1.本发明涉及食品和生物技术领域，尤其是一种双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法。
背景技术：
2.蛋白质是人体所必需的营养物质，优质蛋白能为人体健康提供重要保障。食用菌的蛋白质含量大约占干物质的15～40％，营养和保健价值高于谷物蛋白，是一类优质的蛋白质资源。
3.双孢蘑菇(agaricus bisporus)商品名为双孢菇、洋菇、白蘑菇、蘑菇，是全世界范围内广泛种植和消费的食用菌，分类上属于真菌界、担子菌门、层菌纲、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属。双孢蘑菇是低盐、低糖、低脂肪、高蛋白质的健康食品，符合新世纪推崇的“三低一高”饮食标准，其干物质中蛋白含量约为23.9～34.8％。双孢蘑菇蛋白中含有18种氨基酸(包括人体必需的8种氨基酸)，且多为l型，更易被人体吸收利用(利用率可达75％以上)；双孢蘑菇蛋白中含有多种活性成分，例如胰蛋白酶、酪氨酸酶和麦芽糖酶，具有益胃健脾、理气化痰的功效，对于高血压、高血脂、高血糖具有一定的辅助食疗效果；其菌丝体糖蛋白，具有抑制艾滋病毒侵染与增殖的作用。
4.国内关于双孢蘑菇蛋白提取及产品方面的专利很少，仅见cn107581444a公布了一种蘑菇小分子肽复配的固体饮料及其制备方法：将蘑菇肽粉、银杏肽粉、灵芝肽粉、黑芝麻肽粉、人参肽粉等复配成高营养功能食品，但未述及蛋白与肽粉的具体制备方法；cn104381584a公布了一种巴西蘑菇蛋白粉加工工艺：将巴西蘑菇鲜品通过浸泡清洗、粗粉碎、加水调浆、超细粉碎、离心分离、反渗透浓缩和喷雾干燥，制得蛋白粉，利用率大于95％；该专利采用比较温和的水提取方法，以及价格昂贵的反渗透膜截留氯化钠，最主要的是该专利制得的蛋白粉未经过增溶处理，因此溶解度低、冲调性差，严重制约其在食品工业中的应用。
技术实现要素：
5.本发明的目的是在于克服、补充现有技术中存在的不足，提供一种双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，提供一种氮溶解指数高、溶解度大、冲调性好的新型食用菌蛋白多糖产品，从而极大地拓宽其在食品和保健品领域的应用范围。
6.本发明提供一种双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，该方法包括超微粉碎、碱液浸提、化学改性、浓缩脱盐、喷雾干燥、物理筛分共六个工艺步骤，在确保提取收率前提下增加了产品溶解度，具有简单实用、适合工业化大规模生产的特点。
7.本发明采用的技术方案是：
8.一种双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：采用双孢蘑菇子实体、菌丝体或其残次菇为原料，依次通过超微粉碎、碱液浸提、化学改性、浓缩脱盐、喷雾干燥和物理筛分，获得双孢蘑菇可溶性蛋白粉，具体制备步骤如下：
9.(1)超微粉碎
10.将双孢蘑菇子实体、菌丝体或其残次菇原料，采用超微粉碎技术进行破壁处理，过300目筛，得到超微粉；
11.(2)碱液浸提
12.将经过步骤(1)处理的超微粉中加入碱液调节ph至12，搅拌，离心，离心后的上清液即为浸提液；
13.ph12的强碱性条件下，双孢蘑菇蛋白分子处于溶融态，其三级结构解体而维持原有的一、二级结构；随着稀盐酸的缓慢滴加，水中离子强度发生改变，使得溶剂体系发生物理相变，水分子氢键发生重排而产生自由水，并渗透到蛋白质内部结构；同时以剪切、挤压、撞击为特征的机械搅拌造成分子水平上的胁迫，改变了蛋白的保守疏水结构、遏制其去离子化过程中复性、阻止聚集体形成。物理相变耦联机械胁迫机制能在维持蛋白一级机构的基础上实现二级结构的折叠-转角转变，最终形成聚集度较低的极性蛋白体颗粒，提高蛋白溶解度。
14.(3)化学改性
15.将浸提液中加入亚硫酸钠和氨基酸，溶解后滴加稀盐酸进行中和，并在30～60min内将浸提液ph值调节至ph 6～9，反应结束后，将料液升温至80～100℃，并保持5～10min，然后迅速冷却至室温；
16.(4)浓缩脱盐
17.将改性后的料液过陶瓷膜进行浓缩，并用去离子水洗涤浓缩液，直至浓缩液电导率小于4000us/cm；
18.(5)喷雾干燥
19.浓缩脱盐后的料液进行喷雾干燥，并收集水分含量小于10％的干燥粉末；
20.(6)物理筛分
21.将干燥粉末过100目筛，得到双孢蘑菇可溶性蛋白粉。
22.优选的是，所述的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：所述步骤(1)中双孢蘑菇子实体、菌丝体或其残次菇原料，包括含水的鲜品和经干燥处理后的干品。
23.优选的是，所述的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：所述步骤(2)中搅拌温度为25℃～40℃，搅拌时间为4～8h。
24.优选的是，所述的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：所述步骤(2)中碱液为氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠的一种，所述碱液与物料的重量比为10:1～100:1，优选15:1(重量比)。
25.优选的是，所述的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：所述步骤(2)中离心转速为9000～10000rpm，离心时间为5～10min。
26.优选的是，所述的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：所述步骤(3)中亚硫酸钠加入量为料液体积的0.01～0.1％，优选0.05％(体积百分比)；氨基酸加入量为料液体积的0.001～0.1％，优先选择0.02％(体积百分比)，所述氨基酸为蛋氨酸、胱氨酸和l-半胱氨酸的一种或几种，优选l-半胱氨酸。
27.蛋氨酸、胱氨酸和l-半胱氨酸均属于含硫氨基酸，分子内存在甲硫基和巯基，双孢蘑菇蛋白也富含这三种氨基酸；在ph12强碱性溶融态下，双孢蘑菇蛋白结构呈打开状态，导
致其含硫基团与极性的亲水基团均暴露在外，从而易与外源氨基酸发生化学反应形成二硫键复合物，同时不同蛋白分子之间也能通过外源氨基酸的媒介作用形成复合物，使得其亲水基团不会再次折叠在内部；超分子结构共组装机制能在维持蛋白一级机构的基础上重组为相对展开的三维构象，导致其聚集度下降、极性基团暴露，形成亲水性纳米离子。
28.优选的是，所述的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：所述步骤(3)中稀盐酸的浓度为0.2m～0.4m。
29.优选的是，所述的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：所述步骤(4)中陶瓷膜分离级别为2000～50000d分子量，优先选择8000d(5nm)分子量的分离级别。
30.优选的是，所述的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，其中：所述步骤(5)中喷雾干燥的进风温度为195℃～200℃，出风温度为90℃～100℃。
31.本发明的优点：
32.(1)本发明的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，采用物理相变耦联机械胁迫机制和超分子结构共组装机制来对双孢蘑菇蛋白进行改性增溶处理，显著提高了双孢蘑菇蛋白的溶解度、明显改善了其冲调性。
33.(2)本发明的双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法，将超微粉碎、碱液浸提、化学改性与陶瓷膜浓缩脱盐相结合，既确保了提取收率、增溶了蛋白，又高效地实现了脱盐目的，制备方法生产成本低、效率高、操作简单、实用性强、便于工业化实施。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
35.实施例1
36.一种双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法包括以下步骤：
37.(1)超微粉碎
38.将双孢蘑菇子实体干品用hr3868型飞利浦破壁料理机(飞利浦中国投资有限公司)进行破壁处理，收集过300目筛的超微粉；
39.(2)碱液浸提
40.称取双孢蘑菇子实体超微粉3千克，加入15倍(约45l)用食品级氢氧化钠预调至ph12的碱液，充份搅拌均匀，置于25℃室温搅拌12h；然后9000rpm离心10分钟，得到上清液(约41.4l)即为浸提液；
41.(3)化学改性
42.在浸提液中加入0.05％食品级亚硫酸钠(20.7g)和0.02％食品级l-半胱氨酸(8.28g)，溶解后，边搅拌边缓慢滴加0.2m稀盐酸进行中和；控制稀盐酸滴加速度，在30分钟内将料液ph值调节至8.2，反应结束后，将料液(约55l)升温至100℃，并保持5分钟，然后迅速冷却至室温；
43.(4)浓缩脱盐
44.将改性后的料液过njlc-1*2型陶瓷膜设备(南京溧翠环保科技有限公司)进行浓缩，膜孔径为5nm(8000d分子量级别)、机器容量60l，过膜流速为30l/h。当料液体积浓缩至初始体积的五分之一时，加入与浓缩液同等体积的去离子水进行水洗脱盐，共洗涤4次，最终浓缩脱盐后的料液电导率为3580us/cm、体积约12l；
45.(5)喷雾干燥
46.浓缩脱盐后的料液采用sp-5000型喷雾干燥机(上海顺仪实验设备有限公司)进行喷雾干燥，机器的进风温度为195℃、出风温度为90℃，进料速度5l/h，干燥时间2.5小时；
47.(6)物理筛分
48.将干燥粉末过100目筛，得到711克双孢蘑菇可溶性蛋白粉，提取收率为23.7％(计算公式：可溶性蛋白粉质量
÷
原料质量
×
100％)；
49.经测定，制备的双孢蘑菇可溶性蛋白粉，蛋白含量为54.87％(以干基计)、氮溶解指数(nsi)为96％、水分含量为7.30％、灰分含量为6.49％(以干基计)。
50.实施例2
51.一种双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法包括以下步骤：
52.(1)超微粉碎
53.将双孢蘑菇子实体干品用hr3868型飞利浦破壁料理机(飞利浦中国投资有限公司)进行破壁处理，收集过300目筛的超微粉；
54.(2)碱液浸提
55.称取双孢蘑菇子实体超微粉3千克，加入100倍(约300l)用食品级氢氧化钠预调至ph12的碱液，充份搅拌均匀，置于25℃室温搅拌12h；然后9000rpm离心10分钟，得到上清液(约253l)即为浸提液；
56.(3)化学改性
57.在浸提液中加入0.1％食品级亚硫酸钠(253g)和0.1％食品级l-半胱氨酸(253g)，溶解后，边搅拌边缓慢滴加0.2m稀盐酸进行中和；控制稀盐酸滴加速度，在40分钟内将料液ph值调节至9.0，反应结束后，将料液(约372l)升温至100℃，并保持5分钟，然后迅速冷却至室温；
58.(4)浓缩脱盐
59.将改性后的料液过njlc-1*2型陶瓷膜设备(南京溧翠环保科技有限公司)进行浓缩，膜孔径为31.25nm(50000d分子量级别)、机器容量60l，过膜流速为30l/h，当料液体积浓缩至初始体积的五分之一时，加入与浓缩液同等体积的去离子水进行水洗脱盐，共洗涤4次，最终浓缩脱盐后的料液电导率为3056us/cm、体积约77l；
60.(5)喷雾干燥
61.浓缩脱盐后的料液采用sp-5000型喷雾干燥机(上海顺仪实验设备有限公司)进行喷雾干燥，机器的进风温度为195℃、出风温度为90℃，进料速度10l/h，干燥时间7.8h；
62.(6)物理筛分
63.将干燥粉末过100目筛，得到517.7克双孢蘑菇可溶性蛋白粉，提取收率为17.26％(计算公式：可溶性蛋白粉质量
÷
原料质量
×
100％)。
64.经测定，制备的双孢蘑菇可溶性蛋白粉，蛋白含量为56.95％(以干基计)、氮溶解指数(nsi)为90％、水分含量为5.61％、灰分含量为4.28％(以干基计)。
65.实施例3
66.一种双孢蘑菇可溶性蛋白粉的制备方法包括以下步骤：
67.(1)超微粉碎
68.将双孢蘑菇子实体干品用hr3868型飞利浦破壁料理机(飞利浦中国投资有限公
司)进行破壁处理，收集过300目筛的超微粉；
69.(2)碱液浸提
70.称取双孢蘑菇子实体超微粉3千克，加入15倍(约45l)用食品级氢氧化钠预调至ph12的碱液，充份搅拌均匀，置于25℃室温搅拌12h；然后9000rpm离心10分钟，得到上清液(约41.4l)即为浸提液；
71.(3)化学改性
72.在浸提液中加入0.05％食品级亚硫酸钠(20.7g)和0.02％食品级l-半胱氨酸(8.28g)，溶解后，边搅拌边缓慢滴加0.2m稀盐酸进行中和；控制稀盐酸滴加速度，在60分钟内将料液ph值调节至8.2，反应结束后，将料液(约55l)升温至100℃，并保持5分钟，然后迅速冷却至室温；
73.(4)浓缩脱盐
74.将改性后的料液过njlc-1*2型陶瓷膜设备(南京溧翠环保科技有限公司)进行浓缩，膜孔径为5nm(8000d分子量级别)、机器容量60l，过膜流速为30l/h。当料液体积浓缩至初始体积的五分之一时，加入与浓缩液同等体积的去离子水进行水洗脱盐，共洗涤4次，最终浓缩脱盐后的料液电导率为3580us/cm、体积约12l；
75.(5)喷雾干燥
76.浓缩脱盐后的料液采用sp-5000型喷雾干燥机(上海顺仪实验设备有限公司)进行喷雾干燥，机器的进风温度为195℃、出风温度为90℃，进料速度5l/h，干燥时间2.5h；
77.(6)物理筛分
78.将干燥粉末过100目筛，得到711克双孢蘑菇可溶性蛋白粉，提取收率为23.7％(计算公式：可溶性蛋白粉质量
÷
原料质量
×
100％)。
79.经测定，制备的双孢蘑菇可溶性蛋白粉，蛋白含量为54.87％(以干基计)、氮溶解指数(nsi)为96％、水分含量为7.30％、灰分含量为6.49％(以干基计)。
80.成品指标
81.实施例1-3获得的双孢蘑菇可溶性蛋白粉为白色至浅黄色，具有双孢蘑菇应有的滋味与气味，无其他异味，加水冲调后易溶解，蛋白含量大于50％(以干基计)、氮溶解指数(nsi)大于90％，水分含量小于10％，灰分含量小于10％(以干基计)。
82.蛋白含量测定方法：按gb 5009.5《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》规定的方法测定。
83.氮溶解指数(nsi)测定方法：
84.精确称取100mg样品，加蒸馏水20ml，配制成5mg/ml浓度；4℃下9000rpm离心15min，取上清液；按gb 5009.5《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的规定，测定样液(上清液)和样品中的含氮量，采用公式计算氮溶解指数(nsi)：
[0085][0086]
式中：
[0087]
c——样液的含氮量(g/ml)；
[0088]
v——样液的体积(ml)；
[0089]
x——样品的含氮量(g/100g)。
[0090]
水分含量测定方法：按gb 5009.3《食品安全国家标准食品中水分的测定》规定的方法测定。
[0091]
灰分含量测定方法：按gb 5009.4《食品安全国家标准食品中灰分的测定》规定的方法测定。
[0092]
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。