专利名称：用南昌链霉菌发酵生产南昌霉素的方法
技术领域：
本发明涉及用微生物发酵方法生产抗生素的方法，特别是涉及用南昌链霉菌(Streptomycesnanchangesis.n.sp.)生产南昌霉素(Nanchangmycin)的方法。
本发明人于1984年报道了有关南昌链霉菌的情况，(请详见《微生物学报》24(3)195-199，1984)。该菌是从油茶根际土壤中分离得到的一株具有产生杀虫抗生素的链霉菌新种，它所产生的抗生素对蚜虫、经蜘蛛、菜青虫、松毛虫、扁刺蛾等农林害虫兼有胃毒和触杀作用，经进一步研究发现南昌霉素对鸡的球虫病具有显著的防治效果，且可做饲料添加剂。
南昌链霉菌的孢子呈丝钩状，2～4圈紧螺旋形，孢子近于球形，大多数培养基上气生菌丝体褐灰色，基内菌丝体褐色，产生暗黄色水溶色素。细胞壁化学组分Ⅰ型，DNA中G+C含量为71.2克分子%。
南昌链霉菌可产生酯溶性多组份杀虫抗生素，本发明主要涉及具有下列结构式的南昌霉素结构式(Ⅰ)
本发明的目的在于提供一种以南昌链霉菌为发酵菌株生产南昌霉素的工业发酵方法。
本发明的另一目的在于提供一种具有杀菌和杀虫功效的抗生素，南昌霉素。
本发明的方法工艺步骤简单，便于工业化实施，整个工艺对环境的污染小，所用有机溶剂可回收利用。
本发明主要涉及一种用南昌链霉发酵生产南昌霉素的方法，包括孢子培养，种子罐培养，发酵罐培养和分离提取步骤，其中，首先将在砂土管中保存的南昌链霉菌接种到高氏培养基或麸皮培养基上，放大培养10-20天，培养温度为25-35℃。再将得到的南昌链霉菌孢子接入内装本发明设计的种子培养基的种子罐中发酵培养，该罐带有搅拌装置，其发酵条件为发酵温度25-35℃，通气量1∶0.5-1∶1∶1.5V/V搅拌速度200-600rmp，发酵时间30-60小时。将经种子罐发酵培养过的培养物进一步接种至内装本发明设计的发酵培养基，并带搅拌装置的发酵罐中发酵培养，其发酵培养条件为接种量5-20%V/V，发酵温度25-35℃，通气量1∶0.5-1∶1.5V/V，搅拌速度200-600rmp，发酵时间90-140小时。
在发酵罐发酵过程中可以进行多次中间补料。这时发酵时间为120-230小时。所述的中间补料是以大于发酵罐培养基各组分浓度2-5倍量的培养基补充加入发酵罐;每次补料的数量为发酵罐中培养液容积的10%左右，所述的中间补料是在发酵液总糖消耗至发酵前的70-50%时加入，或者发酵液总糖消耗至前一次补料后总糖的70～50%时加入。
本发明也可以经一步发酵法完成整个发酵过程。
在发酵过程中，通常采用植物油，如豆油、花生油，菜油等或泡敌做为消泡剂。
将经上述发酵培养得到的发酵液压滤，如板框压滤，得到滤液和滤饼或滤渣。用醇如乙醇浸提所述的滤饼或滤渣，得浸提液。浓缩所述的浸提液，再用酯萃取浓缩后的浸提液，弃去水相得一油状物。用辅料，如碳酸钙(CaCO3)吸附所述的油状物后，烘干，磨粉，制得南昌霉素剂品。
另外，经过压滤后得到的滤液，再经浓缩处理，用酯萃取后，弃去水相，可得到与滤饼经醇提、浓缩、再用酯萃取后得到的油状物相同的油状物。
南昌霉素是一种拥有环醚系统的弱酸抗生素(pka′6.6)，其钠盐和酸的形式为无色结晶，其钠盐的形式很稳定，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷、丙酮和苯有机溶剂，微溶于石油醚、正已烷，不溶于水。南昌霉素的活性成分主要存在于菌丝体和培养液中，它们的分离方法可用有机溶媒来抽提，例如菌丝体用乙醇或丙酮浸提，发酵液用乙酸乙酯或乙酸丁酯提取。
本发明中所用的有机溶剂可以采用本领域中熟知的方法加以回收利用。
本发明上述涉及的孢子培养基为高氏培养基或麸皮琼脂培养基，其中后者的组分包括(%重量)麸皮 2-4% (NH4)2HPO40.01-0.05%硫酸镁0.01-0.02%磷酸二氢钾0.01-0.03%琼酯2%本发明在种子罐和发酵罐中采用的培养基主要含有1-10%的有机碳源，0.2-30%的氮源和0.001-0.05%矿物质(均为重量百分比)，其pH为6.0-8.0。所述的碳源为各种糖类，玉米粉，玉米淀粉，糊精等;所述氮源为各种有机氮如鱼粉、蚕蛹粉、黄豆粉，花生粉，蛋白胨和无机铵态氮，硝态氮等。所述的矿物质主要包括Fe、Mg、S、P、K、Zn、Mn、Cu。
本发明种子罐中优先采用的培养基为(%重量百分比)玉米粉2-5玉米淀粉0.5-3磷酸二氢钾0.1-0.3黄豆饼粉0.2-2氯化钠0.03-0.07硫酸铵0.1-0.3碳酸钙0.5-1.5豆油0.2-1本发明发酵罐中优先采用的培养基为玉米粉2-6硫酸铵0.1-0.5淀粉2-8硫酸二氢钾0.1-0.5糖(如蔗糖)0.2-1.5碳酸钙0.5-1.5酵母粉0.5-1.5淀粉酶淀粉用量的1/200-1/400豆油0.2-1下面将结合实施例和附图进一步说明本发明。
附
图1，为本发明的方法的流程图。
为了描述方便起见，现将本发明的方法过程分成两大部分，其一为发酵培养部分，其二为分离提取部分实施例1利用南昌链霉菌发酵培养生产含南昌霉素的发酵液。
取南昌链霉菌NMUA-1砂土管孢子接种在麸皮琼脂斜面培养基上，30℃培养15天，其所述培养基的配方(%重量)为麸皮3.2，(NH4)2HPO40.03，MgSO40.01，KH2PO40.02，琼脂2。选择灰褐色孢子生长丰满的斜面冰箱存在备用取灰褐色孢子NMVA-11支，用10ml无菌水注入斜面，洗下孢子，制成孢子悬液。用1ml的无菌吸管吸取0.2ml孢子悬液于250ml孢瓶平板上，并用灭菌玻璃刮铲，将孢子悬液涂布均匀。置于32℃恒温培养8天。培养结束后，选择呈灰褐色孢子，生长丰满，培养基底部呈金黄色色素的孢瓶共20瓶，冰箱保存备用。
在无菌室的净化工作台上将100ml无菌水注入250ml的孢瓶中，洗下孢子，制成孢子悬液。孢瓶口上塞上已灭菌的接种专用针头，在无菌操作条件下，该针头插入种子罐上的接种孔内的橡皮使之与罐内相连通，用减压法将所述的孢子悬浮液注入40升的种子罐内。接种完毕后打开搅拌装置开始种子培养。其接种量为20升种子液接种一孢瓶孢子悬液。
种子罐内培养时间为48小时，温度30±1℃，搅拌速度469转/分，通气量1∶0.8，罐内压力为0.4kg/cm2。其使用的培养基见表1。
采用灭菌的移种管，利用种子罐与发酵罐内的空气压差将48小时菌龄的培养物移种进入200升的发酵罐。接种量为15%V/V。其使用的培养基见表1。培养条件为温度32±1℃，通气量1∶1.4，搅拌速度300rmp。
自移种后开始取样，每隔12小时取样测定发酵液的总糖和还原糖，NH2-N、菌体DNA含量，溶磷量。
第一次补料时间是发酵液总糖下降至5.5g/100ml时，在培养时间的中间，约90小时左右，补料的容积为10升。
第二次补料是在发酵液的总糖消耗至3.7g/100ml。补料的容积为10升。
中间补料的浓度和具体数量详见表1和表2。
当涂片检查菌丝形成空泡，染色不均，粗菌丝自溶，生化测定总糖为2g/100ml左右，NH2-N浓度上升，菌体DNA含量开始下降，培养基pH上升时，放罐。
一般在上述发酵过程需200小时左右。最后放罐体积为120升放罐单位1514μ/ml，放罐总亿1.8168亿。
实施例2根据实施例1中所述的发酵步骤进行发酵培养，其中采用的种子罐和发酵罐培养基以及中间补料使用情况见表3，发酵罐内南昌链霉菌的生长情况见表4。
最后放罐体为120升，放罐单位为1552μ/ml，放罐总亿为1.8624亿。
实施例3根据实施例1中所述的发酵步骤进行发酵培养，其中采用的种子罐培养基，发酵罐培养基以及中间补料的使用情况详见表5，发酵罐内南昌链霉菌的生长情况见表6。
最后放罐体积为120升，放罐单位1537μ/ml，放罐总亿1.8444亿。
下述的实例主要涉及南昌霉素的分离和提取工艺。
实施例4发酵在200升罐中进行，放罐体积80升，发酵单位1138μg/ml，用5NNaOH调pH8.5-9后用小板框过滤，滤速10-11ml/分，并用压缩空气适当吹干，得滤饼11kg，滤液65升，滤液效价150μg/ml，占下罐总产量的11%，由于含量较低放弃处理，活性部分大部在菌丝体内，滤饼效价7200μg/ml，占下罐总产量的87%，用60升工业酒精分三次浸提菌丝体，得滤液67升，提取率占菌体含量的96%，60℃真空浓缩至5升，用乙酸乙酯13升分三次萃取，得萃取液12升，萃取率占菌体含量的95.4%，萃取液加活性碳脱色过滤，滤液60℃真空干燥、磨粉，得成品964g，成品每克效价76.8毫克，总含量74g，提取总收率占菌体含量的93.4%，占下罐总含量的81.3%，提取过程中各步骤的参数如表7所示实施例5按照实施例4的方法，取不同体积的发酵液重复上述步骤，以提取南昌霉素，详见表8。
实施例6按实施例4中所述的步骤处理55升发酵液，滤饼处理后得180g油状物，另外将得到的48升滤液薄膜浓缩，得3升浓缩液，用8升乙酸乙酯对该浓缩液进行三次萃取，进一步浓缩萃取液，得39.2g油状物。将所述油状物并入上述的滤饼所得的180g油状物，共为219.2g，再加CaCO32500g，吸附，得成品南昌霉素2718g。其具体情况见表9。
权利要求
1.一种用南昌链霉菌发酵生产南昌霉素的方法，包括孢子培养，种子罐培养，发酵罐培养，提取步骤，其特征在于(1)将在砂土管中保存的南昌链霉菌接种到高氏培养基或麸皮琼脂培养基上放大培养10～20天；(2)将步骤(1)中得到的南昌链霉菌孢子接种到内装本发明设计的种子培养基并带搅拌装置的种子罐中发酵培养，其发酵培养条件为温度∶25～35℃ 通气量∶1∶0.5～1∶1.5V/V搅拌速度∶200～600转/分培养时间36～60小时(3)将步骤(2)中得到的培养物进一步接种至内装本发明设计的培养基并带搅拌装置的发酵罐中发酵培养，其发酵增培养条件为接种量5～20%V/V 温度25～35℃通气量1∶0.5～1.5V/V搅拌速度200～600转/分发酵时间90～140小时可在发酵罐发酵时进行多次中间补料，此时的发酵时间为120～230小时；(4)将经步骤(3)得到的发酵液压滤，得滤液和滤饼；(5)用甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮或苯浸提所述的滤饼，得浸提液；(6)浓缩所述的浸提液，再用乙酸乙酯或乙酸丁酯萃取浓缩后的浸提液，得油状物；(7)用辅料吸收所述的油状物后，烘干，磨粉，制得南昌霉素剂品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的本发明设计的种子罐培养基的组分为1～10%的有机碳源，0.2～30%的氮源和0.001～0.05%矿物质，其pH为6.0～8.0。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的矿物质是Fe、Mg、S、P、K、Zn、Mn和Cu。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的种子罐培养基的组分包括(%重量)玉米粉 2～5 磷酸二氢钾 0.1～0.3玉米淀粉 0.5～3 氯化钠 0.03～0.07黄豆饼粉 0.2～2 碳酸钙 0.5～1.5硫酸铵 0.1～0.3 豆油 0.2～1磷酸铵 0.1～0.3
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的麸皮琼脂培养基的组分包括(%重量)麸皮 2～4(NH4)2HPO40.01～0.05MgSO40.01～0.02KH2PO40.01～0.03琼脂 2
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的发酵罐中采用的培养基的组分包括(%重量)玉米粉 2～6淀粉 2～8糖(如蔗糖) 0.2～1.5酵母粉 0.5～1.5硫酸铵 0.1～0.5磷酸二氢钾 0.1～0.5碳酸钙 0.5～1.5淀粉酶 淀粉用量的1/200～1/400豆油 0.2～1
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的中间补料是在发酵罐培养期间，以大于发酵罐培养基各组分浓度2～5倍量的培养基补充加入发酵罐。
8.如权利要求1或7所述的方法，其中所述的补料是在发酵液总糖消耗至发酵前的70～50%时加入的，或发酵液总糖消耗至前一次补料后总糖70～50%时加入的。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于可将经步骤(3)得到的压滤后的滤液浓缩处理，再用酯萃取后，去水相，得到与经步骤(6)得到的油状物相同的油状物。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的辅料是碳酸钙。
全文摘要
本发明涉及一种以南昌链霉菌为发酵菌株生产南昌霉素的工业发酵方法。该方法包括孢子培养，种子罐培养，发酵罐培养，分离提取等步骤。具有工艺步骤简单，便于工业化实施，整个工艺对环境的污染小，所用有机溶剂可回收利用的特点。制成的南昌霉素为一种具有杀菌和杀虫功效的抗生素。
文档编号C12N1/20GK1071700SQ9110973
公开日1993年5月5日 申请日期1991年10月18日 优先权日1991年10月18日
发明者欧阳谅, 涂国全, 高勇生 申请人:江西农业大学