本发明属于利用微生物发酵制备天然产物的技术领域，具体涉及多菌种联合发酵制备富含γ-氨基丁酸大豆食品的方法。本发明的发酵菌株涉及枯草芽孢杆菌和乳酸菌。
背景技术：
大豆制品是我国传统的特色食品，食用历史悠久。大豆也是亚洲国家最受欢迎的食物之一，被制造成各种各样的产品。大豆富含多种功效成分,如低聚糖、大豆多肽、异黄酮、膳食纤维和大豆磷脂等。这些功效成分具有降血压、降血脂、预防癌症，抗衰老和缓解糖尿病并发症等生理功能。豇豆粉含有易于消化吸收的蛋白质，还含有多种维生素和微量元素等，所含磷脂可促进胰岛素分泌，是糖尿病人的理想食品。因此，大豆和豇豆是糖尿病患者的理想食品原料。在豆类食品的多种生物活性化合物中γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid，简称gaba)，作为一种非蛋白源氨基酸，成为近年来食品营养领域研究的热点。γ-氨基丁酸具有良好的生物学功能，是豆类食品加工关注的焦点。γ-氨基丁酸广泛分布于动植物体内，作为中枢神经系统重要的抑制性神经递质，对生物生命活动的调节起着不可替代的作用,是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，具有降血压、改善糖尿病患者生理状况、改善脑机能、增强记忆、抗焦虑等生理功能。
gaba由l-谷氨酸经谷氨酸脱竣酶催化发生脱羧反应制得，主要有生物合成法和微生物发酵法，相比而言，利用微生物发酵法较为安全，成本较低。现有技术公开的菌株大多都是以大肠杆菌为发酵gaba的菌株，但其存在安全方面的隐患。目前，利用发酵方法制备γ-氨基丁酸的工艺已有一些进展：
申请号为cn201210302371.6的专利申请公开了一种微生物发酵合成γ-氨基丁酸的方法，将短乳杆菌l2菌株经mrs培养平盘活化后，转接到gyp种子培养基中用作发酵种子，再以1～5％体积比的接种量接种于培养基(小米糠10～100g/l、l-谷氨酸钠30～80g/l，培养基初始ph为3.00～5.00)中，20～45℃静止培养50～80h，即得到高含γ-氨基丁酸的乳酸菌发酵液，浓度可达到12～32g/l。专利文献是申请号为cn02113140.6a的专利，该专利以乳酸菌或乳酸菌和酵母菌混用作为菌种，以0.5％的接种量接入py培养基，添加0.5％～3％的碳源，0.5％～5％的氮源，于25℃～40℃静置培养14～16h，所得发酵液中γ-氨基丁酸含量可达300～500mg/100ml。发酵液经中和、脱臭后可直接干燥成粉剂，粉剂中γ-氨基丁酸含量在5％以上。但是该专利制备的γ-氨基丁酸产品中gaba含量较低，功能营养组分单一，生产成本高。
尽管有上述文献报道了一些利用微生物发酵制备γ-氨基丁酸方法，但目前尚未见到利用枯草芽孢杆菌atcc6051、乳酸菌atcc11842和乳酸菌nrrlb-441三种益生菌为发酵菌种发酵制备γ-氨基丁酸的方法的报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种多菌种联合发酵制备富含γ-氨基丁酸大豆食品的方法，以大豆为主要原料，以豇豆粉为辅助原料；以枯草芽孢杆菌atcc6051、乳酸菌atcc11842和乳酸菌nrrlb-441三种益生菌为发酵菌种，经过好氧和厌氧两阶段发酵制备富含γ-氨基丁酸大豆食品，该食品还富含多种益生菌，膳食纤维和水溶性膳食纤维含量高，具有改善糖尿病患者生理机能的功能，适宜糖尿病患者食用。
为解决上述技术问题，本发明采取如下技术方案：
第一方面，提供一种多菌种联合发酵制备富含γ-氨基丁酸大豆食品的方法，经浸泡、冷冻、热激预处理的大豆，与豇豆粉辅助原料混合蒸煮；先接种枯草芽孢杆菌atcc6051好氧发酵；再接种乳酸菌atcc11842和nrrlb-441厌氧发酵；最后冷冻干燥制得富含γ-氨基丁酸的大豆食品。
进一步地，上述多菌种联合发酵制备富含γ-氨基丁酸大豆食品的方法，具体包括以下步骤：
(1)大豆预处理，包括大豆浸泡，冷冻，热激三个步骤
a.浸泡:挑选豆粒饱满无虫害的大豆，浸泡条件：浸泡液完全淹没大豆，30℃-35℃浸泡8h-12h；浸泡液配方为谷氨酸钠10g/l-20g/l，氯化钙5mm-10mm，氯化锌0.1-0.15g/l，硫酸镁0.1-0.2g/l；
b.冷冻：倒掉浸泡液，在-20℃至-30℃温度条件下冷冻24h-32h；
c.热激：在40℃-45℃温度条件下热激24h-30h；
(2)发酵辅料配置：用饮用水配置包含豇豆粉50g/l-100g/l，纽甜0.01g/l-0.1g/l，谷氨酸钠10g/l-20g/l，氯化钙5mm-10mm，氯化锌0.1-0.15g/l；
(3)发酵原料蒸煮：预处理后的大豆和发酵辅料混合构成发酵原料，发酵辅料与预处理后大豆质量比例为1/3-1/2，在115℃-121℃条件下蒸煮10min-15min；
(4)发酵
a.菌种扩大培养：枯草芽孢杆菌atcc6051的培养条件是以lb基础培养基中添加2g/l-3g/l的谷氨酸钠，15mm-20mm的氯化钙，0.1-0.15g/l的氯化锌，0.1-0.2g/l的硫酸镁为培养基，初始ph为7.0-8.0，在30℃-35℃温度条件下振荡培养15-20h；乳酸菌atcc11842和nrrlb-441的培养条件是以mrs基础培养基中添加1g/l-2g/l的谷氨酸钠，10mm-15mm的氯化钙，0.05-0.1g/l的氯化锌，初始ph为6.0-7.0，35℃-40℃厌氧静置培养20-25h；
b.好氧发酵:枯草芽孢杆菌atcc6051以1％-2％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在30℃-35℃恒温培养箱中通风培养18h-24h；
c.厌氧发酵：乳酸菌atcc11842和nrrlb-441都以3％-5％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在35℃-40℃恒温厌氧培养箱中培养36h-48h；
(5)冷冻干燥：按照常规公知的冷冻干燥方法(在-25℃预冻6h，真空度为30pa，最终冻干温度为65℃)，得到富含γ-氨基丁酸的大豆食品。
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明方法原料便宜，操作简单，产品中γ-氨基丁酸含量高达29.5-35.6mg/g，总益生菌含量高达3×108-8×108cfu/g，总膳食纤维含量高达28％-34％，其中水溶性膳食纤维比例高达15％-20％。该食品特别适宜糖尿病患者食用。本发明具有工业化生产的价值，具有良好的社会价值和市场前景。
具体实施方式
通过以下详细说明可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明具体实施例中的检测方法如下：
1、γ-氨基丁酸含量检测方法：通过γ-氨基丁酸标准品做γ-氨基丁酸含量与光密度值的标准曲线，获得线性方程。取1g大豆食品冻干粉用10ml蒸馏水溶解，以6000rpm离心10min，取0.3ml上清液于25ml离心管中；依次加入0.2ml的0.2m硼酸盐缓冲液(ph9.0)，1ml的6％苯酚溶液，0.8ml的5％次氯酸钠溶液，充分振荡混匀；置于沸水浴中保持10min；然后迅速置于冰浴中保持15min；剧烈振荡至蓝色；最后加入2ml的60％的乙醇溶液；在645nm波长条件下检测光密度值，代入线性方程，获得1g大豆食品冻干粉中γ-氨基丁酸含量。
2、总益生菌含量检测方法：取1g大豆食品冻干粉用10ml蒸馏水溶解，再稀释105倍，涂布于mrs固体培养基，30℃厌氧培养36h，计算菌落数。
3、总膳食纤维含量和水溶性膳食纤维含量测定方法：参照gb500988-2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》，其中水溶性膳食纤维比例为水溶性膳食纤维与总膳食纤维含量的比值。
【实施例1】
挑选豆粒饱满且无虫害的大豆，在30℃的浸泡液中淹没浸泡8h，浸泡液的配方为谷氨酸钠10g/l，氯化钙5mm，氯化锌0.1g/l，硫酸镁0.1g/l；倒掉浸泡液，在-20℃温度条件下冷冻24h；在40℃温度条件下热激24h。经过以上三步就完成了大豆的预处理。接着配置好发酵辅料，发酵辅料为包含豇豆粉(湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心选育的鄂豇豆14号)50g/l，纽甜(购于武汉市华甜生物科技有限公司)0.01g/l，谷氨酸钠(购于国药集团化学试剂有限公司)10g/l，氯化钙(购于国药集团化学试剂有限公司)5mm，氯化锌(购于国药集团化学试剂有限公司)0.1g/l的水溶液；然后将预处理后的大豆和发酵辅料混合构成发酵原料，发酵辅料与预处理后大豆质量比例为1/3，在115℃条件下蒸煮15min。再然后进入发酵过程，先准备好扩大培养的菌种，枯草芽孢杆菌atcc6051的培养条件是以lb基础培养基中添加2g/l的谷氨酸钠，15mm的氯化钙，0.1g/l的氯化锌，0.1g/l的硫酸镁为培养基，初始ph为7.0，在30℃温度条件下振荡培养15h；乳酸菌atcc11842和nrrlb-441的培养条件是以mrs基础培养基中添加1g/l的谷氨酸钠，10mm的氯化钙，0.05g/l的氯化锌，初始ph为6.0，35℃厌氧静置培养20h；再枯草芽孢杆菌atcc6051以质量比1％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在30℃恒温培养箱中通风培养18h；接着乳酸菌atcc11842和nrrlb-441都以质量比3％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在35℃恒温厌氧培养箱中培养36h。经过上述的好氧和厌氧两阶段过程就完成了发酵过程；最后经过冷冻干燥就得到富含γ-氨基丁酸的大豆食品。本方法制备的大豆食品γ-氨基丁酸含量为29.5mg/g，总益生菌含量为5×108cfu/g，总膳食纤维含量为28％，其中水溶性膳食纤维比例为16％。
【实施例2】
挑选豆粒饱满且无虫害的大豆，在35℃的浸泡液中淹没浸泡12h，浸泡液的配方为谷氨酸钠20g/l，氯化钙10mm，氯化锌0.15g/l，硫酸镁0.2g/l；倒掉浸泡液，在-30℃温度条件下冷冻32h；在45℃温度条件下热激30h。经过以上三步就完成了大豆的预处理。接着配置好发酵辅料，发酵辅料为包含豇豆粉(湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心选育的鄂豇豆14号)100g/l，纽甜(购于武汉市华甜生物科技有限公司)0.1g/l，谷氨酸钠(购于国药集团化学试剂有限公司)20g/l，氯化钙(购于国药集团化学试剂有限公司)10mm，氯化锌(购于国药集团化学试剂有限公司)0.15g/l的水溶液；然后将预处理后的大豆和发酵辅料混合构成发酵原料，发酵辅料与预处理后大豆质量比例为1/2，在121℃条件下蒸煮10min。再然后进入发酵过程，先准备好扩大培养的菌种，枯草芽孢杆菌atcc6051的培养条件是以lb基础培养基中添加3g/l的谷氨酸钠，20mm的氯化钙，0.15g/l的氯化锌，0.2g/l的硫酸镁为培养基，初始ph为8.0，在35℃温度条件下振荡培养20h；乳酸菌atcc11842和nrrlb-441的培养条件是以mrs基础培养基中添加2g/l的谷氨酸钠，15mm的氯化钙，0.1g/l的氯化锌，初始ph为7.0，40℃厌氧静置培养25h；再枯草芽孢杆菌atcc6051以质量比2％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在35℃恒温培养箱中通风培养24h；接着乳酸菌atcc11842和nrrlb-441都以质量比5％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在40℃恒温厌氧培养箱中培养48h。经过上述的好氧和厌氧两阶段过程就完成了发酵过程；最后经过冷冻干燥就得到富含γ-氨基丁酸的大豆食品。本方法制备的大豆食品γ-氨基丁酸含量为35.5mg/g，总益生菌含量为6×108cfu/g，总膳食纤维含量为32.7％，其中水溶性膳食纤维比例为19.5％。
【实施例3】
挑选豆粒饱满且无虫害的大豆，在32℃的浸泡液中淹没浸泡10h，浸泡液的配方为谷氨酸钠15g/l，氯化钙7mm，氯化锌0.12g/l，硫酸镁0.15g/l；倒掉浸泡液，在-25℃温度条件下冷冻28h；在42℃温度条件下热激28h。经过以上三步就完成了大豆的预处理。接着配置好发酵辅料，发酵辅料为包含豇豆粉(湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心选育的鄂豇豆14号)80g/l，纽甜(购于武汉市华甜生物科技有限公司)0.05g/l，谷氨酸钠(购于国药集团化学试剂有限公司)15g/l，氯化钙(购于国药集团化学试剂有限公司)7mm，氯化锌(购于国药集团化学试剂有限公司)0.12g/l的水溶液；然后将预处理后的大豆和发酵辅料混合构成发酵原料，发酵辅料与预处理后大豆质量比例为2/5，在121℃℃条件下蒸煮12min。再然后进入发酵过程，先准备好扩大培养的菌种，枯草芽孢杆菌atcc6051的培养条件是以lb基础培养基中添加2.5g/l的谷氨酸钠，18mm的氯化钙，0.12g/l的氯化锌，0.15g/l的硫酸镁为培养基，初始ph为7.5，在32℃温度条件下振荡培养18h；乳酸菌atcc11842和nrrlb-441的培养条件是以mrs基础培养基中添加1.5g/l的谷氨酸钠，12mm的氯化钙，0.075g/l的氯化锌，初始ph为6.5，37℃厌氧静置培养22h；再枯草芽孢杆菌atcc6051以质量比1.5％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在32℃恒温培养箱中通风培养22h；接着乳酸菌atcc11842和nrrlb-441都以质量比4％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在37℃恒温厌氧培养箱中培养42h。经过上述的好氧和厌氧两阶段过程就完成了发酵过程；最后经过冷冻干燥就得到富含γ-氨基丁酸的大豆食品。本方法制备的大豆食品γ-氨基丁酸含量为32.7mg/g，总益生菌含量为7×108cfu/g，总膳食纤维含量高达33.2％，其中水溶性膳食纤维比例为18.3％。
【实施例4】
挑选豆粒饱满且无虫害的大豆，在32℃的浸泡液中淹没浸泡12h，浸泡液的配方为谷氨酸钠15g/l，氯化钙7mm，氯化锌0.12g/l，硫酸镁0.15g/l；倒掉浸泡液，在-30℃温度条件下冷冻28h；在42℃温度条件下热激30h。经过以上三步就完成了大豆的预处理。接着配置好发酵辅料，发酵辅料为包含豇豆粉(湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心选育的鄂豇豆14号)100g/l，纽甜(购于武汉市华甜生物科技有限公司)0.02g/l，谷氨酸钠(购于国药集团化学试剂有限公司)15g/l，氯化钙(购于国药集团化学试剂有限公司)7mm，氯化锌0.12g/l的水溶液；然后将预处理后的大豆和发酵辅料混合构成发酵原料，发酵辅料与预处理后大豆质量比例为1/2，在121℃条件下蒸煮12min。再然后进入发酵过程，先准备好扩大培养的菌种，枯草芽孢杆菌atcc6051的培养条件是以lb基础培养基中添加2.5g/l的谷氨酸钠，20mm的氯化钙，0.15g/l的氯化锌，0.15g/l的硫酸镁为培养基，初始ph为7.0，在32℃温度条件下振荡培养18h；乳酸菌atcc11842和nrrlb-441的培养条件是以mrs基础培养基中添加1.5g/l的谷氨酸钠，12mm的氯化钙，0.075g/l的氯化锌，初始ph为6.5，37℃厌氧静置培养22h；再枯草芽孢杆菌atcc6051以质量比1.5％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在30℃恒温培养箱中通风培养24h；接着乳酸菌atcc11842和nrrlb-441都以质量比4％的接种量接种到发酵原料中，混合均匀，在35℃恒温厌氧培养箱中培养48h。经过上述的好氧和厌氧两阶段过程就完成了发酵过程；最后经过冷冻干燥就得到富含γ-氨基丁酸的大豆食品。本方法制备的大豆食品γ-氨基丁酸含量为34.5mg/g，总益生菌含量高达8×108cfu/g，总膳食纤维含量为32.7％，其中水溶性膳食纤维比例为19.4％。
以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。