用于调节肌肤代谢的铁皮石斛萃取物及其制备方法与流程

本发明涉及植物提取物领域，特别涉及一种用于调节肌肤代谢的铁皮石斛萃取物及其制备方法。

背景技术：

植物组织培养技术起始于近一百年内，其方法为将植物培植体利用不同生长素(auxin)与细胞分裂素(cytokinin)的比例调配刺激，达到培养出不定根、不定芽或愈伤组织的效果。植物干细胞是植物原始尚未分化的状态，来自于茎与根的顶端分生组织(apicalmeristem)或是体细胞(somaticcell)，一般称之为愈伤组织(callus)。

愈伤组织具有表观基因作用(epigentic)与全能分化能力(totipotent)能够分化成植物胚胎细胞进而形成新的植株。并有帮助细胞代谢新生、推迟老化与赋予活力等功效。近代利用植物组织培养方法，已经成功发展出一套属于植物分生组织增殖的技术，然而对于不同品种的植株尚须经由系统性的实验找出适合的培养配方，方能产出有利用价值的植物分生组织，提供产业利用。

铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)属石斛兰属多年生草本植物，别名为黑节草，为中国珍贵中药材，原产中国安徽大别山、浙东天台山、福建宁化、广西天峨、云南文山以及四川等地，多分布于海拔近千米的山地半阴湿岩石上，一般均能耐-5℃的低温。由于铁皮石斛自身的生长和繁殖特性，对生态环境条件的特殊要求以及巨大的市场需求引发的人为过度采挖等原因，野生铁皮石斛已经濒临灭绝。因此，利用特殊的组织培养方法进行铁皮石斛组织培养大量繁殖，可以有效减轻野生资源采集的压力，且不受限于气候及季节差异的影响。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明利用特殊的组织培养技术诱导及增殖铁皮石斛分生组织，在维持细胞不分化的情况下利用特定培养配方与操作手法将分生组织产量达到最大产量，以供产业利用。本发明利用此培养方法所繁殖出的分生组织，经由细胞试验结果，可以有效达到活化粒线体、促进胶原蛋白及玻尿酸生成等功效，以提升铁皮石斛的应用价值，并为产业界提供铁皮石斛珍贵原料的制备方法。

本发明提供一种该铁皮石斛萃取物用于制备调节肌肤代谢的医药组合物的用途。

本发明再提供一种诱导及增殖铁皮石斛分生组织的方法，包含：使用添加1-萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid，naa)以及6-苯胺嘌呤(6-benzyladenine，ba)的1/3ms培养基的步骤。

本发明另提供一种培养皮石斛分生组织的培养基，其中该培养基包含一1-萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid，naa)。

在本发明的一实施例中，其中该培养基进一步包含6-苯胺嘌呤(6-benzyladenine，ba)。

在本发明的一实施例中，其中该铁皮石斛萃取物是由添加1-萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid，naa)以及6-苯胺嘌呤(6-benzyladenine，ba)的1/3ms培养基诱导及增殖培养铁皮石斛分生组织后再经一萃取步骤获得，且该萃取步骤是以75％酒精萃取。

在本发明的一实施例中，其中该调节肌肤代谢是活化粒线体、促进胶原蛋白及玻尿酸生成。

在本发明的一实施例中，其中该调节肌肤代谢是促进促进ⅰ型胶原α1链(collagenalpha-1(i)，col1a1)、ⅰ型胶原α2链(collagenalpha-2(i)，col1a2)、ⅰv型胶原α4链(collagenalpha-4(iv)，col4a4)、基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorsofmetalloproteinase-1，timp-1)、离胺基氧化酶(lysyloxidase，lox)以及透明质酸合成酶(hyaluronansynthase，has)基因表现；且抑制基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，mmp-2)以及基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，mmp-9)基因表现。

在本发明的一实施例中，其中该医药组合物进一步包含一医药上可接受的载体。

因此，本发明提供一种利用铁皮石斛愈伤组织再生的特性，促使皮肤细胞粒线体活性增加；此外，本发明的铁皮石斛萃取物，可经由促进col1a1、col1a2、col4a4、timp-1、lox以及has基因表现；以及抑制mmp-2以及mmp-9基因表现，进而促进胶原蛋白及玻尿酸生成，最终达到调节肌肤代谢的效果。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明的铁皮石斛萃取物的活化粒线体效果的数据图；相较于对照组***p<0.001；

图2是本发明的铁皮石斛萃取物于促进ⅰ型胶原α1链(collagenalpha-1(i)，col1a1)基因、ⅰ型胶原α2链(collagenalpha-2(i)，col1a2)基因以及ⅰv型胶原α4链(collagenalpha-4(iv)，col4a4)基因表现量的数据图；

图3是本发明的铁皮石斛萃取物于促进基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorsofmetalloproteinase-1，timp-1)基因表现、抑制基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，mmp-2)以及基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，mmp-9)基因表现的数据图；

图4是本发明的铁皮石斛萃取物的促进离胺基氧化酶(lysyloxidase，lox)以及透明质酸合成酶(hyaluronansynthase，has)基因表现的数据图。

具体实施方式

本发明的具有调节肌肤代谢的铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)萃取物的萃取流程，是经由铁皮石斛培养增殖、铁皮石斛分生组织诱导、铁皮石斛分生组织纯化培养、铁皮石斛分生组织增殖、铁皮石斛分生组织干燥萃取等步骤所制备。其中，本发明的制备方法为一套稳定的铁皮石斛分生组织诱导、增殖方法，并利用细胞实验证实铁皮石斛分生组织萃取物的相关功效。

实施例1铁皮石斛萃取物的制备方法

本发明利用生长激素搭配组合以诱导、增殖培养铁皮石斛分生组织，发展出一套能够稳定生产铁皮石斛萃取物的制备流程。

首先，利用1/3ms(murashigeandskoog，1962)培养基，加入1mg/l的植物生长素1-萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid，naa)，以及7mg/l的细胞分裂素6-苯胺嘌呤(6-benzyladenine，ba)充分混和均匀，将3％蔗糖与0.8％琼脂充分混和至后1/3ms培养基后，利用0.1n氢氧化钠溶液定量至ph值5.7至5.8之间，灭菌后用于铁皮石斛分生组织的诱导培养。

接着，利用1/3ms(murashigeandskoog，1962)培养基，将3％蔗糖与0.8％琼脂充分混和至后1/3ms培养基后，利用0.1n氢氧化钠溶液定量至ph值5.7至5.8之间，灭菌后用于铁皮石斛分生组织的增殖培养。

以上两种培养基足以提供铁皮石斛分生组织诱导与增殖，其分生组织产量可达4倍之多，相较于铁皮石斛植株，本案的萃取物具有较强的细胞粒线体活性、促进胶原蛋白以及玻尿酸增生的功效。经由组织培养技术增殖的分生组织产物，先利用冷冻干燥机以-40℃进行干燥16小时，收成产物确保水分低于5％以下；接着，再利用75％食用酒精溶液于70℃条件下进行萃取30分钟，产生本发明的调节肌肤代谢的铁皮石斛萃取物。

实施例2本发明的铁皮石斛萃取物的皮肤细胞粒线体活性分析

本发明以人类皮肤纤维母细胞进行皮肤细胞粒线体活性分析。人类皮肤纤维母细胞购自台湾生物资源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter，bcrc)，编号bcrc60153。将该细胞培养于添加10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)(gibco公司，编号10438-026，美国)、1.5g/l碳酸氢钠(sigma公司，编号s5761，美国)、1mm丙酮酸钠(gibco公司，编号11360-070，美国)的最低必需培养液(minimumessentialmedium,mem)(gibco公司，编号41500-034，美国)。

在含有2ml上述培养基的6孔培养盘中每个孔洞接种1.5×10⁵个人类皮肤纤维母细胞，分别加4％、2％铁皮石斛萃取物或细胞培养基作为对照组培养于37℃下24小时，上述培养基(n＝3)。然后移除培养基并以1倍的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)(gibco公司，编号14200-075，美国)清洗两次；之后加入胰蛋白酶(trypsin)/edta处理3分钟后，吸取悬浮的细胞至1.5ml的离心管，以400g转速离心5分钟收集沈淀的细胞。

将该细胞以1倍的磷酸盐缓冲液清洗两次，再以100μljc-1染剂(bd公司，编号ruo-551302，美国)再悬浮该细胞，混合均匀后在避光下培养15分钟；之后以400g转速离心5分钟，再以清洗缓冲液清洗两次。以含有2％fbs的1倍的磷酸盐缓冲液再悬浮的细胞，利用流式细胞仪(bdaccuric6plus)分析观察细胞凋亡时粒线体膜电位改变，并以excel进行t-检验(studentt-test)统计分析样本群体之间差异的统计学意义。

本发明的铁皮石斛萃取物皮肤细胞粒线体活性分析的实验结果，如图1所示，经过铁皮石斛萃取物的处理，粒线体活性明显增加，2％铁皮石斛萃取物明显比对照组增加11.9％。因此，本案铁皮石斛萃取物比对照组的活化粒线体功效更加优异，显示本案铁皮石斛萃取物具有优异的活化粒线体的功效。

实施例3本发明的铁皮石斛萃取物于促进胶原蛋白以及玻尿酸生成的功效

由于已知促进ⅰ型胶原α1链(collagenalpha-1(i)，col1a1)基因以及ⅰ型胶原α2链(collagenalpha-2(i)，col1a2)基因表现，可以促进第一型胶原蛋白的生成；促进ⅰv型胶原α4链(collagenalpha-4(iv)，col4a4)基因表现，可以促进第四型胶原蛋白的生成；促进基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorsofmetalloproteinase-1，timp-1)基因表现，可以抑制基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，mmp-2)以及基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，mmp-9)等与分解胶原蛋白相关的酵素的基因表现；促进离胺基氧化酶(lysyloxidase，lox)基因表现，可以促进胶原蛋白的生成；促进透明质酸合成酶(hyaluronansynthase，has)基因表现，可以促进玻尿酸(hyaluronicacid)、醣醛酸、琉璃醣碳基酸生成的作用，故本发明进一步检测铁皮石斛萃取物对col1a1、col1a2、col4a4、timp-1、lox、mmp-2以及mmp-9基因表现量的影响。

如同前述实施例2所述的方法获得该沈淀的皮肤纤维母细胞，在6孔培养盘中每个孔洞接种1.5×10⁵个细胞，以添加2％铁皮石斛萃取物或不添加任何成分(作为控制组)的上述培养基培养于37℃下24小时；之后收集皮肤纤维母细胞。使用rna萃取试剂组(genemark公司，美国)萃取上述细胞的rna，再利用反转录酶(iiireversetranscriptase)(invitrogen公司，美国)将rna反转录为cdna，接着使用kapafastqpcr试剂组(kapabiosystems公司，美国)测量目标基因(col1a1、col1a2、col4a4、timp-1、mmp-2、mmp-9、lox以及has)的转录量，以定量pcr仪进行分析。

由于col1a1、col1a2、col4a4、timp-1、mmp-2、mmp-9、lox以及has基因与胶原蛋白或玻尿酸形成相关，结果如图2至图4所示，本发明的铁皮石斛萃取物可促进col1a1、col1a2、col4a4、timp-1、lox以及has基因表现，抑制mmp-2以及mmp-9基因表现。证实以促进胶原蛋白的生成；本发明的铁皮石斛萃取物可达到促进胶原蛋白及玻尿酸生成、减少胶原蛋白分解的功效，从而能够减少皱纹、防止皮肤老化、保护骨骼、预防骨质疏松、保护关节、改善退化性关节炎、促进伤口愈合、减少疤痕、减少肌肤皱纹，提升紧致与弹性，还能够提升皮肤保水性，减少皮肤干燥。

综上所述，本发明的铁皮石斛萃取物是经由添加1-萘乙酸(naa)以及6-苯胺嘌呤(ba)的1/3ms培养基诱导及增殖培养后再经一萃取步骤获得；再者，本发明的铁皮石斛萃取物可经由活化粒线体、促进胶原蛋白及玻尿酸生成，进而具有调节肌肤代谢的效果。因此，本发明铁皮石斛萃取物为一天然成分，不会产生传统人工合成成分所带来的副作用，可应用调节肌肤代谢的医药组合物，该组合物是以粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状存在，且其剂型是以食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂的形式提供。