专利名称：细胞分裂素混合粉剂及其制造方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵产生细胞分裂素混合粉剂的方法，该粉剂属于一种植物生长调节剂。
1950-1953年，中国农科院尹莘耘教授在调查棉麦病害时，发现凡是种过三年紫花苜蓿的地块上，换种棉花或小麦时，不仅植株高壮，而且棉花的黄枯萎病和小麦锈病的发生均较连种棉麦的地块轻微。尹莘耘教授从苜蓿根部分离并测定各种放线菌对棉花黄萎和立枯病菌的拮抗性能。分析结果表明，自苜蓿根部分离的高效抗生菌的比率，较从其它作物根部或土壤中分离的高达5-10倍。其中，从陕西省泾阳县苜蓿根上分离的“5406”号放线菌，在生长过程中能分泌数种植物生长刺激素及抗生素。具有刺激细胞分裂，促进作物叶绿素增加，促进早熟，保花保果，防病抗病，提高作物产量。资料证明，似“5406”号这样多功能菌株，在国外属罕见。
菌株5406号经过鉴定，属于粉红孢类群链霉菌的一个新种，定名为泾阳链霉菌(Streptomycesjingyangensisn.spTaoetal，1978)，并指定5406为这个新种的典型菌株，保存在中国科学院微生物研究所，编号为4.891。其分泌物经鉴定属细胞分裂素类物质。
国内外文献都曾报道过多种细菌和与植物共生的菌根真菌培养物中发现天然细胞分裂素及细胞分裂素类物质，但都未曾对如何提高这些菌株产生细胞分裂素活性以及如何工厂化生产细胞分裂素有过报导。
从50年代末到70年代末，5406的应用技术以抗生素肥料用于农业，简称5406菌肥，在全国各地应用中，对多种作物获得良好的增产效果，但是5406菌肥是采用中国传统固体发酵法生产，该方法虽然简单，成本低廉，但仍有很多缺陷(1)由于未对5406菌种加以筛选，故菌种退化严重，菌肥的肥效减小;(2)由于生产品仅为菌肥，故受到施用方法及自然条件限制;(3)菌肥的有效成分少，效果慢。
本发明针对以上缺陷提出一种筛选高产“5406”菌株的方法，以及用5406菌株生产细胞分裂素混合粉剂的工艺。
以下对本发明进行详细说明1、5406菌种分离与筛选链霉菌菌株5406是从我国陕西省泾阳县苜蓿地的苜蓿根部分离到的，通过鉴定属于粉红孢类群链霉菌的一个新种，定名为泾阳链霉菌(Streptomycesjingyangensisn.spTaoetal，1978)。
2、形态和培养特征基内菌丝体呈分枝状，未观察到菌丝断裂现象。孢子丝单槎分枝，年幼时直或波曲，成熟时呈2-4圈松敞螺旋，有时可多至6-7圈。孢子长椭圆形到柱形，1.4-1.6×0.8-1.0微米。孢子表面光滑，形似稻种。无轮生枝，无游动孢子，无孢束和菌核。菌株在琼脂培养基上，生长浅黄，反面木瓜黄到虎皮黄。气生菌丝浅玫瑰粉到落英淡粉，可溶性色素微黄到浅粉。在孢子层表面产生茶色小露珠，并放出清凉的冰片香味。
生理特性黑素反应，在葡萄糖酪氨酸琼脂，酵母膏酪氨酸琼脂和试验所用其它有机培养基上，黑素均为负反应。水解淀粉强烈。液化明胶明显。凝固并胨化牛奶。产生H2S明显，使悬挂于培养液上的醋酸铅纸条变黑。纤维素，生长。硝酸盐还原为亚硝酸盐。利用葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇;不利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、棉籽糖和蔗糖。利用肌醇可疑。
3、菌种选育把退化的5406菌株接入苜蓿根系进行复壮处理，30-60天取苜蓿根，用0.05-0.15%升汞水消毒3-7分钟，用灭菌蒸馏水洗苜蓿根2-4次，用无菌研钵磨成浆状稀释分离，分离培养基为高氏一号加1%苜蓿根煮汁。选择标准菌落长的丰满，中央突起的;菌落形状较大的;菌落色泽较红的;菌落生长快;菌落表面分泌露珠多的。根据这5个条件选择菌落做刺激性试验及拮抗性试验。
(1)用黄化黄瓜子叶叶绿素合成法测定经选择的菌株产生细胞分裂素活性。挑选大小均一的黄瓜种子(津研1号或2号)，用0.05-0.15%升汞水表面灭菌5-7分钟，无菌蒸馏水冲洗数次，置于垫有湿润滤纸的无菌平皿内，27-30℃下暗处发芽5-6天，在暗室绿光灯下，从每一个幼苗上切下子叶，切除全部下胚轴，选取大小均一的子叶，叶面朝上，放在事先已加好2.5ml无菌水及无菌滤纸的平皿中，每皿25片子叶，每片子叶上面贴一块培养好的单菌落块，27-30℃下暗处培养20-24小时，然后移至600-1000lux萤光灯下，距离10-30cm，光照2-4天。根据子叶的变绿及扩大程度，判断单菌落产生细胞分裂素活性大小。另设KT0.1、1、10ppm溶液做标准品，蒸馏水做对照。
(2)将初筛选出的细胞分裂素活性较高菌株转接“苜高”斜面，同时涂菌块进行复筛把事先制成的“苜高”平皿(每皿10-20ml苜高培养基)，用金属切刀分割成相互隔开的培养基块4块，每块上涂接一个初筛选出的菌株，27-30℃下倒置培养4-6天。用圆形金属打孔器，将长好的菌块打成数个园柱形菌块(直径4-6mm，高2.0-2.5mm)。用上述黄瓜黄化子叶法复筛细胞分裂素活性，每个菌株设3片子叶重复，暗培养20-24小时，见光培养2-4天。凡是处理后3片子叶均比出发菌株、菌块及KT纯品1ppm的处理明显绿且大的菌株，才属于挑选对象。
(3)将复筛反映较好的菌株，测定对深红酵母的拮抗性，取两环深红酵母的菌苔，放入8-10ml无菌水中，充分打散摇匀，制成均匀悬液。加到已溶化好、并凉至50-60℃的100ml测定培养基中，摇匀后倒入无菌平板内)，培养基铺平、冷凝。用(2)的方法制成的园形菌块，顺序贴放在测定平板上，每行7块，12行。每个菌株设3块重复，27-30℃下保温培养20-26小时，挑取复筛时刺激作用明显优于出发菌株，而且拮抗作用较出发菌株也大的菌株。
(4)将上述过程得到的菌株进行摇瓶发酵，用发酵滤液测定对黄化黄瓜子叶的作用，验证上述筛选结果。培养基装量为每250ml三角瓶装40-60ml，接种一满环菌苔，在200-240转/分摇床上，28℃±1℃培养72小时。用黄化黄瓜子叶叶绿素合成法测定其发酵液的细胞分裂素活性。按此法筛选出高产5406菌株。把选育优良菌株用砂土管保藏备用。
4、5406细胞分裂素混合粉剂生产(1)工艺流程附
图1为本发明的工艺流程图(2)培养条件A、斜面培养培养基为高氏一号，自然PH、27-32℃恒温培养箱培养4-6天，孢子粉红色，在3-5℃冰箱中保存20-40天。
B、一级种子罐培养培养基为淀粉(或玉米粉)1-3%、葡萄糖0.5-1.5%、黄豆饼粉(或花生饼粉或棉子饼粉或蚕蛹粉)1-3%、KH2PO40.04-0.05%、Nacl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.4-0.6%，CaCO30.3-0.5%、泡敌0.01-0.05%(或消沫油 0.2-0.4%)。
接种量1-2支茄形瓶斜面用无菌水制成孢子悬浮液，在无菌条件下接种在一级种罐内。
通风量0-12小时1∶0.5v/v，12小时以后1∶1v/v
罐压0.6-0.7公斤/cm2培养温度27-32℃搅拌速度270-290转/分移种标准镜检无杂菌，菌丝呈网状。
C、二级种子罐培养基成分同一级种子罐培养基成分。
接种量8-10%，从一级种子罐移种到二级种子罐。
通风量0-12小时，通风量1∶0.5v/v，12小时以后1∶1v/v。
罐压0.6-0.7kg/cm搅拌速度240-260转/分培养温度27-32℃移种标准镜检无杂菌，菌丝呈网状，密度均匀，分枝多而大，染色深。
D、发酵罐培养培养基成分为淀粉(或玉米粉)1-3%、葡萄糖(或饴糖或蔗糖)0.5-1.5%、黄豆饼粉(或花生饼粉或棉子饼粉或蚕蛹粉)2-3%、(NH4)2SO40.3-0.5%、NaCl 0.2-0.4%、KH2PO40.03-0.05%、CaCO30.3 0.5%、泡敌0.01-0.05%(或植物油 0.2-0.4%)、酵母粉 0.2-1% 玉米浆 0.2-1%接种量10%，种令24-30小时。
通风量0-12小时1∶0.5v/v，12小时以后1∶1v/v，搅拌速度150-180转/分，罐压0.5-0.7kg/cm2。
培养温度27-32℃镜检0-12小时菌丝呈团网状12小时以后菌丝发育成密封网状菌丝。40-60小时放罐。
(3)后处理发酵液加5-20%CaCO3经滚筒干燥机烘干，再加4-6%KCl，加5%微量元素(Zn2+、Cu2+)磨细分装。
(4)测定方法发酵液中细胞分裂素(CTK)测定发酵液用0.1NHCl酸化至PH2-3上摇床摇2小时，过滤，滤液用1NNaOH调节PH8.0，取20ml用水饱和正丁醇萃取1∶1v/v三次，把三次正丁醇萃取液浓缩至干，用1ml35%乙醇溶解其干燥物(或用1ml95%乙醇溶解，上高压液相色谱测定CTK含量)，样品(用250-500ml)电薄板，再用水饱和正丁醇、异丙醇、氨水、水(2∶8∶1∶1)，25℃展开，2-3小时结束吹干，将Rf值0.73-0.82的斑点刮下，用酪氨酸缓冲液(含有0.4%的酪氨酸的1/75克分子量的磷酸缓冲液)洗脱，用尾穗苋黄化子叶叶绿素合成法测定其洗脱液含量，具体方法如下精选已度过休眠期的尾穗苋种子，用0.1%升汞液消毒5分钟，冲洗后，摘于培养皿中的湿润滤纸上，在28℃黑暗中发芽76小时。在暗室微弱绿光灯下，选取子叶大小均一的黄化幼苗，剪取子叶和下胚轴的上半部，置于已放有2.5ml或3ml待测溶液的培养皿中，每皿30枚。在28℃暗室放置18小时。分别把幼苗切段，在重蒸馏水中洗涤，在滤纸上吸去多余水分，移入盛有4ml重蒸馏水的有塞试管中，放置低温冰箱(-15--20℃)冰冻过夜，移至25℃暗室中让其融化，2小时后，再放入低温冰箱冰冻。再融化，反复一次，苋红素即被浸提而出。在542nm和620nm处分别光密度，二者相减即为苋红浓度的光密度。同时查标准激动素座标，查出其含量，洗脱液细胞分裂素含量，再换算每立升发酵液含量。一般每立升发酵液中含CTK80-150l(测定过程中回收率40-50%)。
产品检验目前采用高压液相色谱仪测定将50克样品浸泡在200ml80%乙醇中，摇振荡2小时，过滤，50℃真空旋转浓缩至20ml，用水饱和正丁醇1∶1v/v萃取三次，三次萃取液合并，真空浓缩至干，用1-2ml95%乙醇溶解，上高压液相色谱，Waters 244 柱u-Bondapak pheny (0.4×30cm) 流动相22%CH3CN PH＝4流速1.0ml/mm，检测器UV254×0.1AUFS，标准品玉米素，异戊烯基腺嘌呤。 。
产品每500克中含CTK总量800-1000微克(回收率40-50%)苯乙酸测定方法发酵液2ml，加24N硫酸4滴，酸化之，加NaCl1.2克，加10%十五烷基溴代吡啶2滴，稍加振摇后，准确加入苯2ml，加塞振摇2-3分钟，离心后，取苯层上HPLC机，填＃3011胶的柱子(250×2.6mm)作固定相，以CH3OH∶H2O＝87∶13作为流动相，流速0.4ml/min。220nm检测。
产品检测苯乙酸含量5克粉剂浸泡在20ml80%乙醇中，振荡1小时，过滤，滤液真空浓缩2ml，加浓硫酸4滴，加NaCl1.2克，振荡之，准确加苯2ml，加塞振摇，取上层苯相上高压液相色谱仪测定。
以下是本发明的实施例1、菌种选育把退化的5406菌株接入苜蓿根系进行复壮处理，40天取苜蓿根，用0.1%升汞水消毒5分钟，用灭蒸馏水洗苜蓿根3次，用无菌研钵磨成浆状稀释分离，分离培养基为高氏一号加1%苜蓿根煮汁。选择标准菌落长的丰富，中央突起的;菌落形状较大的;菌落色泽较红的;菌落生长快;菌落表面分泌露珠多的。根据这5个条件选择菌落做刺激性试验及拮抗性试验。
(1)用黄化黄瓜子叶叶绿素合成法测定经选择的菌株产生细胞分裂素活性。挑选大小均一的黄瓜种子津研1号，用0.1%升汞水表面灭菌5分钟，无菌蒸馏水冲洗数次，置于垫有湿润滤纸的12cm无菌平皿内，28℃下暗处发芽6天，在暗室绿光灯下，从每一个幼苗上切下子叶，切除全部下胚轴，选取大小均一的子叶，叶面朝上，放在事先已加好2.5ml无菌水及无菌滤纸的9cm平皿中，每皿25片子叶，每片子叶上面贴一块培养好的单菌落块，28℃下暗处培养20小时，然后移至800lux萤光灯下距离20cm，光照3天。根据子叶的变绿及扩大程度，判断单菌落产生细胞分裂素活性大小。另设KT0.1、1、10ppm溶液做标准品，蒸馏水做对照。
(2)将初筛选出的细胞分裂素活性较高菌株转接“苜高”斜面，同时涂菌块进行复筛，把事先制成的“苜高”9cm平皿(每皿20ml苜高培养基)，用金属切刀分割成相互隔开的培养基块4块，每块上涂接一个初筛选出的菌株，28℃下倒置培养5天。用圆形金属打孔器，将长好的菌块打成数个园柱形菌块(直径5mm，高2.2mm)。用上述黄瓜黄化子叶法复筛细胞分裂素活性，每个菌株设3片子叶重复，暗培养24小时，见光培养3天。处理后3片子叶均比出发菌株菌块及KT纯品1ppm的处理明显绿且大的菌株，才属于挑选对象。
(3)将复筛反映较好的菌株，测定对深红酵母的拮抗性，取两环深红酵母的菌苔，放入9ml无菌水中，充分打散摇匀，制成均匀悬液，加到已溶化好、并凉至58℃的100ml测定培养基中，摇匀后倒入无菌平板内(20×30cm2)，培养基铺平、冷凝。用(2)的方法制成的园形菌块，顺序贴放在测定平板上，每行7块，12行。每个菌株设3块重复，28℃下保温培养24小时，取复筛时刺激作用明显优于出发菌株，而且拮抗作用较出发菌株也大的菌株。
(4)将上述过程得到的菌株进行摇瓶发酵，用发酵滤液测定对黄化黄瓜子叶的作用，验证上述筛选结果培养基装量为每250ml三角瓶装50ml，接种一满环菌苔，220转/分摇床上，28℃培养72小时。用黄化黄瓜子叶叶绿素合成法测定其发酵的细胞分裂素活性。接此法筛选出高产5406菌株。把选育优良菌株用砂土管保藏备用。
2、5406细胞分裂素混合粉剂生产(1)工艺流程见附图1
(2)培养条件A、斜面培养培养基为高氏一号，自然PH、28℃恒温培养箱培养4天，孢子粉红色，保存1个月4℃冰箱。
B、一级种子罐培养培养基为淀粉2%、葡萄糖1%、黄豆饼粉2%、KH2PO40.045%、Nacl 0.3% (NH4)2SO40.5%，CaCO30.4%、泡敌 0.02%。
接种量2支茄形瓶斜面用无菌水制成孢子悬浮液，在无菌条件下接种在一级种罐内。
通风量0-12小时1∶0.5v/v，12小时以后1∶1v/v罐压0.67公斤/cm2培养温度28℃搅拌速度180转/分移种标准镜检无杂菌，菌丝呈网状。
C、二级种子罐培养基成分同一级种子罐培养基成分。
接种量8%，从一级种子罐移种到二级种子罐。
通风量0-12小时，通风量1∶0.5v/v，12小时以后1∶1v/v。
罐压0.6kg/cm2搅拌速度250转/分培养温度28℃移种标准境检无杂菌，菌丝呈网状，程度均匀，分枝多而大，染色深。
D、发酵罐培养培养基成分为淀粉 2%、葡萄糖 1%、黄豆饼粉 2.5%、(NH4)2SO40.4%、Nacl 0.3%、KH2PO40.035%、CaCO30.4%、泡敌0.015%。酵母粉 0.2%、玉米粉0.2%。
接种量10%，种令24小时。
通风量0-12小时1∶0.5v/v，12小时以后1∶1v/v，搅拌速度180转/分，罐压0.6kg/cm2。
培养温度28℃镜检0-12小时菌丝呈团网状12小时以后菌丝发育成密网状菌丝。55小时后放罐。
本发明较已有技术具有明显的优点用本工艺所生产的细胞分裂素混合粉剂每500克含细胞分裂素0.8-1.0毫克，苯乙酸1.0-1.5毫克，B族维生素2.5克，以及大量氨基酸。具有明显增效作用。田间试验示范证明5406细胞分裂混合粉剂对多种作物都具有良好的增产效果。
1、粮食作用稻麦上通过浸种及穗期喷洒能增产10-20%，玉米通过浸种，每亩投资0.12元，可增产80-100斤。
2、蔬菜白菜、黄瓜、茄子、西红柿等喷3次，一般增产15-20%，每亩增收100-200元。
3、瓜果用于西瓜浸种并喷洒3-4次，一般增产15-20%，含糖量提高0.5-2.0度，并提前3-7天成熟。
每亩增收100-200元。在柑桔上喷洒2-3次，一般增产10-20%，每亩增收100-200元。对葡萄、桃、苹果、草莓也能提高座果率及含糖量。
4、经济作物在烟草上喷洒3次减轻花叶病50-83%，提高尼古丁含量，每亩增收70-100元，在人参上喷洒，一般增产10-20%，可减轻叶斑病提高人参皂甙12-33%，每亩增收2000-4000元，在茶叶上能增产10-15%，提高咖啡碱含量25.8%，茶多酚3.4%，品质提高一级。
5、对烟草花叶病毒病防治效果比较突出对烟草花叶病毒病防效50-83%，西红柿蕨叶病防效达51.2-61.5%，对青椒病毒病防效达50.7%以上，可使小麦黄矮病减轻。
5406细胞分裂素混合粉剂使用成本低，经济效益高。经卫生部门毒性试验LD50＞10g体重，属相对元毒，无致突变，致畸作用，使用安全。
权利要求
1.一种细胞分裂素混合粉剂的制造方法，包括选用泾阳链霉菌(Streptom-ycesjingyangensis)菌株，其特征在于该方法包括下列步骤(1)菌种复壮与选育；(2)将选育好的菌种在27-32℃下分别经试管斜面和茄形瓶斜面培养4-6天，移至一级种子罐，在27-32℃培养24-30小时；(3)将通过一级种子罐培养后的菌种转接于二级种子罐，在27-32℃下培养24-30小时；(4)将通过二级子罐培养的菌种转接于发酵罐培养，在27-32℃下培养40-60小时；(5)发酵液加5-20%CaCO3烘干，再加4-6%KCl，磨细分装。
2.根据权利要求1所述的菌种复壮与选育，其特征在于包括下列步骤(1)把退化的泾阳链霉菌(Streptomycesjingyangensis)菌株接入苜蓿根系复壮处理，30-60天，取苜蓿根，用0.05-0.15%升汞水消毒3-7分钟，用蒸馏水洗苜蓿根2-4次，用无菌研钵磨成浆状稀释分离，加1%苜蓿根煮汁于高氏一号培养基培养，选择菌落;(2)用黄化黄瓜子叶叶绿素合成法初筛经选择的菌落;(3)将初筛出的菌株转接在“苜高”斜面，同时涂菌块进行复筛，用黄化黄瓜子叶法测定菌株活性;(4)将复筛出的菌株，测定对深红酵母的拮抗性，取拮抗作用明显的菌株;(5)将上述过程得到的菌株进行摇瓶发酵，用发酵液测定对黄化黄瓜子叶的作用，验证上述筛选结果。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于一级种子罐的培养条件为培养基为淀粉(或玉米粉)1-3%葡萄糖0.5-1.5%黄豆饼粉(或花生饼粉或棉子饼粉或蚕蛹粉)1-3%KH2PO40.04-0.05% NaCl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.4-0.6% CaCO30.3-0.5%泡敌0.01-0.05%(或消沫油0.2-0.4%)接种量1-2支茄形瓶斜面用无菌水制成孢子悬浮液，在无菌条件下接种在一级种罐内;通风量0-12小时1∶0.5v/v，12小时以后1∶1v/v罐压0.6-0.7公斤/cm2搅拌速度270-290转/分
4.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于二级种子罐的培养条件为培养基配方同一级种子罐，接种量8-10%，通风量0-12小时1∶0.5v/v，12小时以后1∶1v/v。罐压0.6-0.7kg/cm2搅拌速度240-260转/分;
5.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于发酵罐的培养条件为培养基配方淀粉(或玉米粉)1-3%葡萄糖(或蔗糖或饴糖)0.5-1.5%黄豆饼粉(或花生饼粉或棉子饼粉或蚕蛹粉)2-3%KH2PO40.03-0.05% Nacl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.3-0.5% CaCO30.3-0.5%泡敌0.01-0.05%(或植物油0.2-0.4%)酵母粉0.2-1%玉米浆0.2-1%接种量10%通风量0-12小时1∶0.5v/v12小时后1∶1v/v搅拌速度150-180转/分罐压 0.5-0.7kg/cm2
6.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于采用尾穗苋苋红素合成法和高压液相色谱法测定发酵液及产品的细胞分裂素含量和用高压液相色谱法测定发酵液中苯乙酸的含量。
全文摘要
一种细胞分裂素混合粉剂的制造方法，该方法包括采用黄化黄瓜叶绿素合成法初筛及复筛泾阳链霉菌(Streptomyces jingyangsis n.sp Tao et al，1978)菌株和用筛后菌株工厂化生产细胞分裂素混合粉剂，用本发明制造出的产品富含细胞分裂素、苯乙酸、B族维生素及大量氨基酸。该粉剂价格低廉，试验证明对多种农作物具有明显的增产作用。
文档编号C12N1/00GK1046350SQ8910210
公开日1990年10月24日 申请日期1989年4月11日 优先权日1989年4月11日
发明者尹莘耘, 梁光云, 张震林, 张辛庚, 尹蔚庄, 丁凤葆, 林德炘, 蒋炳生 申请人:中国农业科学院植物保护研究所