一种体外模拟亚硝化体系中阻断NDMA生成的香辛料精油复合抑制剂的制作方法

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种体外模拟亚硝化体系中阻断ndma生成的香辛料精油复合抑制剂。

背景技术：

亚硝酸盐通常作为发色剂、抑菌剂和抗氧化剂广泛应用于腌肉制品的加工中。亚硝酸盐是n-亚硝胺类化合物的前体物，它极易可能与肉制品加工中所存在的二级胺反应生成n-亚硝胺。n-亚硝胺是世界上公认的三大强致癌物质之一，也是四大食品污染物之一。随着食品工业的迅速发展，消费者“保健、回归自然”的饮食意识不断加强，对食品的安全性也越来越重视，食品中的n-亚硝胺类化合物的污染问题也备受关注。目前抑制n-亚硝胺形成的研究主要集中于提高亚硝酸盐的清除率和阻断n-亚硝胺形成两方面。张平等确定了生姜的提取物对亚硝酸盐具有清除作用。周凤超等研究得出花椒、丁香和桂皮提取物对亚硝酸盐具有较强的清除能力，同时得出了丁香对n-亚硝胺的阻断能力强于花椒、桂皮和大蒜。李利华等在对亚硝酸盐清除试验中，研究得出胡椒提取物具有较好的清除作用。以上研究均是单一香辛料对n-亚硝胺的阻断作用，如何从众多的香辛料中筛选出阻断n-亚硝胺效果较好的香辛料，再将它们按一定比例配合，起到提高肉制品风味的同时，又能阻断肉制品中n-亚硝胺形成的双重作用，这方面的研究报道较少。

二次回归正交组合设计，是在因子空间中选择适当的试验点，以较少的试验处理建立一个有效的多项式回归方程，从而解决生产中最优化问题的一种实验设计方法，目的是寻找试验指标和各因子间的定量规律。

技术实现要素：

本发明为了解决目前缺乏阻断n-亚硝胺生成效果较好的香辛料，提供了一种体外模拟亚硝化体系中阻断ndma生成的香辛料精油复合抑制剂。

本发明由如下技术方案实现的：一种体外模拟亚硝化体系中阻断ndma生成的香辛料精油复合抑制剂，由胡椒、姜汁、花椒、八角、丁香5种香辛料精油混合制备而成，体积浓度分别为2.078ml/l、3.118ml/l、3.692ml/l、2.833ml/l、0.218ml/l。

制备体外模拟亚硝化体系中阻断ndma生成的香辛料精油复合抑制剂的方法，具体方法为：分别吸取胡椒、姜汁、花椒、八角、丁香5种香辛料精油的体积为1.039ml、1.559ml、1.846ml、1.4165ml、0.109ml，至50ml的带螺帽的离心管内，各加入0.05gpeg8000，用0.5mol/lph3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液将其定容到10ml；用匀浆机13000rpm乳化处理即为香辛料精油复合抑制剂。

利用所述的香辛料精油复合抑制剂在体外模拟亚硝化体系中阻断ndma生成的方法，具体方法为：

取1.0ml配制好的香辛料精油复合抑制剂至50ml的带螺帽的离心管内，加入0.5mol/lph3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液5.0ml，加入1mmol/l的亚硝酸钠0.5ml，再加1mmol/l的二甲胺盐酸盐0.5ml，然后用柠檬酸钠-盐酸缓冲液将反应体系定容到10ml，在37℃下水浴反应1h；反应结束后，取1.0ml反应的溶液至玻璃试管中，加入0.5ml质量分数0.5%的碳酸钠溶液终止反应，将其置于15w紫外灯下照射15min，液面距灯高为15cm，取出后立即依次加入质量分数1%的对氨基苯磺酸1.5ml和质量分数0.1%的α-萘胺1.5ml摇匀，再加柠檬酸钠-盐酸缓冲液至溶液体积精确为5.0ml，摇匀，静置15min显色后在波长525nm比色测定其吸光度。

本发明采用单因素和二次回归正交组合设计相结合的方法，拟构建出胡椒、姜汁、花椒、八角、丁香5种香辛料精油的回归模型及其最优配比，为后期开发安全、美味的肉类产品香辛料组合提供数据支持。本发明所制备的香辛料精油复合抑制剂在起到抑制肉制品中n-亚硝胺形成的同时，还能赋予肉制品特有的风味，将对安全、味美的肉制开发具有重要的指导作用。

附图说明

图1为单因素与ndma抑制率的关系实验结果图。

具体实施方式

一、材料与方法

1.材料与试剂：市售常用的9种香辛料精油（胡椒、姜汁、蒜汁、花椒、桂皮、八角、丁香、小茴香、孜然）皆为天津顶兴食品有限公司提供；新鲜猪肋条肉购于天津市康宁肉制品有限公司；食盐、白糖、鸡蛋、味精、白酒、葡萄糖购于天津市红旗农贸综合批发市场；复合磷酸盐、卡拉胶购于郑州凯之裕食品添加剂有限公司；亚硝酸钠、抗坏血酸钠、烟酰胺、大豆分离蛋白粉均为食品级，购于郑州裕和食品添加剂有限公司；50ml一次性注射器，郑州康佳医疗器械有限公司。

乳化剂（peg8000）、柠檬酸钠、盐酸、α-萘胺、无水乙醇、无水对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、二甲胺盐酸盐、碳酸钠、硫酸，以上均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、氯化钠、无水硫酸钠，天津市风船化学试剂科技有限公司；9种n-亚硝胺标品：ndma、ndea、npyr、n-甲基乙基亚硝胺（n-nitrosomethylethylamine，nmea）、n-二丁基亚硝胺（n-nitrosodibutylamide，ndba）、n-二丙基亚硝胺（n-nitrosodipropylamine，ndpa）、n-亚硝基哌啶（n-nitrosopiperidine，npip）、n-亚硝基吗啉（n-nitrosomorpholine，nmor）、n-亚硝基二苯胺（n-nitrosodiphenylamine，ndphea），美国sigma公司。

2.仪器与设备：7890a气相色谱仪（配备氮磷检测器），美国安捷伦公司；re-2000a旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；cca-20低温泵，巩义市予华仪器有限责任公司；bvrj-40真空滚揉机、byxx-50烟熏炉，浙江嘉兴艾博实业有限公司；llj-a10t1搅拌机，广东小熊电器有限公司；fa2004精密电子天平，上海精科仪器公司；starter3100酸度计，美国ohaus公司；18basic匀浆机，德国ika公司；xmtd-4000电热恒温水浴锅，上海科恒实业发展有限公司；超净工作台，天美（中国）科学仪器有限公司；t6新世纪型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

3.体外模拟亚硝化乳化体系的制备

参照文献《复配香辛料提取物体外阻断ndma生成的效果》（马俪珍,王瑞,熊勇,甄润英.[j].食品与生物技术学报,2009,28(02):192-196.）的方法，并稍作修改。将9种香辛料精油分别吸取0.00、0.05、0.50、1.00、1.50、2.00ml至50ml的带螺帽的离心管内，各加入0.05gpeg8000，用0.5mol/lph3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液将其定容到10ml。用匀浆机b挡（13000rpm）乳化处理后，9种香辛料精油乳液的体积浓度分别为0、5、50、100、150、200ml/l，同时以不添加香辛料精油的空白乳液作为对照组。分别取1ml配制好的乳液至50ml的带螺帽的离心管内，加入0.5mol/lph3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液5.0ml，加入1mmol/l的亚硝酸钠0.5ml，再加1mmol/l的二甲胺盐酸盐0.5ml，然后用缓冲液将反应体系定容到10ml，在37℃下水浴反应1h。反应结束后，取1.0ml反应的溶液至玻璃试管中，加入0.5ml质量分数0.5%的碳酸钠溶液终止反应，将其置于15w紫外灯下照射15min，液面距灯高为15cm，取出后立即依次加入质量分数1%的对氨基苯磺酸1.5ml（摇匀）和质量分数0.1%的α-萘胺1.5ml（摇匀），再加缓冲液至溶液体积精确为5.0ml，摇匀，静置15min显色后在波长525nm比色测定其吸光度。

4.单因素试验

单因素试验研究不同体积浓度的香辛料精油乳液对ndma抑制率。加入配制的各香辛料精油乳液时，其各香辛料精油乳液的体积浓度为0.0、0.5、5.0、10、15、20ml/l（表示每l体外模拟亚硝化反应体系中含有各种精油的ml数）。按上述1.3.1的操作步骤进行测定，同时做空白对照（不加香辛料精油的空白乳液），计算每一种香辛料精油在对应体积浓度时的抑制率，并进行分析。试验均重复3次。

5.二次回归正交试验设计

根据单因素阻断试验结果，确定以胡椒体积浓度（z1，1.00~3.00ml/l）、姜汁体积浓度（z2，2.00~4.00ml/l）、花椒体积浓度（z3，2.00~4.00ml/l）、八角体积浓度（z4，2.00~4.00ml/l）和丁香体积浓度（z5，0.10~0.30ml/l）为影响因素水平，进行二次回归正交组合试验。由因素数m=5，零水平重复次数m0=6，根据二次回归正交组合设计常用γ值表查得γ=1.820（1/2实施）。设5个实际因素z1、z2、z3、z4、z5的相应编码因素为x1、x2、x3、x4、x5，各因素的零水平：

因素水平编码表如表1所示。

表15因素二次回归正交组合设计水平取值及编码表

将x1、x2、x3、x4、x5依次安排在常用正交表l16（2¹⁵）的第1，2，4，8，15列上，将列中的数字2改成﹣1；加入10个星点号（轴点）和6个中心点获得五因素二次回归正交组合设计。

6.验证试验：

6.1体外亚硝化模拟乳化体系中的验证

按照上述3的操作步骤，将二次回归正交组合设计得出的香辛料精油的最优配比添加到体外模拟ndma形成的体系中，试验重复6次进行验证。

6.2西式培根中的验证

西式培根的制作：

（1）配制腌制液：按照5kg猪肋条肉计，配制1kg腌制液：在1kg开水中，添加食盐90.0g、复合磷酸盐15.0g、亚硝酸钠0.6g、白糖50.0g、大豆分离蛋白粉8.0g等。将配制好的腌制液置于0~2℃的冷库中冷却备用。

（2）工艺流程：猪肋条肉→分割→梅花式人工注射腌制液→真空滚揉→冷库静腌2h→真空滚揉→悬挂→干燥→烟熏→冷却→真空包装→速冻→-80℃冷冻。

将由二次回归正交组合设计得出的最优配比亚硝化抑制剂应用到西式培根的实际生产中，分析亚硝化抑制剂对西式培根中ndma的抑制效果，同时做对照实验(西式培根的对照组除了不添加亚硝化抑制剂外，其余原料的添加比例与实验组保持一致)，进一步验证二次回归正交组合设计的试验结果。

7.西式培根中ndma的测定

参照cb/t5009.26-2016《食品安全国家标准食品中n一亚硝胺化合物的测定》，使用气相色谱仪测定西式培根中的n-亚硝胺。将前处理好的样品瓶上气相色谱仪测定，测定条件：进样口温度250℃；检测器温度330℃；载气流速6ml/min；空气流速60ml/min；hz流速3ml/min；分流模式：不分流进样；进样量1μl。利用安捷伦工作站对色谱图进行分析及数据处理，采用保留时间进行定性，外标法定量。

8.ndma抑制率的计算：抑制率/%（a0为不加入各香辛料精油的空白乳液时的吸光度值；ax为加入各香辛料精油乳液时的吸光度值）。

9.数据处理：运用sigmaplot10.0软件作图，采用spss17.0软件对数据进行单因素方差分析(one-wayanova)。选择duncan's多重分析法检验组间显著性，显著性水平为p<0.05。

二、结果与分析

1.单因素试验：9种香辛料精油添加浓度不同对ndma抑制率变化见表2所示。由表2可以看出，9种香辛料精油对ndma的形成均有抑制作用，但抑制作用的浓度和抑制率各有不同。其中，丁香精油对ndma的抑制率最强，丁香精油的体积浓度在0.5ml/l时，对ndma的抑制率为62.05%，体积浓度为5.0ml/l时，对ndma抑制率可升高至76.81%，当浓度继续升高时，抑制作用并没有显著增强（p>0.05）；其次胡椒、花椒和八角精油对ndma的抑制性也较强，体积浓度为5.0ml/l时，对ndma抑制率均在65.0%以上，当体积浓度再继续增加时，抑制作用保持在70.93~74.07%范围；桂皮和孜然精油则需要体积浓度升高至10.0ml/l时，对ndma的抑制率才分别达到66.14%和64.79%；小茴香精油需要浓度再升高为15.0ml/l时，对ndma的抑制作用才能达到61.21%；姜汁和蒜汁精油对ndma的抑制率最弱，且不随浓度增加而显著增加（p>0.05），仅呈现平缓的增加趋势，当浓度升高至最高20ml/l时，抑制率也仅为37.19%和36.07%。由以上分析结果可以看出，单一使用某一种香辛料精油需要较高的浓度（5.0ml/l以上，丁香精油除外）才能对ndma的抑制率达到60%以上，然而在实际应用中要考虑到产品的风味，不可能添加如此高的浓度，所以我们选择对ndma抑制效果较好的丁香、胡椒、花椒和八角精油以较低浓度进行复配，另外考虑到生姜精油在实际应用中所起到的去腥、去异味等特殊作用，尽管它对ndma的抑制率低，也将其考虑进来进一步优选。

表29种香辛料精油添加浓度不同对ndma抑制率的变化（%）

注：结果表示为平均值±标准偏差(n=3)；同一列平均值后不同字母表示有显著性差异（p<0.05）。

2.二次回归正交试验

2.1建立回归方程：研究5个因素对试验结果y的影响，采用二次回归正交组合设计共有32个处理（包括m0），由于m=5，其规范变量与试验指标y之间的回归关系式为：

y=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x4+b5x5+b12x1x2+b13x1x3+b14x1x4+b15x1x5+b23x2x3+b24x2x4+b25x2x5+b34x3x4+b35x3x5+b45x4x5+b11x'1+b22x'2+b33x'3+b44x'4+b55x'5（1）

2.2二次回归正交试验结果的统计：

回归模型的检验：偏回归系数的显著性检验

回归关系方差分析表见下表3所示。

表3回归关系方差分析表

方差分析表明：失拟性不显著，总的回归关系达到极显著水平，说明回归方程拟合度很好，r²=0.955，说明本试验设计的因素、水平选择是成功的。

2.3回归方程的失拟性检验：由表3可得，拟合度f检验公式为：失拟检验差异不显著，说明该方程拟合度很好，且此回归方程在此试验中有一定意义。

2.4回归方程的回代：通过上述对二次回归方程的偏回归系数的显著性检验和失拟性检验，可知此方程拟合的很好，本试验设计的因素、水平是成功的，说明此回归方程在此试验中有一定意义。由偏回归系数假设检验结果可知，x2、x3、x5、x1x4、x'1、x'2、x'3、x'4、x'5的偏回归系数有显著性，虽然x2、x3x4在α=0.05水平上不显著，但是x2在α=0.25水平上是显著的，故不予剔除；而x3x4在α=0.25水平上是不显著的，但考虑到x3（花椒精油）和x4（八角精油）可能存在一定的交互关系，所以将x3x4也列入回归方程中，进而得出其优化的回归方程为y=59.057+0.293x2+2.339x3+0.588x5-0.506x1x4-0.272x3x4-0.540x'1-0.681x'2-0.963x'3-0.681x'4-0.916x'5。（2）

将x'j=x²j-0.707代入以上方程中，得到

y=61.730+0.293x2+2.339x3+0.588x5-0.506x1x4-0.272x3x4-0.540x²1-0.681x²2-0.963x²3-0.681x²4-0.916x²5（3）

再将

便得到用实际因素zj表示的回归方程：

y=-61.312+12.159z1+14.039z2+26.048z3+19.549z4+131.815z5-1.673z1z4-0.899z3z4-1.785z²1-2.251z²2-3.183z²3-2.251z²4-302.810z²5（4）

2.5主效应分析：由于数据进行了中心化处理，消除了量纲上的差异，可直接根据回归系数绝对值的大小来分析各种精油对ndma抑制效果的影响^[23-25]。由回归方程（2）可知，各回归系数绝对值的大小依次为b3>b5>b2>b1>b4，说明花椒精油和丁香精油对ndma的抑制效果较好。

单因素效应分析：用“降维法”将上述回归方程（3）中的任意4个因素固定在零水平，得到剩余的一个因素与模拟体系中n二甲基亚硝胺抑制率的单因素效应方程分别为y1=61.730-0.540x²1、y2=61.730+0.293x2-0.681x²2、y3=61.730+2.339x3-0.963x²3、y4=61.730-0.681x²4、y5=61.730+0.588x5-0.916x²5。分别把5个编码因素的取值分别固定在－1.820、－1、0、+1、+1.820水平上，计算对应的y值即各编码因素在5个不同水平上对ndma的抑制率，并作图1。

由图1可知，各编码变量在-1.820～1.820这一取值范围内，5个编码因素与ndma抑制率的关系曲线均呈现出先上升后下降的趋势。其中，胡椒精油（z1）、姜汁精油（z2）、八角精油（z4）和丁香精油（z5）4种香辛料精油在编码变量－1.820≤x≤0的取值范围内时，编码值与ndma抑制率呈正相关；在编码变量0≤x≤1.820的取值范围内，则反之；且这4种香辛料精油在编码变量为0时，ndma的抑制率有最大值。而花椒（z3）则在编码变量为1时，ndma的抑制率有最大值。

因素间交互效应分析：由表4可知，对回归方程偏回归系数进行显著性检验，b14在α=0.5水平上有显著性差异，表示x1（胡椒精油）与x4（八角精油）之间存在明显的交互作用；b34虽然在α=0.25水平上没有显著性差异，但x3（花椒精油）与x4（八角精油）之间的交互作用相比于其他因素之间较为显著。

优化试验结果：利用数学求极值的方法，对回归方程（3）求一阶偏导数，寻找所得到的五元二次回归方程的局部最优解。对所建立的编码回归方程，先求其关于5个编码变量的一阶偏导并令其等于零^[30]。用excel解方程组得到x1=0.142、x2=0.215、x3=1.258、x4=-0.303、x5=0.321时，y有极大值；各因素z1=2.078、z2=3.118、z3=3.692、z4=2.833、z5=0.218，即添加胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香的体积浓度分别为2.078、3.118、3.692、2.833、0.218ml/l时，由回归方程得出抑制率的理论值为63.327%。

验证实验结果：在体外模拟亚硝化反应体系中添加胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香，添加量分别为2.078、3.118、3.692、2.833、0.218ml/l，结果表明，香辛料精油的加入对ndma的抑制率为64.412%，与理论值63.327%相当，说明得到的二次回归方程与实际的拟合效果较好；同时将相同水平的亚硝化抑制剂应用到西式培根的实际生产中，分析亚硝化抑制剂对西式培根中ndma抑制率的影响，结果表明，亚硝化抑制剂的添加可以明显抑制西式培根中ndma的形成，ndma抑制率可达62.26%(对照组中ndma含量为1.59μg/kg，实验组中ndma含量为0.60μg/kg)，说明本研究所得到的模型与实际拟合程度较好，通过二次回归正交组合设计所确定的亚硝化抑制剂最优配比合理可行。

本试验采用二次回归正交组合设计得到的最优配比，对ndma的抑制率（验证试验值64.412%）比单因素试验中最高的ndma抑制率（花椒的体积浓度为15ml/l，对ndma的抑制率为74.07%）低10%，这是因为筛选的最优配比中各浓度要远低于单一香辛料精油，例如，丁香精油在单因素试验中，当体积浓度为0.5ml/l时，ndma抑制率为62.05%，而5种香辛料精油复配后，丁香精油仅需0.218ml/l，ndma抑制率即可达到64.412%；胡椒在单因素中需要添加5ml/l，对ndma的抑制率达65.74%，而5种香辛料精油复配后，胡椒精油仅需2.078ml/l，ndma抑制率即可达到64.412%。所以，在腌肉制品加工中考虑到香辛料精油添加量对风味的影响，本研究的复配香辛料精油在起到抑制肉制品中n-亚硝胺形成的同时，还能赋予肉制品特有的风味，这一研究结果将对安全、味美的肉制品开发具有重要的指导作用。

单因素试验结果表明，在体外模拟亚硝化体系中，9种香辛料精油对ndma的生成皆有抑制作用，但抑制作用的浓度和抑制率各有不同。丁香精油对ndma的抑制作用最强，其次是胡椒、花椒和八角精油，小茴香、桂皮和孜然需要较高浓度才表现出一定的抑制率，姜汁和蒜汁精油对ndma的抑制率最弱。

五元二次回归正交组合设计得到5种香辛料精油的最优体积浓度配比为：当胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香的体积浓度分别为2.078、3.118、3.692、2.833、0.218ml/l时，由回归方程得出对ndma的抑制率理论值为63.327%，将此水平的亚硝化抑制剂分别添加到体外模拟亚硝化体系和西式培根的实际生产中，得到ndma的抑制率分别为64.412%和62.26%，说明得到的回归模型与实际拟合效果较好；此回归模型为肉制品加工中n-亚硝胺抑制剂的开发提供了理论依据，为腌肉制品的实际生产提供了技术支持。