专利名称：磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法。
背景技术：
磷脂酶D，即磷脂酰胆碱磷脂水解酶(EC3丄4.4),属于催化磷酸二脂酯 键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，其主要生理功能是参与细胞脂质代 谢、信号转导及生物膜形成等。
磷脂酰丝氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase, PSS)是磷脂酶D家族 成员之一，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，目前在细菌、酵母和哺乳动 物细胞中均有发现。其中，源自大肠杆菌的磷脂酰丝氨酸合成酶具有该家族 明显的序列特征，即含有两个间隔出现的H(x)K(x)4D保守序列，它能够催 化合成大肠杆菌自身所需的大部分磷脂类物质，而不同于其它革兰氏阴性菌 的磷脂类物质合成酶，并不紧密连接于细胞膜结构。对其进一步定位研究发 现，该酶是一种外膜蛋白，主要通过脂类底物和弱酸性磷脂物质的电子传递 链与膜表面互相作用。
但是磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)在大肠杆菌中含量低(不到蛋白总含量的 0.1%)，不利于直接工业化发酵生产；而枯草芽孢杆菌表达系统是一种较为理 想的异源蛋白表达系统，可以高效地表达具有生物活性的异源蛋白并将其分 泌到培养基中，且具有较高的生物安全性。本发明采用枯草芽孢杆菌系统表 达磷脂酰丝氨酸合成酶基因，解决了出发菌株磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)表 达量低的问题，发酵后粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓縮、离子交 换层析、凝胶层析等步骤可获得高纯度的磷脂酰丝氨酸合成酶，具有制备工 艺简单、酶活力高等优点，适合工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备工艺简单，适合 工业化生产且制备获得的合成酶酶活力高的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方 法。
本发明是通过以下技术方案来实现的 一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，包括以下步骤 (l).制备粗发酵液
将工程菌接种至LB液体培养基中，36 38t:振荡培养10~14h，培养后产 物按3~7%的接种量转接至相同培养基中继续培养2 3h，然后加入10~20%的蔗糖水溶液，诱导26 30h，诱导后产物在3 5。C、 8000 r/min的条件下离 心15 25min，收集上清，制得粗发酵液；
(2) .盐析
粗发酵液在3 5。C、 8000 r/min的条件下离心15 25min，收集上清，加 入硫酸铵至75%饱和度，3 5""C静置1(M4h后，在3 5。C、 8000r/min的条件 下离心15 25min，倾去上清，沉淀溶于pH7.0、 10mM的Tris-HCl缓冲液中；
(3) .脱盐
将第(2)步的产物采用截流分子量为10kDa 20kDa的中空纤维膜进行超 滤浓縮；
(4) . SP-Sepharose HP离子交换层析
采用pH7.0、 lOmM的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，将脱盐后的活性组 分用同样的缓冲液溶解，8000r/min离心15 25min，取上清，上样1 3mL后 先用该缓冲液洗脱未吸附的蛋白，再用含0 lmol/L NaCl的该缓冲液进行梯 度洗脱，收集活性组分；
(5) . Sephadex G-75凝胶层析
离子交换层析得到的活性组分，先用含1.0 % NaCl的Tris-HCl缓冲液溶 解，8000r/min离心15 25min，取上清，上样1 3mL后用相同缓冲液进行洗 脱，收集的活性组分即为磷脂酰丝氨酸合成酶。
而且，所述的工程菌是保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏 编号为CGMCC 1.1395的枯草芽孢杆菌。
而且，所述的步骤(l)中的LB培养基含有浓度为30|_ig/mL的卡那霉素。
而且，所述的步骤(1)中的蔗糖水溶液的浓度为20%。
而且，所述的步骤(4)或(5)中的洗脱条件均为洗脱速度0.5mL/min，每 管收集2mL。
本发明的有益效果和优点
1. 本发明对来源于大肠杆菌K,2的磷脂酰丝氨酸合成酶基因(p^)进行克 隆，与表达型质粒pBES连接构建重组质粒，并在枯草芽孢杆菌DB104中进行 活性表达，提高了磷脂酰丝氨酸合成酶的表达量，改变了出发菌株中该酶含 量低的现状(不到蛋白总含量的0.1%)。
2. 本发明将工程菌发酵离心后粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓 縮、SP-SepharoseHP离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析等步骤纯化获得 磷脂酰丝氨酸合成酶，由该方法制得的磷脂酰丝氨酸合成酶酶活力高、制备 工艺简单，适合工业化生产。
图1为本发明磷脂酰丝氨酸合成酶基因的PCR扩增电泳图；图2为本发明重组表达载体pBES-;ws的构建示意图3为本发明重组表达载体pBES-戸s的酶切验证图4为本发明重组表达载体pBES-; ^的PCR验证图5为本发明磷脂酰丝氨酸合成酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是 限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，包括磷脂酰丝氨酸合成酶工程菌 的构建及其酶的表达、重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化两部分内容，下 面分别予以叙述
一.磷脂酰丝氨酸合成酶工程菌的构建及其酶的表达
采用的工程菌是保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)， 保藏编号为CGMCC 1.1395的枯草芽孢杆菌，其构建方法是
1. 大肠杆菌Esc/ m'c/H'a co// K12染色体DNA的提取
(1) .挑取大肠杆菌co// K,2的单菌落接种到5mL LB培养基 中，于37°C、 180r/min培养12h。
(2) .取lmL培养液于1.5mLEP管中，12000r/min离心IO分钟，倒尽上 清，将细菌沉淀重悬于200jiL冰预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡。
(3) .加入50pL浓度为50mg/mL的溶菌酶，4'C下消化lh。
(4) .加入150pL浓度为2%的SDS溶液，反应10min至菌悬液呈现粘稠状。
(5) .加入400jiL饱和苯酚:氯仿(l:l)，混合均匀，12000r/min离心10min， 将上清转移到另一干净EP管中，弃去下层有机相及蛋白沉淀，重复l次。
(6) .加入400pL氯仿，混合均匀，12000r/min离心10min，将上清转移 到另一干净EP管中，去除痕量苯酚。
(7) .加入800^L的无水乙醇沉淀DNA， 12000r/min离心10min，弃去上 清，50(VL70。/o乙醇洗涤2次。
(8) .将EP管倒置于滤纸上，晾干后用TE缓冲液溶解，-20°0保存备用。
2. 引物设计及PCR扩增磷脂酰丝氨酸合成酶基因 (l).PCR扩增目的基因参照数据库ExPASy上报道的磷脂酰丝氨酸合成
酶基因(^s)序列(序列号P23830)设计引物，引物由上海英俊公司合成。 上游引物P1:
5'-AACTGCAGAATTGTCAAATTTAAGCGTAATAAAC-3'(下划线部分为 加入的PW I酶切位点) 下游引物P2:5'-CCCMSQHTTAC AGGATGCGGCTAATTAAT-3'(下划线部分为加入 的历'"dIII酶切位点)
以提取的大肠杆菌染色体DNA(10ng)为模板，PCR扩增条件为94°C， 预变性5min; 94。C变性lmin， 5(TC退火lmin40s, 72。C延伸lmin，反应30 个循环；最后72'C，延伸10min。 PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳(如 图l)，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化。
(2) .大肠-枯草杆菌穿梭质粒pBES的提取
① .取一环保存有pBES质粒的^^7/^ 斜面接种，划线分离于 LB固体培养基(含30pg/mLKan)平板上，37。C倒置培养12h。
② .挑取单菌落，接入到5mL含Kan的LB液体培养基中，于37°C、 180r/min培养12h。
③ .将1.5mL菌液转入干净的微量离心管中，12000r/m离心30s收集菌 体，弃上清。
④ .将沉淀重悬于IO(VL预冷的碱裂解液I中，混合均匀后添加10pL 50mg/mL的溶菌酶，37"C保温30min。
⑤ .加入200pL碱裂解液II，盖紧管口，轻轻摇匀，确保离心管的整个 内表面菌与碱裂解液II接触，将离心管放置冰上2min至液体清亮。
⑥ .加入150pL预冷的碱裂解液III，温和转动离心管，使碱裂解液III 在粘稠的细菌裂解液中混合均匀，冰浴5min。
⑦ .12000r/min离心5min，将上清转移到另一管中，力B 400|iL的Tris 饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:l)混合溶液，混合均匀后，12000r/min离心5min， 将上清转移到另一离心管中。
⑧ .加入80(HiL的无水乙醇，混合均匀后，-20匸放置30min， 12000r/min 离心5min收集沉淀。
⑨ .加入lmL70。/。乙醇，洗涤沉淀2次，弃去残液，空气中干燥20min， 用20^L灭菌的去离子水溶解沉淀。
(3) .重组载体pBES-p^构建将PCR产物和提取的质粒pBES分别用 尸^1和///"(1111进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用Solution I于16°C 连接过夜得到重组质粒pBES-p^，质粒构建如图2。
3.重组载体的转化及在宿主细菌中的表达
(l).重组载体的转化及鉴定枯草芽孢杆菌转化在参照Spizizen方法的 基础上进行了改进。取枯草芽孢杆菌DB104划LA平板，37'C培养箱培养 12h。挑单菌落至3mLSPI培养基中，37'C、250r/min培养12h。次日取100pL 培养液转接至5mL SPI培养基，37°C 、 250 r/min培养至对数生长末期(OD600 约为0.9)，取0.2mL培养液至2mLSPII培养基中，37°C、 150r/min培养90min。分装成0.5mL每管，各加入20pL重组质粒，再于37。C、 100r/min震 荡培养30 min，然后250r/min培养90min， 离心去处上清液，保留IOOjjL 上清液与菌液混合均匀后涂布筛选平板。
利用Spizizen法将重组质粒转入枯草芽孢杆菌DB104中，通过卡那霉 素抗性平板筛选转化子，酶切和PCR验证结果如图3与图4所示，表明重 组质粒上已经正确连接有目的基因。
(2) .重组菌的诱导表达——磷脂酰丝氨酸合成酶粗发酵液的制备接种重 组枯草杆菌DB104/pBES-; M和对照菌DB104/pBES于5 mL含30ng/mL卡那 霉素的LB培养基中，37"C振荡培养12h。按5%的接种量转接过夜培养物于 30 mL含30pg/mL卡那霉素的LB培养基中，振荡培养2 h后加入20%蔗糖 溶液至终浓度为2%，诱导24 h。发酵液离心后，各取重组菌和对照菌上清 10pL，分别与10pL上样缓冲液混合，沸水浴10min，离心取上清进行 SDS-PAGE(12。/。分离胶，5%浓縮胶)电泳，检测蛋白表达情况如图5，发酵液 上清可直接用于酶活力测定。
(3) .酶活检测采用酶联比色法进行活性检测。
磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)催化水解L-a-卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧 化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比 林和苯酚生成醌亚胺显色物质，在A-500nm下具有吸光值。
反应体系将220mg的L-a-卵磷脂溶于含有3mL 50mM的SDS溶液、6 mLlMNaOAc缓冲液(pH=8.0)、 39 mL的去离子水、0.272 mL 17.9%的乙醇 溶液(终浓为1%)的混合体系作为底物溶解液。将39mg4-氨基氨替比林、 80mg苯酚及8mg过氧化物酶溶于溶于5.5 mL的1 OOmM Tris HC1 (pH:8)缓 冲液中作为胆碱显色剂。取2.4mL底物溶液、0.3 mL的500mM CaCl2溶液、 0.2mL的去离子水混合并置于35'C水浴。然后加入0.1 mL的酶液，混合均匀， 于35'C反应10min，沸水浴终止反应，待冷却至室温加入0.05mL2MTris HCl(pH-9)缓冲液，混合并离心后，上清用0.45pm微孔滤膜过滤，取滤液2 mL与O.lmL胆碱显色剂、O.lmL胆碱氧化酶溶液室温反应2.5h。在反应混合 物中加入2.0mL去离子水，离心得到澄清透亮的粉红色溶液，最后于A500nm 检测吸光值。
酶活定义pH=8.0、T=35°C^t，磷脂酰丝氨酸合成酶lh内催化水解L-a-卵磷脂释放1.(^mol的胆碱所需要的酶量。 二.重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化 1.制备粗发酵液
将工程菌接种至LB液体培养基中，37"C振荡培养12h，培养后产物按 5%的接种量转接至相同培养基中继续培养2h，然后加入10%的蔗糖水溶液，
7诱导28h，诱导后产物在4。C、 8000 r/min的条件下离心20min，收集上清， 制得粗发酵液。
2. 盐析
取28h发酵液，在4""C、 8000r/min的条件下离心20min，收集上清，加 入硫酸铵至75%饱和度，4"C静置12h后，在4。C、 8000 r/min的条件下离心20 min，倾去上清，沉淀溶于pH7.0、 lOmM的Tris-HCl缓冲液中。
3. 脱盐
将盐析沉淀溶解于pH 7.0、 lOmM的Tris-HCl缓冲液后，用截流分子量为 10kDa 20kDa的中空纤维膜超滤，对样品进行脱盐浓縮，除盐效果用BaCl2 溶液检测，以滤出液滴入BaCl2溶液中无沉淀析出为终点。
4. SP-Sepharose HP (2.4cmx30cm)离子交换层析
采用pH7.0、 lOmM的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，将脱盐后的活性组 分用同样的缓冲液溶解，8000 r/min离心20min，取上清，上样2mL后先用 该缓冲液洗脱未吸附的蛋白，再用含O.lmol/L NaCl的该缓冲液进行梯度洗 脱，收集活性组分。
5. SephadexG-75(1.6cmx80cm)凝胶层析
离子交换层析得到的活性组分，先用含1.0y。NaC110mM的Tris-HCl缓冲 液溶解，8000 r/min离心20min，上样2mL后用相同的缓冲液以0.5mL/min 的速度洗脱，每管收集2.0mL，收集活性组分，即为磷脂酰丝氨酸合成酶。SEQUENCE LISTING
〈110〉天津科技大学
<120>可高效异源表达磷脂酰丝氨酸合成酶的工程菌的构建方法
〈130〉 20080703
〈160〉 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
〈211> 1356
<212> DNA
〈213〉磷脂酰丝氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase, PSS)的DNA序列
〈400> 1
atgttgtcaa33ttt犯gCgtaataaacatcaacaacaccttgcccaactacccaagatt60
tctcaatcagttgatgatgtcgatttcttttacgctcccgccgacttccggg卿cgctg120
tagccagcgcga^gcsgcgcatttgcattgtcgccctgtatctcgaacag180
gatgacggtggC3犯ggC3ttctgaacgcgUgtatgaggCt犯犯ggC3ggacgatccg240
g認tggstgtgcgggtgctggtcg已ctggcatcgtgcac咖gtggacgcattggcgct300
gcggcatcta3C8Ct33CgCtgactggtactgccgcatggcgcaggaaaatccgggcgta360
gatgttccggtttatggcgttccaatc犯tactcgtgaagcccttggtgttctgcacttt420
aaaggctttatcatcgacgatagcgtactttatagcggtgccagcctgaacgatgtttac480
ctgcatcagctcgctacgaccgttatcatctgatccgtaaccgtaagatg540
tcagacattatgtttgaatgggttacacagatggccgcggcgttaatcgt600
ctggatgatgtt犯tcggcc3aaaagcccggaaatcaagaacgatattcgtctgttccgc660
c鄉agctgcgtgatgccgcttatca/tttcc鄉gcgatgCCg3C犯Cg6Ltcagctttct720
gtaacgccgctagtggggctgggg^stcgagtctgttgatttccatctt780
stgccttgtgccgagcagaei3Ct犯CC3tCtgtacgccatacttcaacctgccagcaatc840
cttgtgcgcaatattatccagttgctgcgcgaaggg犯犯tattgttggt900
gataaaaccgcgaatgacttctacattccgg犯g8tgaacctttcaagataattggcgca960
ttgccttatctctatgagatcaatttgcgtcgtttcctgagccgtttgcagtattacgtc1020
aatactgaccagctagtggttcggttatgga^gatgacgacaacacctatc3cctg33a1080
gggatgtggggtggatgttgatcaccggtacccgcgcgcc1140
tggcgtctgga<tCtgg￡L3￡L8cgccattttgatccacgatccgcaacttgagctggcgcca1200
C3gCg3g卿aag犯ctggagctgatccgcccatcgttaagcactatcgc1260
gatctgcaaagtattgccgattatccggtgaaggttcgtaaactcatccgccgttcgcgc1320cgtatccgca tcgaccgatt aattagccgc atcctg 1356
〈210〉 2 〈211〉 451 <212> PRT
〈213>磷脂酰丝氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase, PSS)的氨基酸序列 〈400〉 2
Met Leu Ser Lys Phe Lys Arg Asn Lys His Gin Gin His Leu Ala Gin
1
Leu Pro
Pro Ala
Gin Arg 50
Lys Gly 65
Leu Asp
lie Gly
Ala Gin
Asn Thr 130 Asp Asp 145
His Gin
Arg Lys
Asn Gly
Pro Glu 210
Lys
Asp
35
lie
lie 20 Phe
5
Ser
Gin Ser Val
Arg Glu Thr Cys lie Val
lie Leu Asn
Val Arg
Ala
Glu 115 Arg
Ala 100 Asn
Val
85
Ala
Ala
70
Leu
Ala 55 Leu
Val
Leu
40
Leu
Tyr
Asp
Ser Asn Thr
Pro Gly Val
Glu Ala Leu
Ser Val Leu
His Asp
Met
Arg 195 lie
Ser 180 Gly
Lys 165 Asp
Tyr 150 Tyr
Gly 135 Ser
Asp 120 Val
Asp
25
Leu
Tyr
Glu
Trp
Asn 105 Val
10 Asp
Glu
Leu
Ala
His
90
Ala
Val
Lys
Glu
Lys
75
Arg
Asp Phe
lie
Gin
60
Arg
Ala
45
Asp
Gin
Ala Gin
Pro Val
Asp Trp Tyr Tyr
Leu His Phe
Gly Arg Tyr Asp lie Met Phe
Ala Ser
Val Asn Arg
Lys Asn Asp lie 215
Leu 200 Arg
Glu 185 Asp
Leu
Arg 170 Trp
Asp
Phe
Leu 155 Tyr
Lys 140 Asn
His
Gly 125 Gly
Asp
Leu
Val Thr Gin
Val Asn
Arg
Gin 220
Arg 205 Glu
Phe
30
Ser
Asp
Arg
Arg
Cys 110 Val
15 Tyr
Ala
Gly
Pro
Gly
95
Arg
Pro
Phe lie
Val Tyr
lie Arg 175 Asn lie 190 Pro
Leu
Lys Arg
Ala
Lys
Gly
Glu
80
Arg
Met
lie
lie
Leu 160 Asn
Met
Ser
AspAla Ala Tyr His 225
Thr Pro Leu Val
Phe
Gly 245 Pro
Gin Gly 230
Leu Gly
Asp Lys
Cys Ala Glu
Leu Asn Lys
Leu 280 lie
Glu
Phe His Leu Met 260
Tyr Phe Asn Leu Pro Ala lie 275
Arg Glu Gly Lys Lys Val Glu 290 295 Asp Phe Tyr lie Pro Glu Asp 305 310 Pro Tyr Leu Tyr Glu lie Asn Leu 325
Tyr Tyr Val Asn Thr Asp Gin Leu 340
Asp Asn Thr Tyr His Leu Lys 355
Leu lie Thr Gly Asn Asn 370
Glu Asn Ala lie 385
Arg Glu Lys Glu
Ala Asp Asn Asp Gin Leu 235
Ser Ser Leu
250 Gin Lys Leu 265
Val Arg Asn
Thr
lie
Asn lie
Ser Val 240 Thr lie 255
Thr Pro
Cys 270
Gin Leu Leu
lie Val Gly Asp 300 lie
lie 285
Lys Thr Ala Asn
lie
Pro Phe Lys 315
Arg Arg Phe Leu Ser 330
Val Val Arg Leu Trp 345
Met Trp Val
Leu
Leu 405 Leu
lie 390 Glu
Leu 375 His
Leu
Gly 360
Asn Pro Arg Ala
Asp
Asp 365 Arg
Gly
Arg
Lys 350 Lys
Leu
Ala Leu 320 Leu Gin 335
Asp Asp Trp Met Asp Leu
Asp lie
His Tyr Arg Asp Leu Gin Ser lie 420
Lys Leu lie Arg Arg Leu Arg Arg 435 440 Arg lie Leu 450
Pro Gin Leu 395
Arg Glu His
410 Ala Asp Tyr 425
lie Arg lie
Trp 380
Glu Leu Ala Pro Gin 400
Thr Thr lie Val Lys 415
Pro Val Lys Val 'Arg
Asp
Arg 445
Lys 430 Leu
lie Ser
权利要求
1、一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1).制备粗发酵液将工程菌接种至LB液体培养基中，36～38℃振荡培养10～14h，培养后产物按3～7％的接种量转接至相同培养基中继续培养2～3h，然后加入10～20％的蔗糖水溶液，诱导26～30h，诱导后产物在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，收集上清，制得粗发酵液；(2).盐析粗发酵液在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，收集上清，加入硫酸铵至75％饱和度，3～5℃静置10～14h后，在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，倾去上清，沉淀溶于pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液中；(3).脱盐将第(2)步的产物采用截流分子量为10kDa～20kDa的中空纤维膜进行超滤浓缩；(4).SP-Sepharose HP离子交换层析采用pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，将脱盐后的活性组分用同样的缓冲液溶解，8000r/min离心15～25min，取上清，上样1～3mL后先用该缓冲液洗脱未吸附的蛋白，再用含0～1mol/L NaCl的该缓冲液进行梯度洗脱，收集活性组分；(5).Sephadex G-75凝胶层析离子交换层析得到的活性组分，先用含1.0％NaCl的Tris-HCl缓冲液溶解，8000r/min离心15～25min，取上清，上样1～3mL后用相同缓冲液进行洗脱，收集的活性组分即为磷脂酰丝氨酸合成酶。
2、 根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于 所述的工程菌是保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC 1395的枯草芽孢杆菌。
3、 根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于 所述的步骤(l)中的LB培养基含有浓度为3(Vg/mL的卡那霉素。
4、 根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于 所述的步骤(l)中的蔗糖水溶液的浓度为20%。
5、 根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于 所述的步骤(4)或(5)中的洗脱条件均为洗脱速度0.5mL/min，每管收集2mL。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，涉及一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其技术方案是将工程菌发酵离心后粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP-Sepharose HP离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析等步骤纯化获得磷脂酰丝氨酸合成酶。本发明制备磷脂酰丝氨酸合成酶具有制备工艺简单、酶活力高等优点，适合工业化生产；并且由磷脂酰丝氨酸合成酶催化卵磷脂和丝氨酸合成的磷脂酰丝氨酸，在医药、食品及保健品领域具有良好的应用前景。
文档编号C12N9/16GK101319203SQ20081005381
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者张业尼, 玉 李, 杜连祥, 王建玲, 王春霞, 路福平, 明 黎 申请人:天津科技大学