一种具有内源增香的酸奶发酵剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种具有内源增香的酸奶发酵剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

酸奶是以牛奶为原料，经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌(发酵剂)，经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。

酸奶发酵剂的品质直接影响产品的质量，目前的酸奶发酵剂中的乳酸菌由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成。其应用于酸奶发酵后，其产生的

酸奶中的香味物质主要有乙醛、丁二酮等，丁二酮，又称双乙酰，黄色由状液体，具有很强的奶油香味。丁二酮用途广泛，主要用作奶油、人造奶油、干酪增香剂等。在发酵乳制品的风味中，丁二酮被认为是起作用的重要化合物之一，当丁二酮浓度达到1mg/l时，人们就能感受到发酵乳的特有香味。上述的目前酸奶发酵剂应用于酸奶发酵后，其产生的丁二酮浓度一般约为15mg/l左右，即内源产丁二酮能力不足。因此，目前酸奶中的丁二酮主要是通过外源添加的，但化学合成工艺复杂且品质不稳定。除了外源添加，内源产生也是一种丁二酮的产生方式。内源产生是通过发酵剂在发酵乳发酵过程中直接产生，省去分离纯化的步骤，同时更加的天然安全。

技术实现要素：

本发明的目的之一是为了解决上述目前酸奶发酵剂应用于酸奶发酵后，其产生的丁二酮能力不足，需要通过外源添加丁二酮等技术问题而提供一种具有内源增香的酸奶发酵剂，该具有内源增香的酸奶发酵剂由于含有德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010，具有内源高产丁二酮的能力，其用于酸奶发酵时，所得到的酸奶不用外加丁二酮，即具有内源增香的能力，最终丁二酮的产量最高达到23.47±0.20mg/l左右。

本发明的目的之二是提供上述的一种具有内源增香的酸奶发酵剂的制备方法，

本发明的目的之三是提供上述的具有内源增香的酸奶发酵剂在生产凝固型酸奶中的应用。

本发明的技术方案

一种具有内源增香的酸奶发酵剂，含有德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的总活菌数至少为1×10⁹cfu/ml(cfu，colony-formingunits单位体积混合菌体培养液中菌群落总数)，其中德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的量，按德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的质量比为1：1-3，优选为1：3的比例计算；

所述德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008，分类上属于乳酸杆菌，乳杆菌属，德氏乳杆菌l种，保加利亚乳杆菌l亚种，该菌株从乳扇中分离得到，于2017年6月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctccno：m2017363；保藏机构地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。

所述嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010，分类上属于乳链球菌，链球菌streptococcus属，嗜热链球菌s.thermophilus种，该菌株从乳饼中分离得到，于2017年6月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctccno：m2017365。保藏机构地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。

所述的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008的微生物学特征：

菌落特征：菌株在mrs平板上划线分离，37℃厌氧培养48h，菌株生长良好。

菌落圆形，乳白色，边缘整齐。

菌体特征：菌体呈杆状(图3)，菌体大小一般为0.6μm×1.5μm，不产芽孢，革兰氏染色阳性。

培养特征：该菌株耐酸，喜温，最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃，

在30-40℃生长温度最佳；最高和最低初始生长ph为9.0和4.0，最适生长初始ph为6.0。所述的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillus

delbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008，单菌落接种于mrs液体培养基，进行发酵所得的酸奶中经检测产丁二酮含量10.21mg/l；

所述的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的微生物学特征：

菌落特征：菌株在mrs平板上划线分离，37℃厌氧培养48h，菌株生长良好。菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色稍微有点偏黄，不透明，表面湿润光滑。

菌体特征：菌体呈球状，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列，无芽孢，革兰氏染色阳性。

培养特征：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃，在30-40℃生长温度最佳；该菌对胃酸有很好的耐受性，最高和最低初始生长ph为9.0和4.0，最适生长初始ph为6.8。所述的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010，单菌落接种于mrs液体培养基，进行发酵所得的酸奶中经检测产丁二酮含量12.87mg/l；

上述的从乳扇、乳饼中分离得到的保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010均来源于传统发酵食物，属于公认安全(generallyrecognizedassafe，gras)菌种，可用于乳酸菌食品中。

上述的一种具有内源增香的酸奶发酵剂，通过包括如下步骤的方法制备而成：

(1)、无菌脱脂乳溶液的制备

将脱脂乳粉和白砂糖加入到纯净水中，搅拌溶解，然后控制温度为118℃进行灭菌15min，然后自然冷却到37-40℃，得到无菌脱脂乳溶液；

上述无菌脱脂乳溶液中，脱脂乳粉、白砂糖和纯净水的用量，按脱脂乳粉：白砂糖：纯净水为12g:2-6g:100ml的比例计算；

(2)、分别用接种环取用无菌水溶解的甘油保藏管里保藏的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种在mrs琼脂培养基平板上划线，然后分别于37℃恒温培养箱中培养24-48h至分别长出单菌落；

(3)、用接种环分别挑取一环步骤(2)所得的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种的单菌落，然后分别接入装有多少100mlmrs肉汤液体培养基的250ml摇瓶中，置于37℃的培养箱中恒温培养10-15h，分别得到德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种的培养液；

(4)、将步骤(3)所得的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种的培养液，按照德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种的培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种的培养液的质量比为1:1-3的比例进行混合，得到混合菌体的培养液；

上述所得的混合菌体培养液中，含有德氏保加利亚乳杆菌(lactobacilusdelbrueckisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的总活菌数至少为1×10⁹cfu/ml(cfu，colony-formingunits单位体积混合菌体培养液中菌群落总数)；

然后将上述所得混合菌体的培养液控制转速为4000-6000g/min进行离心10-15min，离心所得的沉淀用无菌水控制转速为4000-6000g/min进行清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入与沉淀等体积的无菌水，然后在4000-6000rpm下涡旋震荡重悬菌体10min，得到具有内源增香的酸奶发酵剂。

上述的一种具有内源增香的酸奶发酵剂在发酵食品中的应用，特别是在制备凝固型酸奶中的应用。

上述的一种具有内源增香的酸奶发酵剂在制备凝固型酸奶中的应用，具体包括如下步骤：

(1)、将原料乳、稳定剂和甜味剂混合均匀，得混合料液；

所述原料乳为所得混合料液总质量的85～98％，优选为90％；所述的原料乳指本领域常规使用的原料乳，较佳的为新鲜乳或处理乳；所述的新鲜乳为全脂乳，所述的处理乳为脱脂乳和/或复原乳，所述的复原乳按本领域常规操作配制，由奶粉和水混合配制而成，较佳地奶粉：水的质量比为12：88的比例混合配制而成；

所述的稳定剂为所得混合料液总质量的1～5％，优选为2％；所述的稳定剂指本领域常规的稳定剂，优选为果胶、琼脂粉、塔拉胶、变性淀粉或者变性淀粉中的一种或两种以上的混合，更优选为果胶、变性淀粉或果胶和变性淀粉的混合物；

所述的甜味剂为所得混合料液总质量的1～10％，优选为8％，并且，所述甜味剂符合国标gb-2760-2011中的规定；所述的甜味剂为本领域常规的甜味剂，优选为白砂糖、木糖醇、果糖、果葡糖浆中的一种或两种以上的混合物，更优选为白砂糖、果葡糖浆或白砂糖和果葡糖浆的混合物；

(2)、杀菌

将步骤(1)所得的混合料液控制温度为95℃进行热处理10min，然后自然冷却至37℃，得到杀菌后的混合料液；

(3)、发酵

在步骤(2)所得的杀菌后的混合料液中，按体积百分比计算，加入1-5％的上述具有内源增香的酸奶发酵剂后充分搅拌均匀，然后控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳发酵结束，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳；

(4)、后熟

将步骤(3)所得的发酵乳控制温度为4℃进行后熟12-24h即得凝固型酸奶。

本发明的有益技术效果

本发明的一种具有内源增香的酸奶发酵剂，由于含有德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010两种菌株，由这两种菌种混合发酵出的酸奶产香效果好，无需添加其他菌株就可以达到对香气的需求。而且其主要香味物质丁二酮由菌体发酵过程中内源产生，省去分离纯化的过程，也不需要外源添加丁二酮达到香气需求，更加的天然健康，满足消费者对于食品绿色健康的要求，同时还可以简化工艺流程。

进一步，本发明的一种具有内源增香的酸奶发酵剂，其用于凝固型酸奶制备时，可以保证得到的凝固型酸奶中能内源产生更多的香味物质，即不需要外源添加香味物质，因此大大的降低了凝固型酸奶的生产成本。

附图说明

图1、紫外分光光度法测定丁二酮标准曲线；

图2、德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008革兰氏染色菌体的显微镜图；

图3、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010革兰氏染色菌体的显微镜图；

图4、感官评价实施例4和对照实施例1步骤(3)所得的凝固型酸奶的雷达图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明各实施例中所用的各种原料的规格及生产厂家的信息除下述特别说明之外，均为市售：

本发明的各实施例中所得发酵乳中的丁二酮含量的测定采用紫外-分光光度法,步骤如下：

取待测发酵乳样10ml，加入10ml16％tca溶液，混匀，3500g/min离心10min，取上清液20ml，加入到2支(1号和2号)试管中(10ml/管)，向1号管中加入0.5ml1％的邻苯二胺溶液，2号管不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4.0mol/lhcl溶液(1号管2.0ml，2号管2.5ml)终止反应，摇匀后以不加领苯二胺的2号管的溶液作为参比液，紫外-可见光分光光度计在335nm波长下用石英比色皿测定od值，每个待测发酵乳样至少做2个平行样取平均值；

然后，将上述测定的od值对照丁二酮标准曲线方程计算或查出待测发酵乳样品的丁二酮含量；

上述的丁二酮标准曲线方程采用紫外分光光度法(李妍,邢慧敏,邵亚东,等.发酵乳中丁二酮和乙醛含量检测方法探讨[j].食品与发酵工业,2008,34(3):157-159.)获得，拟合得到的丁二酮标准曲线方程，结果见图1所示。

实施例1

7-1菌株和cn-7菌株的分离筛选，步骤如下：

(1)、在无菌环境下取1g乳样(所述的乳样为从各地采取的发酵乳制品，例如：大理乳扇、大理乳饼，哈密地区的乳饼、酸奶，酸马奶，采样后带回实验室，放置冰箱密封保存，并尽快处理)至无菌试管中，向试管中加入生理盐水9ml，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10^-1的菌液；

(2)、取步骤(1)所得的稀释度为10^-1的菌液1ml于另一无菌试管中，向试管中加入生理盐水9ml，充分振荡溶解均匀得到稀释梯度为10^-2的菌液；

重复上述步骤4次，依次得到稀释度为10^-3菌液、10^-4菌液、10^-5菌液和10^-6菌液；

(3)、分别从步骤(2)所得的五支试管中取0.2ml菌液涂布于mrs琼脂培养基平板，放置在37℃恒温下培养2至3天；

(4)、用接种针挑取步骤(3)平板培养后所得的235株分离株单菌落，分别接种于mrs液体培养基，控制温度为37℃恒温发酵12h，分别得到235株分离株的发酵液；

(5)、将步骤(4)所对应的235株分离株发酵液分别在4℃下，6000g/min离心15min，离心所得的沉淀分别用无菌水清洗2-3次，然后分别在清洗后的沉淀中加入与沉淀等体积的无菌水分别在6000rpm下涡旋震荡重悬菌体10min，备用；

(6)、将脱脂乳粉、蔗糖和纯净水，按脱脂乳粉：蔗糖：纯净水为120mg：60mg：1l的比例进行混合溶解，然后控制温度为118℃灭菌15min，然后再冷却到37℃，即得到无菌脱脂乳溶液；

(7)、取235份步骤(6)所得的无菌脱脂乳溶液，分别按体积5％的比例计算接入步骤(5)所得的235种震荡重悬菌体，控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳发酵结束，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳。

对上述所得的对应235种震荡重悬菌体的酸奶分别测定丁二酮的含量，最终选取产丁二酮量高的两株菌：菌株cn-7丁二酮产量为12.87±0.23mg/l，即丁二酮产量最高，选取cn-7这株菌，命名为sitccno.10010；

菌株7-1丁二酮产量为10.2±0.5mg/l，即丁二酮产量位于第二，仅次于菌株cn-7，选取7-1这株菌，命名为sitccno.10008。

实施例2

将实施例1所得的菌株sitccno.10008进行微生物学鉴定；

(1)、菌落特征：菌株在mrs平板上划线分离，37℃厌氧培养48h，菌株生长良好。菌落圆形，乳白色，边缘整齐。

(2)、菌体特征：采用革兰氏染色法(周德庆.微生物学教程[j].2011.)对步骤(1)中所得的sitccno.10008进行革兰氏染色观察，结果见图1所示，从图3中可以看出，菌体呈杆状，菌体大小一般为0.6μm×1.5μm，不产芽孢，革兰氏染色阳性；

(3)、培养学特征：

该菌株耐酸，喜温，最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃，在30-40℃生长温度最佳；最高和最低初始生长ph为9.0和4.0，最适生长初始ph为6.0；

(4)、遗传学特性：

对sitccno.10008菌株的16srdna序列鉴定，提取细菌基因组dna，以基因组dna为模板，进行pcr扩增，测序工作，所得的7-1菌株的16srdna基因序列为1480bp，见seqidno：1。

根据sitccno.10008菌株的16srdna基因序列与genbank中的相关序列进行比对，比对结果显示与sitccno.10008菌株同源性最高的菌株是lactobacilusdelbrueckisubsp.bulgaricusstrainnwafu1433(sequenceid：mg551096.1)，同源性为98％，根据goodfellow和o′donnell所说的dna的g+c(mol％)≤10％～12％及16srrna的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且embley和stackebrangdt认为当16srrna的序列同源性≥97％时可以认为是一个种，即所得的sitccno.10008菌株为德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)。

综上所述，依据上述的菌落、菌体形态、培养学、生理生化鉴定等微生物学特性及其遗传特性16srdna对上述从乳饼中分离得到的sitccno.10008进行鉴定，其为德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)，该菌株于2017年6月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为；cctccno：m2017363:；保藏机构地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。

将实施例1所得的sitccno.10010菌株进行微生物学鉴定

(1)、菌落特征：菌株在mrs平板上划线分离，37℃厌氧培养48h，菌株生长良好。菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色稍微有点偏黄，不透明，表面湿润光滑。

(2)、菌体特征：采用革兰氏染色法(周德庆.微生物学教程[j].2011.)对步骤(1)中所得的sitccno.10010菌株进行革兰氏染色观察，结果见图4所示，从图4中可以看出，菌体呈球状，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列，革兰氏染色阳性，无芽孢；

(3)、培养学特征：

最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在30-45℃生长温度最佳；该菌对胃酸有很好的耐受性，最高和最低初始生长ph为9.0和4.0，

最适生长初始ph为6.8。

(4)、遗传学特性：

对sitccno.10010菌株的16srdna序列鉴定，提取细菌基因组dna，以基因组dna为模板，进行pcr扩增，测序工作，所得的sitccno.100010菌株的16srdna基因序列为1482bp，见seqidno：2：根据sitccno.10010菌株的16srdna基因序列与genbank中的相关序列进行比对，比对结果显示与sitccno.10010菌株同源性最高的菌株是streptococcusthermophilusstrainfma808(sequenceid：hq721249.1)，同源性为100％，根据goodfellow和o′donnell所说的dna的g+c(mol％)≤10％～12％及16srrna的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且embley和stackebrangdt认为当16srrna的序列同源性≥97％时可以认为是一个种，即所得的sitccno.10010菌株为嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)。

综上所述，依据上述的菌落、菌体形态、培养学、生理生化鉴定等微生物学特性及其遗传特性16srdna对上述从乳饼中分离得到的sitccno.10010菌株进行鉴定，其为嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)，该菌株于2017年6月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctccno：m2017365。保藏机构地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。

实施例3

一种具有内源增香的酸奶发酵剂，含有德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的总活菌数至少为1×10⁹cfu/ml，其中德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的量，按德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的质量比分别为1:1、1：2、1：3的比例计算；

其通过包括如下步骤的方法制备而成：

(1)、无菌脱脂乳溶液的制备

将脱脂乳粉和白砂糖加入到纯净水中，搅拌溶解，然后控制温度为118℃进行灭菌15min，然后自然冷却到37-40℃，得到无菌脱脂乳溶液；

上述无菌脱脂乳溶液中，脱脂乳粉、白砂糖和纯净水的用量，按脱脂乳粉：白砂糖：纯净水为12g:6g:100ml的比例计算；

(2)、分别用接种环取用无菌水溶解的甘油保藏管里保藏的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种在mrs琼脂培养基平板上划线，然后分别于37℃恒温培养箱中培养24h至长出单菌落；

(3)、用接种环分别挑取一环步骤(2)所得的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种分别接入装有mrs肉汤液体培养基的摇瓶中，置于37℃的培养箱中恒温培养24h，分别得到德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种的培养液；

(4)、按照德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种的培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种的培养液的质量比为1:1、1：2、1：3的比例，将步骤(3)所得的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种的培养液分别进行混合，分别得到对应德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比为1:1、1：2、1：3的混合菌体的培养液；

上述所得的对应德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比分别为1:1、1：2、1：3的混合菌体的培养液中，含有德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010的总活菌数分别为1.1×10⁹cfu/ml、1.21×10⁹cfu/ml、1.16×10⁹cfu/ml，即可以保证3种混合菌体的培养液中总活菌数至少为1×10⁹cfu/ml；

然后将上述所得3种混合菌体的培养液分别控制转速均为6000g/min进行离心10min，离心所得的沉淀分别用无菌水清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入与沉淀等体积的无菌水在6000rpm下涡旋震荡重悬菌体10min，得到对应德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种的培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种的培养液的质量比分别为1:1、1：2、1：3的具有内源增香的酸奶发酵剂。

实施例4

实施例3所得的具有内源增香的酸奶发酵剂在凝固型酸奶中的应用，具体包括如下步骤：

(1)、将原料乳、稳定剂和甜味剂混合均匀，得混合料液；

所述原料乳为所得混合料液总质量的90％；所述的原料乳为处理乳；所述的处理乳为脱脂乳；

所述的稳定剂为所得混合料液总质量的2％；所述的稳定剂为果胶；

所述的甜味剂为所得混合料液总质量的8％，所述的甜味剂为果糖；

(2)、杀菌

将步骤(1)所得的混合料液控制温度为95℃进行热处理10min，然后自然冷却至37℃，得到杀菌后的混合料液；

(3)、发酵

在步骤(2)所得的杀菌后的混合料液中，按体积百分比计算，加入具有内源增香的酸奶发酵剂充分搅拌均匀，然后控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳，发酵结束，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳；

上述的具有内源增香的酸奶发酵剂中，对应的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比为1:3；

(4)、后熟

将步骤(3)所得的发酵乳控制温度为4℃进行后熟12h即得凝固型酸奶。

实施例5

实施例3所得的具有内源增香的酸奶发酵剂在凝固型酸奶中的应用，具体包括如下步骤：

(1)、将原料乳、稳定剂和甜味剂混合均匀，得混合料液；

所述原料乳为所得混合料液总质量的94％；所述的原料乳为新鲜乳；所述的新鲜乳为全脂乳；

所述的稳定剂为所得混合料液总质量的1％；所述的稳定剂为果胶；

所述的甜味剂为所得混合料液总质量的5％，所述甜味剂为白砂糖；

(2)、杀菌

将步骤(1)所得的混合料液控制温度为95℃进行热处理10min，然后自然冷却至37℃，得到杀菌后的混合料液；

(3)、发酵

在步骤(2)所得的杀菌后的混合料液中，按体积百分比计算，加入具有内源增香的酸奶发酵剂充分搅拌均匀，然后控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳，发酵结束，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳；

上述的具有内源增香的酸奶发酵剂中，对应的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比为1:1；

(4)、后熟

将步骤(3)所得的发酵乳控制温度为4℃进行后熟18h即得凝固型酸奶。

实施例6

实施例3所得的具有内源增香的酸奶发酵剂在凝固型酸奶中的应用，具体包括如下步骤：

(1)、将原料乳、稳定剂和甜味剂混合均匀，得混合料液；

所述原料乳为所得混合料液总质量的94％；所述的原料乳为处理乳；所述的处理乳为脱脂乳；

所述的稳定剂为所得混合料液总质量的5％；所述的稳定剂为变性淀粉；

所述的甜味剂为所得混合料液总质量的1％，所述甜味剂为白砂糖；

(2)、杀菌

将步骤(1)所得的混合料液控制温度为95℃进行热处理10min，然后自然冷却至37℃，得到杀菌后的混合料液；

(3)、发酵

在步骤(2)所得的杀菌后的混合料液中，按体积百分比计算，加入具有内源增香的酸奶发酵剂充分搅拌均匀，然后控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳，发酵结束，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳；

上述的具有内源增香的酸奶发酵剂中，对应的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比为1:2；

(4)、后熟

将步骤(3)所得的发酵乳控制温度为4℃进行后熟24h即得凝固型酸奶。

对照实施例1

一种商业菌粉yf-l811在凝固型酸奶制备中的应用，具体包括如下步骤：

(1)、将原料乳、稳定剂和甜味剂混合均匀，得混合料液；

所述原料乳为所得混合料液总质量的87％；所述的原料乳为新鲜乳；

所述的稳定剂为所得混合料液总质量的5％；所述的稳定剂为果胶；

所述的甜味剂为所得混合料液总质量的8％，所述甜味剂为果糖；

(2)、杀菌

将步骤(1)所得的混合料液控制温度为95℃进行热处理10min，然后自然冷却至37℃，得到杀菌后的混合料液；

(3)、发酵

在步骤(2)所得的杀菌后的混合料液中，按体积百分比计算，加入商业菌粉yf-l811充分搅拌均匀，然后控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳发酵结束，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳；

(4)、后熟

将步骤(3)所得的发酵乳控制温度为4℃进行后熟12h即得凝固型酸奶。

对照实施例2

一种商业菌粉lcasei-01在凝固型酸奶制备中的应用，具体包括如下步骤：

(1)、将原料乳、稳定剂和甜味剂混合均匀，得混合料液；

所述原料乳为所得混合料液总质量的88％；所述的原料乳为处理乳；所述的处理乳为脱脂乳；

所述的稳定剂为所得混合料液总质量的5％；所述的稳定剂为变性淀粉；

所述的甜味剂为所得混合料液总质量的7％，所述甜味剂为果糖；

(2)、杀菌

将步骤(1)所得的混合料液控制温度为95℃进行热处理10min，然后自然冷却至37℃，得到杀菌后的混合料液；

(3)、发酵

在步骤(2)所得的杀菌后的混合料液中，按体积百分比计算，加入商业菌粉lcasei-01充分搅拌均匀，然后控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳发酵结束，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳；

(4)、后熟

将步骤(3)所得的发酵乳控制温度为4℃进行后熟18h即得凝固型酸奶。

对照实施例3

一种商业菌粉yc-380在凝固型酸奶制备中的应用，具体包括如下步骤：

(1)、将原料乳、稳定剂和甜味剂混合均匀，得混合料液；

所述原料乳为所得混合料液总质量的91％；所述的原料乳为新鲜乳；

所述的稳定剂为所得混合料液总质量的3％；所述的稳定剂为果胶和琼脂粉按质量比为1：2组成的混合物；

所述的甜味剂为所得混合料液总质量的6％，所述甜味剂为白砂糖；

(2)、杀菌

将步骤(1)所得的混合料液控制温度为95℃进行热处理10min，然后自然冷却至37℃，得到杀菌后的混合料液；

(3)、发酵

在步骤(2)所得的杀菌后的混合料液中，按体积百分比计算，加入商业菌粉yc-380充分搅拌均匀，然后控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳发酵结束，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳；

(4)、后熟

将步骤(3)所得的发酵乳控制温度为4℃进行后熟24h即得凝固型酸奶。

测定上述实施例4、5、6和对照实施例1、2、3中的步骤(3)中的凝乳时间，凝固型酸奶的ph、凝固型酸奶的滴定酸度(°t)(凝固型酸奶的滴定酸度按gb5009.239-2016食品安全国家标准食品酸度的测定中的测定方法)、酸奶中的丁二酮含量，结果见下表：

上表中复配比例是指所用的具有内源增香的酸奶发酵剂中，对应的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比，如复配比例1：3，是指所用的具有内源增香的酸奶发酵剂中，对应的德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比为1：3；

由上表可以看出，含有德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比为1:3的具有内源增香的酸奶发酵剂制备的凝固型酸奶，产丁二酮量最高可达到23.47±0.20mg/l，同时可以在8h内凝乳完成,且凝乳效果较好，能够在相同的时间内快速降低ph值和滴定酸度，和商业菌粉效果相当，甚至有些水平优于商业菌粉。这样可以证明所述具有内源增香的酸奶发酵剂可以很好的保证凝固型酸奶的各方面的品质，尤其是含有德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008菌种培养液：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010菌种培养液的质量比为1:3的具有内源增香的酸奶发酵剂的产丁二酮效果最佳，具有很好的内源产香能力，无需外源添加，就可以达到消费者对于酸奶香气的需求。

参照gb19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》中对酸奶感官特性的描述，确定7个感官因子对酸奶感官特性进行描述，具体的酸奶香气的评价指标以及特性描述如下表所示；

感官鉴评采用评分制，0-1不存在，2-3轻微的，4-5明确的，6-7显著地，8-9十分显著。

按照上述的评价标准对实施例4和对照实施例1步骤(3)所得的凝固型酸奶进行感官评价，结果如下雷达图如图4所示，从图4中可以看出所述发酵剂发酵所得酸奶的整体接受度较商业菌粉发酵的酸奶高，而且尤其是奶香味、奶油味，而且没有产生异味物质，由此表明了所述发酵剂的产香性能很好，尤其是赋予酸奶奶油味的能力较商业菌粉高。

综上所述，本发明的一种具有内源增香的酸奶发酵剂，由于含有由德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008和嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010，其用于凝固型酸奶制备时，可以保证得到的凝固型酸奶中能内源产生更多的香味物质，即不需要外源添加香味物质，因此大大的降低了凝固型酸奶的生产成本。

以上所述仅为本发明的实施例的举例，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。

<110>上海应用技术大学

<120>一种具有内源增香的酸奶发酵剂及其制备方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1480

<212>dna

<213>德氏保加利亚乳杆菌(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)sitccno.10008

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<213>嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)sitccno.10010

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