，深受人们喜爱。虾蛄肉含有丰富的蛋白质，干重的皮皮虾中含有74.39％蛋白质，其中人体内所需氨基酸含量全面，组成合理，易于人体消化吸收，尤其是赖氨酸等必需氨基酸含量较高，如谷氨酸、甘氨酸等。虾蛄中还含有大量的磷、钙、镁等微量元素，其中镁能够调节心脏活动，能够很好地保护心血管系统，减少血液中胆固醇的含量，防止动脉硬化，同时还能扩张冠状动脉，有利于预防心肌梗死；钙能维持体内酸碱平衡，维持肌肉神经的正常兴奋，降低细胞与毛细血管的通透性；磷能够促进成长，协助脂肪和淀粉的代谢，对小儿、孕妇都有补益功效。虾蛄体内还含有虾青素，能增强免疫力，预防癌症和心血管疾病。
虾蛄的营养价值极高且产量大,但其上市时间十分集中、鲜销十分有限。为了使虾蛄能被更合理的加工利用，减少营养价值的流失，提高经济效益，对虾蛄肌原纤维蛋白进行改性显得尤为重要。
磷酸化改性是食品蛋白质改性的有效方式，能够改善食品蛋白质的功能特性，扩大食品蛋白质应用领域，这主要归功于磷酸化操作简便，效率高，专一性强，成本低，功能特性改变明显等优点。《鸡肉与虾蛄中肌原纤维蛋白磷酸化特性的比较》(王诗萌,张坤生,任云霞，《食品与发酵工业》,2015,41(09):24-28)公开了一种通过磷酸化改性虾蛄中肌原纤维蛋白的方法，该方法能在一定程度上改善肌原纤维蛋白的凝胶强度及保水性，但改性手段单一，效果有限。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷，提供一种金属阳离子协同磷酸化改善虾蛄肌原纤维蛋白功能特性的方法，以提高蛋白品质。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种改善虾蛄肌原纤维蛋白功能特性的方法，包括下述步骤：
(1)肌原纤维蛋白提取：将虾蛄肉加入蛋白提取液，高速匀浆后离心留沉淀，重复上述操作，得到肌原纤维粗蛋白；将所得肌原纤维粗蛋白再加入盐溶液高速匀浆离心留沉淀，重复上述操作，即得肌原纤维蛋白；
(2)添加三聚磷酸钠和金属阳离子：添加金属阳离子盐溶于三聚磷酸钠溶液中，再加入步骤(1)提取的肌原纤维蛋白，高速匀浆、磁力搅拌反应2-2.5h，得到金属离子协同磷酸化肌原纤维蛋白溶液。
(3)肌原纤维蛋白凝胶制备：将上述反应后的金属离子协同磷酸化肌原纤维蛋白溶液水浴加热，以1℃/min的升温速率从20℃升至75℃，在75℃保温一定时间后，迅速冷却至室温后得到蛋白凝胶。
步骤(1)中所述的蛋白提取液的组成为：0.1mol/l氯化钠、0.002mol/l氯化镁、0.001mol/l乙二胺四乙酸二钠和ph＝7的0.1mol/l磷酸氢二钠/磷酸二氢钠的混合溶液。
步骤(1)中所述的盐溶液为0.1mol/l的氯化钠溶液。
步骤(2)中所述金属阳离子盐为氯化钾、氯化钠或氯化镁，取氯化钾、氯化钠、氯化镁的质量按照浓度分别为0.01mol/l-0.05mol/l计算。
步骤(2)中所述三聚磷酸钠溶液的浓度为3％-5％(w/v)，ph值为7.95-8.05。
步骤(3)中制备凝胶的磷酸化肌原纤维蛋白溶液的终浓度为38mg/ml-42mg/ml。
步骤(3)在75℃的保温时间为20min-30min。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用金属离子与磷酸化改性相结合改善虾蛄肌原纤维蛋白功能特性的方法，通过磷酸化引入大量的磷酸根，改变了蛋白质的电负性，蛋白分子间的静电斥力增加，进而提高了蛋白的溶解度，并改变了蛋白质分子的交联特性，有利于改善蛋白的乳化活性及凝胶硬度、保水性。通过金属阳离子的引入，一方面促进蛋白分子膨润伸展，促进蛋白质分子间相互作用；另一方面有利于中和蛋白表面的负电荷，增强蛋白质-蛋白质间的离子相互作用，有利于肽链间的相互吸引和聚集，从而形成致密的三维网络结构，进而显著改善蛋白的凝胶特性。且磷酸盐具有螯和金属阳离子的作用,原与蛋白质结合的钙、镁等金属离子被磷酸盐螯和，释放出羧基，由于羧基间存在静电斥力，使蛋白质结构松弛，可以吸收更多量的水分，进一步提高蛋白的乳化活性和凝胶特性。本发明通过金属阳离子协同磷酸化能有效改善肌原纤维蛋白的乳化活性、凝胶硬度、弹性、保水性、白度等功能特性，提高了蛋白品质的同时有效降低了生产成本。
2、本发明的方法中通过金属离子的添加可提高肌原纤维蛋白的生理活性，益于人体健康。
3、本发明的方法有效地减少了虾蛄在加工过程中的功能、营养损失，有利于拓展虾蛄产品的应用范围，具有广阔的市场前景。
4、本发明的方法使用方便，操作简单，与干热法、酶法、物理磷酸化法相比所需时间短。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明中采用乳化活性、凝胶硬度、弹性、保水性和白度评价肌原纤维蛋白的功能特性，具体方法如下：
1、蛋白乳化活性的测定：采用经过金属离子协同磷酸化改性后的肌原纤维蛋白溶液作为样品。取16ml浓度为2mg/ml待测蛋白溶液与4ml大豆油混合放入50ml烧杯中，在11000rpm条件下匀浆2min，分别在0min和10min时从底部吸取100μl，加入到0.1％十二烷基硫酸钠溶液中，振荡混匀后在500nm处测定吸光度，以0.1％十二烷基硫酸钠溶液为空白，每个样品做3次平行，取平均值。根据下述公式(1)计算得蛋白的乳化活性。
公式(1)中：a0为乳状液在0min的吸光度；a10为乳状液在10min的吸光度；n为稀释倍数；c为蛋白质质量浓度，g/ml；φ为油相体积分数(v/v)(φ＝0.2)。
2、蛋白凝胶硬度和弹性的测定：采用经过金属离子协同磷酸化改性后的肌原纤维蛋白凝胶作为待测样品。将制备好的蛋白凝胶在室温下放置30min，用ta-xtplus型质构分析仪测试凝胶的硬度和弹性，参数设置为：
探头：p/0.5；测前速度：2.0mm/s；测后速度：1.0mm/s；测试速度：1.0mm/s；压缩比：40％；触发力：5.0g；触发类型：自动。所有样品做3组平行，取平均值。
3、蛋白凝胶保水性的测定：采用经过金属离子协同磷酸化改性后的肌原纤维蛋白凝胶作为待测样品。取相同质量的蛋白凝胶置于10ml离心管中，在10000r/min、4℃条件下离心10min，根据如下公式(2)计算凝胶的保水性，每组样品做3次平行，取平均值。
公式(2)中：m0是离心管质量，g；m1是离心管与凝胶在离心前的质量和,g；m2是离心管与离心去掉水以后的凝胶的质量和,g。
4、蛋白凝胶白度的测定：将蛋白凝胶放入培养皿中，利用hunterlab色差仪测定凝胶白度值，并记录l*、a*、b*值，根据下述公式(3)计算白度值(whiteness)，其中l*表示明暗度，a*表示绿红值，b*表示蓝黄值。测试前要用标准板进行参数校正，每组样品做3组平行，取平均值。
实施例1
(1)肌原纤维蛋白提取：将-80℃冻藏的虾蛄在4℃条件下解冻24h。将虾蛄去头、尾，剔除虾线、外壳，取肉，经揉捏后称重，加入4倍体积的蛋白提取液，22000rpm高速匀浆30s，在4℃、5000r/min离心15min后，留沉淀，重复上述操作2次，即得虾蛄肌原纤维粗蛋白。将肌原纤维粗蛋白称重，再加入4倍体积浓度为0.1mol/l的氯化钠溶液，高速匀浆30s，在相同条件下重复离心3次，留沉淀，即得虾蛄肌原纤维蛋白。
其中，所用蛋白提取液的组成为：0.1mol/l氯化钠、0.002mol/l氯化镁、0.001mol/l乙二胺四乙酸二钠和ph＝7的0.1mol/l磷酸氢二钠/磷酸二氢钠组成的混合溶液(上述浓度为在蛋白提取液中各组分的浓度)。
(2)添加三聚磷酸钠和金属阳离子：将氯化钾溶于4％(w/v)三聚磷酸钠溶液中使得氯化钾的浓度为0.03mol/l，再加入步骤(1)提取的虾蛄肌原纤维蛋白，蛋白浓度为40mg/ml，22000rpm高速匀浆20s，用磁力搅拌器在搅拌速度为1200rpm下，搅拌反应2h，得到金属离子协同磷酸化肌原纤维蛋白溶液。
(3)肌原纤维蛋白凝胶制备：取20ml步骤(2)制备的蛋白浓度为40mg/ml金属离子协同磷酸化肌原纤维蛋白溶液于50ml烧杯中，置于水浴锅中加热，以1℃/min的升温速率从20℃升至75℃，在75℃保温20min-30min，然后将样品迅速冷却至室温后得到蛋白凝胶，转移至4℃冰箱过夜，备用。
采用上述测试方法对所得蛋白乳化活性、凝胶硬度、弹性、保水性和白度等功能特性进行检测，结果如下：
氯化钾协同磷酸化改性后的蛋白乳化活性为26.79m2/g,与文献中单一磷酸化蛋白的乳化活性相比提高了1.81倍；凝胶硬度为47.22g，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶硬度相比提高了15.17％；凝胶弹性为0.988，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶弹性相比提高了19.04％；凝胶保水性为90.89％，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶保水性相比提高了5.68％；凝胶白度为49.76，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶白度相比提高了21.36％。
实施例2
(1)肌原纤维蛋白提取：将-80℃冻藏的虾蛄在4℃条件下解冻24h。将虾蛄去头、尾，剔除虾线、外壳，取肉，经揉捏后称重，加入4倍体积的蛋白提取液，22000rpm高速匀浆30s，在4℃、5000r/min离心15min后，留沉淀，重复上述操作2次，即得粗蛋白。将粗蛋白称重，再加入4倍体积浓度为0.1mol/l的氯化钠溶液，高速匀浆30s，在相同条件下重复离心3次，留沉淀，即得肌原纤维蛋白。
其中，蛋白提取液的组成为：0.1mol/l氯化钠、0.002mol/l氯化镁、0.001mol/l乙二胺四乙酸二钠和ph＝7的0.1mol/l磷酸氢二钠/磷酸二氢钠组成的混合溶液(上述浓度为在蛋白提取液中各组分的浓度)。
(2)添加三聚磷酸钠和金属阳离子：将氯化钠溶于4％(w/v)三聚磷酸钠溶液中使得氯化钠的浓度为0.02mol/l，再加入步骤(1)提取的肌原纤维蛋白，蛋白浓度为40mg/ml，22000rpm高速匀浆20s，用磁力搅拌器在搅拌速度为1200rpm下，搅拌反应2h，得到金属离子协同磷酸化肌原纤维蛋白溶液。
(3)肌原纤维蛋白凝胶制备：取20ml步骤(2)制备的蛋白浓度为40mg/ml的金属离子协同磷酸化肌原纤维蛋白溶液于50ml烧杯中，置于水浴锅中加热，以1℃/min的升温速率从20℃升至75℃，在75℃保温20min-30min，然后将样品迅速冷却至室温后转移至4℃冰箱过夜，备用。
采用上述测试方法对所得蛋白的乳化活性、凝胶硬度、弹性、保水性和白度等功能特性进行检测，结果如下：
氯化钠协同磷酸化改性后的蛋白乳化活性为47.55m2/g,与文献中单一磷酸化蛋白的乳化活性相比提高了3.21倍；凝胶硬度为82.03g，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶硬度相比提高了2倍；凝胶弹性为0.987，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶弹性相比提高了18.92％；凝胶保水性为95.04％，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶保水性相比提高了10.51％；凝胶白度为53.99，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶白度相比提高了31.68％。
实施例3
(1)肌原纤维蛋白提取：将-80℃冻藏的虾蛄在4℃条件下解冻24h。将虾蛄去头、尾，剔除虾线、外壳，取肉，经揉捏后称重，加入4倍体积的蛋白提取液，22000rpm高速匀浆30s，之后在4℃、5000r/min离心15min后，留沉淀，重复上述操作2次，即得粗蛋白。将粗蛋白称重，再加入4倍体积浓度为0.1mol/l的氯化钠溶液，高速匀浆30s，在相同条件下重复离心3次，留沉淀，即得肌原纤维蛋白。
其中，蛋白提取液的组成为：0.1mol/l氯化钠、0.002mol/l氯化镁、0.001mol/l乙二胺四乙酸二钠和ph＝7的0.1mol/l磷酸氢二钠/磷酸二氢钠组成的混合溶液(上述浓度为在蛋白提取液中各组分的浓度)。
(2)添加三聚磷酸钠和金属阳离子：将氯化镁溶于4％(w/v)三聚磷酸钠溶液中使得氯化镁的浓度为0.03mol/l，再加入步骤(1)提取的肌原纤维蛋白，蛋白浓度为40mg/ml，22000rpm高速匀浆20s，用磁力搅拌器在搅拌速度为1200rpm下，搅拌反应2h，得到金属离子协同磷酸化肌原纤维蛋白溶液。
(3)肌原纤维蛋白凝胶制备：取20ml步骤(2)制备的蛋白浓度为40mg/ml上述反应后的金属离子协同磷酸化肌原纤维蛋白溶液于50ml烧杯中，置于水浴锅中加热，以1℃/min的升温速率从20℃升至75℃，在75℃保温20min-30min，然后将样品迅速冷却至室温后转移至4℃冰箱过夜，备用。
采用上述测试方法对所得蛋白乳化活性、凝胶硬度、弹性、保水性和白度等功能特性进行检测，结果如下：
氯化镁协同磷酸化改性后的蛋白乳化活性为34.47m2/g,与文献中单一磷酸化蛋白的乳化活性相比提高了2.33倍；凝胶硬度为72.24g，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶硬度相比提高了1.76倍；凝胶弹性为0.59，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶弹性相比提高了17.11％；凝胶保水性为88.67％，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶保水性相比提高了3.11％；凝胶白度为54.79，与文献中单一磷酸化蛋白的凝胶白度相比提高了33.63％。
本发明采用金属阳离子协同磷酸化的方法改善肌原纤维蛋白功能特性，乳化活性、凝胶硬度、弹性、保水性和白度均得到提高，其中乳化活性得到显著提高，同时氯化钠或氯化镁协同磷酸化改性肌原纤维蛋白的凝胶硬度也得到显著提高。由此得出，金属阳离子协同磷酸化的方法既可以提高蛋白质的功能特性，又有效的节约成本，为虾蛄制品的深加工提供理论依据和技术支持，促进了虾蛄肉制品产业化生产。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。