生物合成丝氨酸及丝氨酸相关产物的材料和方法

专利名称：生物合成丝氨酸及丝氨酸相关产物的材料和方法
技术领域：
本发明涉及丝氨酸以其相关产物，特别是色氨酸的生物合成领域，以及涉及生物合成的方法和生物合成中采用的材料。
丝氨酸是大量细胞代谢物生物合成中的初级中间产物，这些细胞代谢物包括一些具有重要经济价值的化合物，如胆碱，甘氨酸，半胱氨酸和色氨酸。另外，丝氨酸作为唯一的碳源供体，并负责提供四氢叶酸生成5，10-亚甲四氢叶酸过程中对一碳单位60～75%的细胞总需求。这些一碳单位被用于大量生物合成途径中，包括合成蛋氨酸，肌苷，一磷酸盐，其它嘌呤类以及一些嘧啶类物质(例如，胸腺嘧啶脱氧核苷和羟甲基胞嘧啶核苷)。
如

图1所示丝氨酸的生物合成路线在许多组织和微生物中一般都适用。在这一合成路线中，确定的第一步是将3-磷酸D-甘油酸(PGA)转化成3-磷酸羟基丙酮酸(PGA)，这一转化是由3-酸甘油酸脱氢酶(PGD)的作用完成的。目前编码PGD的基因已经克隆并已定序，PGD亚单位的氨基酸序列也已从DNA序列中被推断出来，参见TobeyandGrant，J.Bio.Chem.261∶12179-12183(1980)在原核生物(特别是细菌)和如酵母类微生物中，野生型PGD的活性在细胞丝氨酸水平就可被抑制，但在高等的真核生物中并非如此。这种抑制作用已经用动力学方法加以研究过并报告存在异构效应。参见TobeyandGrant，J.Biol.Chem.，261∶12179-12183(1986);DubrowandPizer，J.Biol.Chem.252∶1527-1557(1977);MckitrickandPizer，J.Bacteriol.141∶235～245(1980)。
Tosa和Pizer在J.Bacteriol.106∶972～982的报告中研究过一种正常有毒的丝氨酸类似物，L-serinehydroxamate对大肠杆菌菌株的作用。在含那种类似物的生长培养基上适应性选择产生抵抗丝氨酸的诱变体。有些诱变体表明对于与PGD无关的酶，Seryl-tRNA合成酶具有一定的修饰作用。一株诱变体的粗提物显示出有降低丝氨酸敏感性的PGD活性(参见J.Bacteriol106∶972-982(1971);图5;表6;以及973页左侧最下部，977页左侧最下部分)。
本发明通常涉及编码3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGD)的DNA，这种酶同野生型PGD相比，对丝氨酸抑制作用有低敏感性，即，这种DNA编码PGD，该PGD在生物合成中至少具有一定程度的酶活性，并使这种活性比野生型PGD(未修饰的)保持更高的丝氨酸水平。
在优选的实施方案中，所述的野生型PGD是微生物，或酵母PGD。也可能更好地是工程DNA编码的PGD，该PGD在野生型PGDC-末端有25%的变化，最好是在C-末端的50个氨基酸内。例如，工程DNA可以编码含部分或全部C末端缺失的PGD。另外优选地是，工程DNA编码的PGD除了有上述的缺失之外，或者是另外的改变，但仍在C末端有一个插入片段(例如介于VAL363和ASN364之间插入片段或介于ALA392和GLN394之间插入片段)。
本发明还涉及a)具有上述工程DNA之氨基酸序列的PGD;b)含工程DNA的以及在宿主表达体系中，表达为工程DNA定向和定位的调节性DNA的表达载体;c)含这种表达载体的细胞;以及d)经培养这一细胞生产丝氨酸，或丝氨酸衍生物的方法。关于上述的c)，其所述的细胞最好是缺失了野生型serA的受体细胞。
另外，另一实施方案一般来说涉及一种工程化的细胞，(例如，它含有一个重组遗传结构)以产生一种在3′端有改变编码PGD的mRNA转录拷贝，所述的转录拷贝经细胞翻译而产生同野生型PGD相比，具有对丝氨酸抑制的低敏感性PGD产品。
本发明提供一种重要的生物合成控制点的解除控制过程。从而提高从那一点以后下端区生产大量化合物，特别是包括丝氨酸，丝氨酸衍生物，如色氨酸。其它的丝氨酸细胞代谢物(即，丝氨酸在它们生物合成中是初级中间物)包括胆碱甘氨酸，半脱氨酸和依赖C1一供体化合物，如蛋氨酸，肌苷，一磷酸盐，嘌呤类，和某些嘧啶类物质(如，胸腺嘧啶脱氧核苷和羟甲基胞嘧啶核苷)。
附图简要说明图1描述了用葡萄糖来生物合成L-丝氨酸的步骤。
图2是Tobey和Grant(前述的)报道的大肠杆菌serA基因的序列，以及从该基因中推断出的氨基酸序列。
图3描述了L-丝氨酸和四氢叶酸生物转化成甘氨酸以及N5-N10-亚甲四氢叶酸的过程。
以下将结附图详细描述本发明的优选实施方案制备丝氨酸不敏感的PGD1.遗传工程的构建物本发明的优选实施方案涉及丝氨酸和丝氨酸相关产物的生物合成，如，从丝氨酸生物合成衍生上述产物。按照本发明、生物合成这些化合物的第一步是提供下面讨论的丝氨酸不敏感的PGD。
已经确定在PGD中存在一个特殊的丝氨酸反馈中间区域(feedbackmediatingdomain)而这一区域的改变可以降低对丝氨酸的敏感性，同时还使PGD的活性保持在能使用的水平上。图2示出一特殊的PGD基因和氨基酸序列，这一序列可在下面讨论中用做参考对照。图2的序列包括410个氨基酸残基(包括从成熟蛋白上切割下来的起始蛋氨酸)。这一区域能降低丝氨酸敏感性，而不破坏PGD活性，并位于该蛋白分子C-末端前25%区段，最好是C-末端前50个氨基酸残基。
本发明的PGD修饰部分是C-末端42个氨基酸的部分或全部缺失，或者在降低丝氨酸敏感性又同时保持PGD功能的那个区域中插入一段其他片段替代这一区域。例如在缬氨酸363和天冬酰胺364之间插入一段氨基酸残基将会增加超过野生型PGD的Ki，同时保持PGD的活性。
C-末端氨基酸残基的部分或全部缺失会更急剧地增加Ki。例如，C-末端残基GTIRARLLY的缺失以及用ASLD来取代这一段，经过几种量值指令会增加Ki，并同时使PGD的活性保持在可使用的水平。在本发明领域内其它的插入片段通常介于丙氨酸392和谷氨酰胺394之间。
其他有用的修饰包括，除了上述讨论的插入片段和修饰片段之外还有C-末端的其他缺失。
通过遗传工程技术可以构建上述提及的编码丝氨酸不敏感的PGD基因，这种技术涉及改变编码C-末端氨基酸的编码区的3′末端，然后使用一个载体转化入受体菌来表达改变后的PGD酶。
用下述的方法对丝氨酸亲和性(Ki)和PGD活性来筛选出候选的改变后的酶。
2筛选遗传工程构建体在用上述的方法筛选遗传构建体中，采用了下面的测定分析PGD活性和丝氨酸敏感性的方法。
检测PGD活性虽然对于本发明并不是十分必要，但一般来讲有必要分析PGD的活性，其目的在于建立所述的改变过的酶对丝氨酸敏感性的程度。正如现有技术可知，酶的活性是酶分子总数与每个分子的催化活性的函数，因此，同PGD反馈变体的催化活性相比，必需采取步骤以适当地控制欲对比的相应催化活性样品PGD分子的相对数目。有许多方法可以完成这些步骤。然而，由于很难适当地建立起在用截去末端的serA基因转化后的细胞中基因表达水平(由于降低了的活性)，因此比较各种构建体以及野生型产生的PGD活性最适当的方式是在一个单一考贝中，染色体整合了含有标准调节部分改变后的serA基因，随后收获转化体，测定相对催化活性，以同野生型细胞进行比较。
可以采用任何能适合于测定PGD活性的方法。可以采用Mckitrick，JohnC.andLewisI.Pizer(1980)J.Bacteriol.141∶235-245的方法中正向或者反向反应的测定来检测PGD的活性。
上述酶分析可适用于对任何PGD酶的丝氨酸敏感性的测定，包括用化学修饰C-末端的那些PGD酶。在不同水平的丝氨酸存在下，可进行这种分析，将丝氨酸存在下的催化活性同无丝氨存在时的催化活性进行比较，并计算出Ki值。
大多数情况下，最好是降低丝氨酸的敏感性，而并不明显的改变PGD催化活性，在其他的实施方案中，可能最好是既能降低反馈敏感性又能降低催化活性。这可以采用表1中列出的具有3-磷酸甘油酸脱氢酶的一段C-末端氨基酸序列的构建体。
详见表1其它修饰过3′-端的构建体也是本发明的范围，因为按照本发明制备试验构建体和转化细胞以及测定的PGD活性的丝氨酸抑制作用是一件简单的事情。
任何导致表达缺乏对丝氨酸抑制的敏感性PGD蛋白载体都与本发明有关。一般在没有丝氨积累时，应该避免反馈自由的PGD高水平表达，因为对于细胞来说产生的大量丝氨酸或者丝氨酸代谢物可能具有细胞毒性。因此，总的来说，任何编码具有正常催化活性和与天然基因相同水平表达的反馈抑制PGD构建物，转化将可能导致高水平PGD表达并且降低了细胞自身活性。生成高水平丝氨酸的毒性，事实上，可以选择降低PGD表达的诱变体，因此当用多拷贝质粒转化可能在某些实施方案的早期筛选构建物中很有用处，同时，最好是在单一拷贝中将采用染色体的方式把serA构建体整合到基因组中。此外，上述的染色体整合便反馈缺失PGD的活性测量变得容易起来。因此，上述的染色体整合使反馈缺失PGD的活性测量变得容易起来。所以，在绝大多数希望获得很强催化活性的实施方案中，最好利用适合单拷贝染色体整合的载体。现有技术中已知有许多种这类载体和使用它们的策略，参见，如Backman，美国专利07/091，837，申请日为1987年9月1日，可以制备有用的载体和构建物，以在适当的受体中成功地进行转化和酶的表达，以生产所需的产品。进行这种工作的方法已为本领域技术人员所知，且对本发明并不重要。除了改变的编码PGDDNA之外，表达载体将包含的下各种其他组分。
首先，载体内的编码序列将伴随着适当调节序列，这类调节序列是进行适当水平表达所必需的，包括启动子，核糖体结合位点，以及终止序列，在大多数情况下，天然serA调节序列是分子催经活性部位的最好来源，但是已知不可以利用现有技术中熟知的或还需发现的许多其他的调节序列。
其次，最好的是，编码选择性标记的序列和/或通讯基因(Reportergenes)，同适当的调节组分一道重组在载体上。这种选择性标记的表达在鉴别转化株中非常有用。适当的选择标记基因包括那些编码氨苄青霉素，四环素和氯霉素的抗性基因。
再次，在质粒载体上的一种完整复制源的合乎要求性主要取决在染色体内和染色体外保持基因的合乎需要性。那些现有技术中熟知的方法可以适用于各种设计方案中，采用这种方案能开发出缺少一个完整复制源复合单位，从而促进整合进入染色体，参见，Backman等人，美国专利4，743，546号。
一旦构建成表达载体之后，用一含有编码丝氨酸不敏感的PGD蛋白的转录单元的载体转化适当的受体细胞。在大多数情况下，采用其内源PGD蛋白已知被丝氨酸所抑制的细胞，以及缺失其中内源性serA基因和用本发明改变的基因进行替代均非常有用。这种受体细胞系统被用于超量生产丝氨酸相关的代谢产物。已知含丝氨酶敏感蛋白的细胞是原核生物和酵母。
下列实施例说明本发明，但非限制。
实施例1构建编码反馈抗性3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA基因等位基因从一个Sau3A酶部分消化克隆到pTR264质粒的Bc1I位点中一段6.4KbDNA片段上分离出大肠杆菌K12serA基因。参见Backman等人，美国专利07/285，128，申请日1988年12月16日和Robertsetal.，Gene12∶123(1980)。这个质粒命名为pKB1302。一段3Kb含serA基因的pKB1302DNA经SalI至SphI酶切片段被克隆到质粒pUC19，从而获得pKB1321。经将3Kb经HindIII至SalI酶切含有serA基因的片断段克隆到pBR322制备出pKB1370。
将XbaI连接子(linker)在限制位点上插入serA基因的3′区获得编码反馈抗3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因。用HincII部分消化质粒pKB1321在1793处产生钝性末端，在那里插入连接子，从而产生a)pKB1459，它编码截短的3-磷酸甘油酸脱氢酶;b)pKB1507，它也编码一个截短的3-磷酸甘油酸脱氢酶;以及c)pKB1508，它编码一个4个氨基酸残基插入物的3-磷酸甘油酸脱氢酶。PstI酶消化pKB1321使得3′在1888位点处伸出。经过DNA聚合酶I的Klenow片段的作用而获得钝性末端。将连接子连接在钝端片段，衍生出的质粒是pKB1509，它编码带有2个氨基酸插入物的3-磷酸甘油酸脱氢酶，以及pKB1510，它编码截短了的3-磷酸甘油酸脱氢酶。用KpnI酶消化pKB1370，片段经在末端接上DNA聚合酶I的Kleuow片段后成为钝端(blunt)插入的连接子产生了一些质粒，如，编码截短的3-磷酸甘油酸脱氢酶，即pKB1455以及pKB1512，或者具有两个氨基酸残基插入物的3-磷酸甘油酸脱氢酶，即pKB1511。分别将pKB1508的0.8KbBamHI至XbaI片段，或者将pKB1509的0.9KbBamHI插入至XbaI片段或将pKB1511的5.8KbBamHI片段插入至XbaI片段内制成缺失质粒pKB1530和pKB1531。
下面的表2总结各种制得的构建物。
详见表2对于所有这些构建物，简要地说明起始载体，采用的限制性内切酶，以及插入的连接子的序列。丝氨酸Ki值以及染色体整合成的其中三个构建物的相关催化活性见表1。N/A是指该构建过程不是染色体整合，因此活性水平也无法标准化。
3化学修饰本领域普通技术人员将明白野生型PGD的C-末端之缺失或者修饰可以用酶或化学方式来完成，例如，采用各种羧肽酶包括羧基肽酶丫或者采用乳过氧化物酶介导的碘化作用来完成。
4反义mRNA的应用完全可能在活体内降低丝氨酸的敏感性，方法是通过产生编码PGD在3′端截短的转录体，该转录体是生产反义mRNA，它包括与天然或转化PGD编码序列3′编码区部分互补的核苷酸序列。
C目的化合物的生产如图3所示，丝氨酸是生产甘氨酸的中间体。它也是生产N5，N10-亚甲四氢叶酸的中间体，而后者通常被认为是一碳单位的(C1)供体，安对于蛋氨酸，嘌呤类(包括肌苷)以及某些嘧啶类的合成是必需的。因此，从磷酸甘油酸超量生产丝氨酸可在大范围的细菌生产体系中采用，这些体系包括胆碱、甘氨酸、半脱氨酸，蛋氨酸;色酸，以及所有含有一磷酸苷的嘌呤类生产体系。
以下的特例用于说明本发明。
实施例2受体菌株的制备用一个卡那霉素抗性基因替代一个针对来自质粒的serA基因内部分序列。然后，以下述的等位基因交换方法，将这一质粒用于灭活受体菌株的serA基因从用Sau3AI部分酶切从染色体DNA中克隆得到YMC9(ATCC33920)的serA区域，这一点是经与PCL523(argI61，argF58，serA27，purA54，thr-25，tonA49，relA1，spoT1)互补而筛选出。PC1523来源于大肠菌基因工程保藏中心(ColiGeneticStockCenter)，YaleUniversity，NewHaven，CT。一个携带所述的serA基因的3Kb片段被进一步亚克隆入质粒pUC19，形成称为pKB1321的质粒。从这个质粒再将一个3Kb的SalI至HindⅢ片段重新克隆到pBR322，形成pKB1370质粒。在serA基因的3′端KpnI位点被转化成带有一个联接子的BamHI片段上，得到的serA内部的BamHI片段用pUC-4-KSAC(Pharmacia)的BamHI片段替换，所述pUC-4-KSAC含有Tn903卡那霉素抗性基因。这一新构建的质粒被叫作pKB1429。被称之为pKB701(ATCC39772)的pBR322衍生物产生，参见USSN061757，019，其中位于复制系统侧面的MboI和TThⅢ1被转化成KpnI位点。来自pKB1429的SalI至EcoRI含有serAKanR重组片段被克隆到pKB701中，形成了pKB1438。用KpnI消化所述pKB1438以去掉ori区域。含有氨卡青霉素抗性编码区以及所述的serA∶KanR的大片段被环化并进一步在CaCl2条件下转化至受体菌转化后，受体YMC9细胞被放至含氨苄素霉素培养基上选择，在这种条件下，经过在serA基因侧区域内进行同源重组，环状DNA的整合就产生了氨苄青霉素抗性克隆体。在氨苄青霉素选择不存在时，氨苄青霉素抗性分离菌的生长经过同源重组serA基因区的重复序列将导致缺失氨苄青霉素抗性基因。按照制造商手册采用AmpScreen(BRL)培养基可通过失去β-乳酸酶活性来鉴别这种菌株。在含和不含丝氨酸培养基上，个别菌落的双重条斑(duplicate streaking)呈现氨苄青霉素敏感克隆，这种克隆在最低培养基上生长时需要丝氨酸，而且也对卡那素有抗性，有一株这种分离菌被称做KB875。
实施例3通过等位基因交换对改变的serA序列的染色体整合通过同实施例2中描述的导入serA∶∶KanR所采用的相类似的方法，将serA1455等位基因导入染色体，简言之，携带所述的serA1455等位基因的片段(SalI至HindⅢ)被克隆进入pKB701。用KpnI消化除去质粒自身的序列。采用环化的DNA转化成氨苄青霉素抗性，从而产生一个指定的菌株。在非选择性培养基生长之后，采用Ampscreen培养基和卡那霉素平板影印培养法，分离出KB904(serA1455)并可见其对氨苄和卡那霉素敏感。按Miller报道的P1转导方法(Miller(1972)ExperimentsInMol.GeneticsColdSpringHarborPress，PP.201～205)可将得到的serA1544等位基因转入生产菌株。
实施例4通过recD依赖基因替换对修饰过的serA序列进行染色体整合另一种方法被用于将serA1508等位基因转移到染色体上。从V220通过P1转导方法可使KB875成为菌株recD。(recD，argA∶Tn10.Amundsenetal.，(1986)Proc.Acad.Sci.，U.S.A.825558-5562)(DSM6823)核酸外切酶V。基本的第三亚单位的基因生产出JGP101。质粒pKB1508成为线状，并且用于将JGP101转化成丝氨酸光色互变，正如Shevell等人报道(Shevelletal.，(1988)J.Bacteriol.1703294-3296，)从而产生JGP103。然后经过P1转导(Milleretal.，ExperimentsinMol.GeneticscoldSpring.HarborLab.，PP.201～205(1972)将serA1508等位基因移入生产菌株。
收获过量生产的代谢物为了过量生产与丝氨酸相关的代谢产物，可以制备能生产PGD并具有低丝氨酸敏感性的细胞，在适当的条件下，在发酵罐中培养，在大多数情况下一直生长至静止(稳定)期。然后，收集细胞，并融胞，按标准生化程序制得所需的代谢物。至于微生物生长的条件和原理以及标准菌株，和收集特殊的代谢产物可参见Crueger和Crueger的报道(Biotechnology∶AtextbookofIndustrialMicrobiology)以及Herrmann和Somerville的报道(1983AminoAcid∶BiosynthesisandGeneticRegulation)。
权利要求
1.编码3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGD)的工程DNA，它同野生型PGD相比，具有对丝氨酸抑制的低敏感性。
2.如权利要求1所述的工程DNA，其中野生型PGD是微生物的或酵母PGD。
3.如权利要求1所述的工程DNA，其中所述的DNA编码含有在野生型PGD的C-末端有25%的变化的PGD。
4.如权利要求3所述的工程DNA，其中所述的DNA编码含有在野生型PGD的C-末端50个氨基酸的改变的PGD。
5.如权利要求3所述的工程DNA，其中所述的DNA编码含有在野生型PGD的C-末端缺失的PGD。
6.如权利要求3所述的工程DNA，其中所述的C-末端改变包括对野生型PGD序列中的插入。
7.如权利要求6所述的工程DNA，其中所述的插入是位于野生型PGD的VAL363和ASN264之间，或是ALA392和GLN394之间。
8.如权利要求1所述的工程DNA，它选自a)serA 1455 f)serA 1510b)serA 1459 g)serA 1511c)serA 1507 h)serA 1512d)serA 1508 i)serA 1530e)serA 1509 j)serA 1531
9.一种3-磷酸甘油酸脱氢酶，它具有由权利要求1至8之一中所述的工程DNA编码的氨基酸序列。
10.一种表达载体，它包含有权利要求1至8之一中所述的工程DNA，以及在受体菌成细胞表达体系中为表达所述工程DNA定位和定向的调节性DNA。
11.一种细胞，它含有如权利要求1至8之一中所述的工程DNA，以及在所述的细胞内表达所述工程DNA的定位和定向的调节性DNA。
12.如权利要求11中所述的细胞，其中所述的细胞是野生型serA的缺失型。
13.一种生产丝氨酸或丝氨酸相关衍生物的目的产物的方法，包括培养如权利要求1所述的细胞，回收所述的目的产物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的产物是丝氨酸。
15.一种产生具有一改变过的3′端的编码PGD的转录体的工程细胞，所述细胞将所述的转录体翻译成与野生型PGD相比具有对丝氨酸抑制的低敏感性的PGD。
全文摘要
一种同野生型相比具有对丝氨酸抑制低敏感性的编码3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGD)的DNA。本发明还涉及a)具有上述工程DNA氨基酸序列的PGD；b)含工程DNA和在一宿主表达体系内表达工程DNA的定位定向的调节性DNA的表达载体；c)含这种表达载体的细胞，和d)经培养这种细胞生产丝氨酸和其相关产物的方法。
文档编号C12N15/09GK1073209SQ9211201
公开日1993年6月16日 申请日期1992年10月10日 优先权日1991年12月12日
发明者理查德P·布林根 申请人:瓦克化学有限公司