发酵生产l-谷氨酸的方法

专利名称：发酵生产l-谷氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于发酵生产L-谷氨酸的突变体和一种用该突变体发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种用于食品和药物的氨基酸。
生产L-谷氨酸的常规方法是用谷氨酸生产菌及其突变体进行发酵，例如用短杆菌属、棒状杆菌属或微杆菌属的细菌及其突变体进行发酵(Amino acid fermentation，Gakkai Shuppan Center，pp195-215，1986)。发酵生产L-谷氨酸的其他已知方法包括采用芽孢杆菌属、链霉菌属或青霉属微生物的方法(美国专利3,220,929)和采用假单胞菌属、节细菌属、沙雷氏菌属或假丝酵母属微生物的方法(美国专利3,563,857)。即便这些常规方法能产生明显较为大量的L-谷氨酸，也还是需要更为有效、更廉价的L-谷氨酸生产方法，以满足不断增加的需求。
大肠杆菌(Escherichia coli)由于生长速度高和可得到足够基因信息而具有作为良好的L-谷氨酸生产菌的潜力，而所报导的大肠杆菌的L-谷氨酸产量却低至23g/l(J.Biochem.，50164-165，1961)。最近据报导，α-酮戊二酸脱氢酶(以下称为α-KGDH)缺陷或降低的突变体具有生产大量L-谷氨酸的能力(法国专利申请公开2680178)。
本发明的目的是增强属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的菌株的L-谷氨酸生产能力，并提供一种更为有效、成本更低的生产L-谷氨酸的方法。
在用大肠杆菌的突变体生产L-谷氨酸的研究中，现已出人意料地发现，α-KGDH活性缺陷或降低而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下称为PPC)和谷氨酸脱氢酶(以下称为GDH)活性增强的突变体，具有高度的L-谷氨酸生产能力，从而完成了本发明。
因此，本发明包括一种具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，其α-KGDH活性缺陷或降低，而PPC和GDH活性增强；以及一种发酵生产L-谷氨酸的方法，该方法包括在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，所述突变体的α-KGDH活性缺陷或降低，而PPC和GDH活性增强；在培养液中积累L-谷氨酸；并从中回收L-谷氨酸。
本发明详述如下。
(1)α-KGDH活性缺陷或降低的埃希氏杆菌属突变体的制取作为用于制备本突变体的起始母本菌株，埃希氏杆菌属的任何非致病性菌株都可以采用。这些菌株的实例列于下面大肠杆菌K-12(ATCC10798)大肠杆菌W3110(ATCC27325)大肠杆菌B(ATCC11303)大肠杆菌W(ATCC9637)具有L-谷氨酸生产能力且α-KGDH活性缺陷或降低的埃希氏杆菌属突变体可如下制备。
上述的起始母本菌株先进行X射线或紫外光照射，或与诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(以下称为NG)接触，以引入突变。
另外，也可以利用基因工程技术，例如基因重组、基因转化或细胞融合，有效地引入预期的突变。
利用基因重组来制取α-KGDH缺陷型突变体的方法如下进行。根据α-酮戊二酸脱羧酶基因(以下称为sucA基因)的已知核苷酸顺序(Euro.J.Biochem.141351-359，1984)合成出引物，然后用染色体DNA作模板用PCR法扩增该sucA基因。在扩增后的sucA基因中插入一个抗药性基因，得到已丧失功能的sucA基因。然后利用同源重组法，用由于插入抗药性基因而丧失功能的sucA基因置换染色体上的sucA基因。
对母本菌株进行诱变处理后，可以用下述方法筛选所要的突变体。
在含有葡萄糖作碳源的基本培养基中，在通气条件下，α-KGDH活性缺陷或降低的突变体要么不能生长，要么只能以明显降低的生长速度生长。但即使在这样的条件下，在含葡萄糖的基本培养基中加入琥珀酸或赖氨酸加甲硫氨酸也可能达到正常生长。另一方面，即使在含葡萄糖的基本培养基中该突变体也能在无氧条件下生长(Molec.Gen.Gentics，105182-190，1969)。根据这些发现，可以筛选出所需的突变体。
下列菌株是所得到的α-KGDH活性缺陷或降低的突变体的一个实例。
大肠杆菌W3110 sucA∷Kmrα-KGDH活性缺陷或降低的突变体更为有用，因为其L-谷氨酸生产能力得到增强，同时它又具有如下性质L-谷氨酸降解活性降低；或者ace操纵子的表达变为组成性的，ace操纵子是苹果酸合酶(aceB)-异柠檬酸裂合酶(aceA)-异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(aceK)操纵子。上述这些性质在法国专利申请公开2680178中作了讨论。当然，已知可改进L-谷氨酸生产能力的各种性质，例如各种营养缺陷型、抗代谢物抗性和抗代谢物敏感性，也有利于增强L-谷氨酸生产能力。
L-谷氨酸降解能力下降的突变体可以作为具有如下性质的突变体而被分离出来，该突变体在含有L-谷氨酸代替萄萄糖作唯一碳源或含有L-谷氨酸代替硫酸铵作唯一氮源的基本培养基中，要么不能生长，要么只能略微生长。但是，在制取过程中采用营养缺陷型时，当然可以在培养基中加入生长所必需的最小量的营养物。
组成性表达ace操纵子的突变体可以以如下菌株的形式得到该菌株的母本菌株是一种磷酸烯醇丙酮酸合酶缺陷型菌株，该菌株本身能够在含有乳酸作碳源的基本培养基中生长，但不能在含有丙酮酸或乙酸/丙酮酸作碳源的基本培养基中生长；或者该菌株在通气条件下的生长速度高于其α-KGDH缺陷或下降的母本菌株(J.Bacteriol.，962185-2186，1968)。
上述突变体的实例如下大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)大肠杆菌AJ12628是一种α-KGDH活性下降、L-谷氨酸降解能力下降，兼组成性表达ace操纵子的突变体。大肠杆菌AJ12624是一种α-KGDH活性下降、L-谷氨酸降解能力下降的突变体(法国专利申请公开2680178)。
在所得到的(α-KGDH活性缺陷或降低的突变体中，通过三羧酸循环中的α-酮戊二酸生物合成L-谷氨酸的过程得到改善，使L-谷氨酸生产能力得到增强。同样，在α-KGDH活性缺陷或下降且降解所产生的L-谷氨酸的能力明显较低的突变体中，或者在同时还组成性表达ace操纵子从而使生长得到改善的突变体中，L-谷氨酸生产能力也得到提高。
(2)PPC活性和GDH活性增强的埃希氏杆菌属突变体的制取在下述实施例中，由α-KGDH活性缺陷或下降并具有L-谷氨酸生产能力的起始母本菌株，得到了PPC和GDH活性增强的埃希氏杆菌属突变体。也可以使用埃希氏杆菌属的野生菌株作母本菌株，得到PPC和GDH活性增强的突变体，然后培养突变体使其α-KGDH活性缺陷或下降。
因此，用于制备PPC和GDH活性增强的突变体的起始母本菌株优选是α-KGDH活性缺陷或下降并具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，或者是埃希氏杆菌属的非致病性野生型菌株。这种菌株的实例列举如下。
大肠杆菌W3100 sucA∷Kmr大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)(以上列出的是α-KGDH活性缺陷或下降并具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体。)大肠杆菌K-12(ATCC 10798)大肠杆菌W3110(ATCC 27325)大肠杆菌B(ATCC 11303)大肠杆菌W(ATCC 9637)(以上列出的是埃希氏杆菌属的非致病性野生菌株。)为了增强PPC和GDH活性，将编码PPC和GDH的基因克隆到合适的质粒上，然后用该质粒来转化作为宿主使用的起始母本菌株。增加转化细胞中编码PPC和GDH的基因(以下分别称为ppc基因和gdhA基因)的拷贝，从而使PPC和GDH活性得到增强。
欲克隆的ppc和gdhA基因，可以克隆到欲引入用作宿主的起始母本菌株中的单个质粒中，也可以分别克隆到两种在起始母本菌株中相容的质粒中。
另外，用以下方法也可以进行PPC和GDH活性的增强使ppc和gdhA基因以多拷贝存在于用作宿主的起始母本菌株的染色体DNA上。为将ppc和gdhA基因以多拷贝引入到埃希氏杆菌属的染色体DNA中，利用以多拷贝存在于染色体DNA上的靶顺序进行同源重组。以多拷贝存在的顺序可以是存在于插入顺序末端的重复DNA和反向重复顺序。另外，也可以如日本特许公开2-109985所述，将ppc和gdhA基因克隆到转座子上，然后进行转座，从而使多拷贝引入到染色体DNA中。增加转化细胞中ppc和gdhA基因的拷贝，使PPC和GDH活性得到增强。
除了上述的基因扩增外，也可以通过用较高效的启动子置换ppc和gdhA基因的启动子来使PPC和GDH活性增强。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、PR启动子及λ噬菌体的PL启动子是强启动子。通过增强ppc基因和gdhA基因的表达，使PPC和GDH活性得到增强。
分离出相对于PPC或GDH缺陷型突变体的营养缺陷互补的基因，就可以得到ppc和gdhA基因。另外，由于大肠杆菌中这些基因的核苷酸顺序是已知的(J.Biochem.，95909-916，1984；Gene，27193-199，1984)，也可根据这些核苷酸顺序合成出引物，然后用染色体DNA作模板用PCR法得到基因。
(3)用能够生产L-谷氨酸且α-KGDH活性缺陷或降低、PPC和GDH活性增强的埃希氏杆菌属突变体发酵生产L-谷氨酸为了用能够生产L-谷氨酸且α-KGDH活性缺陷或下降、PPC和GDH活性增强的埃希氏杆菌属突变体发酵生产L-谷氨酸，可以使用标准培养基和标准培养方法，标准培养基中含有碳源、氮源、无机盐、必要时还含有有机微量养分如氨基酸和维生素。培养基中所用的碳源和氮源可以是可被所用突变体代谢的任何碳源和氮源。
碳源可以是糖类，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解产物和糖蜜，也可以使用有机酸如乙酸和柠檬酸，有机酸既可以独立使用也可与其他碳源混合使用。
氮源可以是氨和铵盐，例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵及硝酸盐。
有机微量养分可以是氨基酸、维生素、脂肪酸和核酸，可以是这些成分本身也可以是蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解产物等中所含的这些成分。在使用其生长需要某种氨基酸的营养缺陷型时，应添加所需的养分。
无机盐可以是磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
在20-45℃的发酵温度下进行通气培养，pH控制在5-9的范围内。在培养过程中控制pH时，可以加入碳酸钙或碱如氨气来进行中和。培养10小时至4天后，培养液中积累大量的L-谷氨酸。
培养后可以用任何已知方法回收培养液中的L-谷氨酸。例如，从培养液中除去细胞，然后浓缩并沉淀，或者进行离子交换色谱，得到L-谷氨酸。
本发明以下列实施例进一步描述。
实施例1(1)大肠杆菌的sucA基因和二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶基因的克隆大肠杆菌K12的sucA基因和二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶基因(以下称为sucB基因)的核苷酸顺序是已知的。sucA基因和sucB基因的已知核苷酸顺序公开于文献中(Euro.J.Biochem.，141351-374，1984)，而且也在本文的顺序表中作为7号顺序给出。327位至3128位残基的核苷酸顺序相应于sucA基因的ORF(开放读码)，而3143位至4357位残基的核苷酸顺序相应于sucB基因的ORF。根据所报导的核苷酸顺序，合成1-4号顺序所示的引物，并利用大肠杆菌W3110的染色体DNA作模板，以PCR法扩增sucA和sucB基因。
用于扩增sucA基因的合成此物具有1号和2号顺序所示的核苷酸顺序，1号顺序相应于由文献所述的sucA基因的核苷酸顺序图(Euro.J.Biochem.，141354，1984)中的45位至65位残基的碱基组成的顺序。它也相应于由7号顺序所示的核苷酸顺序的45位至65位残基的碱基组成的顺序。
2号顺序相应于文献所示的sucB基因的核苷酸顺序图(Euro.J.Biochem.，141364，1984)中的3173位至3193位残基的碱基组成的顺序。它也相应于由7号顺序所示的核苷酸顺序的3173位至3193位残基的碱基组成的顺序。
用于扩增sucB基因的合成引物具有3号和4号顺序所示的核苷酸顺序，3号顺序相应于由文献所示的sucA基因的核苷酸顺序图(Euro.J.Biochem.，141354，1984)中的2179位至2198位残基的碱基组成的顺序。它也相应于由7号顺序所示核苷酸顺序的2179位至2198位残基的碱基组成的顺序。
4号顺序相应于文献所示的sucB基因的核苷酸顺序图(Euro.J.Biochem.，141364，1984)中的4566位至4591位残基的碱基组成的顺序。它也相应于7号顺序所示的核苷酸顺序的4566位至4591位残基的碱基组成的顺序。sucA基因和sucB基因构成一个操纵子。
用标准方法回收大肠杆菌W3110的染色体DNA(《生物工学实验所》，日本生物工学会编，第97-98页，Baifukan，1992)。
在文献所述的标准条件下进行PCR反应(PCR Technology，HenryErlich编，第8页，Stockton Press，1989)。
利用T4 DNA聚合酶将所产生的PCR产物的两端转化为平末端，并克隆到pBR322载体的EcoRV位点上。将sucA基因克隆到pBR322中得到的质粒定名为pBR-sucA，用sucB构建的质粒定名为pBR-sucB。将所得质粒引入到大肠杆菌JM109中，并制备质粒。然后建立限制图谱并与所报导的sucA和sucB基因的限制图谱比较，从而证实了已克隆的基因是sucA和sucB基因。
如

图1所示，用KpnI和EcoRI消化pBR-sucB，制得含sucB基因的DNA片段。用KpnI-和EcoRI消化pBR-sucA，制得一个大片段。这两个片段用T4 DNA连接酶连接，产生pBR-sucAB。
(2)大肠杆菌W3110染色体DNA上的sucA基因的破坏图2概括了大肠杆菌W3110染色体DNA上的sucA基因的破坏。
用KpnI消化pBR-sucAB，利用T4 DNA聚合酶得到平末端。另一方面，用PstI消化pUC4K(购自Pharmacia)，制得含卡那霉素抗性基因的DNA片段，用T4 DNA聚合酶使其转化为平末端。这两个片段用T4 DNA连接酶连接，得到pBR-sucA∷Kmr。由该质粒切下含有卡那霉素抗性基因的HindIII-EcoRI片段，用该线性DNA转化由大肠杆菌遗传原种中心(美国耶鲁大学)得到的大肠杆菌JC7623(thr-1，ara-14，leuB6，△(gpt-proA)62，lacY1，tsx-23，supE44，galK2，λ，rac，sbcB15，hisG4，rfbD1，recB21，recC22，rpsL31，kdgK51，xyl-5，mtl-1，argE3，thi-1)，并在添加有25μg/ml卡那霉素的L培养基(细菌胰胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl 5g/l、琼脂15g/l，pH7.2)上，筛选其染色体DNA上的sucA基因已被插入了卡那霉素抗性基因的sucA基因(sucA∷Kmr)置换的菌株。由于大肠杆菌JC7623具有recB、recC和sbcB，即使用线性DNA进行转化也能以高频率实现重组。
由所得到的12个卡那霉素抗性菌株的每个菌株制备染色体DNA，并用KpnI消化。用含有sucA基因的DNA片段作探针进行Southern杂交，证实这12个菌株都是其染色体DNA上的sucA基因已被插入了卡那霉素抗性基因的sucA基因置换的菌株。在Southern杂交中使用含有pBR-sucA的sucA基因的2.6Kb EcoRI-HindIII片段作探针时，由于在含有sucA基因的DNA片段中存在KpnI位点，野生菌株显示出5.2Kb和6.2Kb两个条带，而置换有已插入了卡那霉素抗性基因的sucA基因的菌株，由于在引入卡那霉素抗性基因时破坏了KpnI位点，只显示出11.4Kb一个条带。然后，用P1噬菌体感染所得到的具有卡那霉素抗性的大肠杆菌JC 7623(sucA∷Kmr)，并制备噬菌体溶解产物。然后用sucA∷Kmr转导大肠杆菌W3100菌株。用标准方法进行P1噬菌体转导(《生物工学实验所)》，日本生物工学会编，第75-76页，Baifukan，1992)。所分离出的卡那霉素抗性菌株的代表定名为W3110 sucA∷Kmr。
按照Reed等人的方法(Methods in Enzymology，1355，1969)测定W3110 sucA∷Kmr菌株和大肠杆菌W3110的α-KGDH活性。结果示于表1。未检测到大肠杆菌W3110 sucA∷Kmr的α-KGDH活性。因此，大肠杆菌W3110sucA∷Kmr是α-KGDH活性缺陷的菌株。
表1W3110W3110sucA∷Kmrα-KGDH活性 3.70 未检测到(单位微摩尔/毫克蛋白/分)(3)大肠杆菌W3110的gdhA基因的克隆。
与sucA和sucB基因的克隆类似，用PCR法来克隆gdhA基因。根据Fernando等人报导的gdhA基因的核苷酸顺序，合成PCR引物。gdhA基因的核苷酸顺序公开于文献中(Gene，27193-199，1984)，并也在本文的顺序表中作为8号顺序给出。引物的核苷酸顺序示于5号和6号顺序中。
5号顺序相应于文献给出的gdhA基因核苷酸顺序图(Gene，27195，1984)中191位至171位残基的顺序，它也相应于8号顺序中3位至23位残基的顺序。
6号顺序相应于由文献给出的gdhA基因核苷酸顺序图(Gene，27195，1984)中1687位至1707位残基组成的顺序，它也相应于由8号顺序中的1880位至1900位残基组成的顺序。
利用合成引物用PCR法扩增gdhA基因，采用大肠杆菌W3110的染色体DNA作模板。纯化所得的PCR产物，并利用T4 DNA聚合酶使其转化为平末端，然后与已用EcoRV消化的pBR322连接，得到质粒pBRGDH。
(4)含ppc和gdhA基因的质粒的构建图3显示了含ppc和gdhA基因的质粒的构建步骤。用HindIII消化质粒pS2，并用T4 DNA聚合酶将其两端转化为平末端。质粒pS2中，在pBR322的SalI位点中插入了含有得自大肠杆菌K-12的整个ppc基因区的4.4Kb SalI片段(J.Biochem.，9909-916，1984)。另一方面，利用T4 DNA聚合酶将用PCR法合成的含gdhA基因的DNA片段转化为平末端。随后用T4 DNA连接酶连接这两个片段。用所得质粒转化得自大肠杆菌遗传原种中心(美国耶鲁大学)的一个GDH缺陷型菌株，即大肠杆菌PA340(thr-1，fhuA2，leuB6，lacY1，supE44，gal-6，λ-，gdh-1，hisG1，rfbD1，galP63，△(gltB-F)，rpsL19，malT1(λR)，xy1-7，mtl-2，argH1，thi-1)，并分离其生长不需谷氨酸的氨苄青霉素抗性菌。由该菌株制备一个质粒并建立限制图谱，从而证实该质粒上存在ppc和gdhA基因。该质粒定名为pGK。
(5)将pS2、pBRGDH和pGK引入α-KGDH缺陷型菌株大肠杆菌W3100 sucA∷Kmr并评定L-谷氨酸的生产分别用pS2、pBRGDH和pGK转化α-KGDH缺陷型菌株大肠杆菌W3100 sucA∷KMr，将每个转化菌株分别接种到装有20ml具有表2所示组成的培养基的500ml摇瓶中，然后在37℃下进行培养，直到培养基中的葡萄糖完全消耗。结果示于表3。
表2组分 浓度(g/l)葡萄糖40(NH4)2SO420KH2PO41MgSO4·7H2O1FeSO4·7H2O0.01MnSO4·5H2O0.01
酵母提取物 2盐酸硫胺素 0.01CaCO350表3菌株 积累的L-谷氨酸(g/l)W3110 sucA∷Kmr19.2W3110 sucA∷Kmr/pS219.9W3110 sucA∷Kmr/pBRGDH 2.8W3110 sucA∷Kmr/pGK23.3(AJ 12949)虽然由于引入pS2而使PPC活性增强的转化菌株与宿主菌株W3110 sucA∷Kmr相比生长略有下降，但它积累L-谷氨酸的量与宿主菌株的积累量相似。由于引入pBRGDH而使GDH活性增强的菌株生长很差，L-谷氨酸的积累量出人意料地小于W3110 sucA∷Kmr菌株的积累量。
相反，由于引入pGK而使PPC和GDH活性同时增强的转化菌株，其生长与宿主菌株类似，但L-谷氨酸的积累量增加。已引入了含ppc和gdhA基因的pGK质粒的大肠杆菌W3110 sucA∷Kmr定名为AJ12949。大肠杆菌AJ12949最早于1993年12月28日保藏在日本工业科技局国立生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan)，保藏号为FERM P-14039，该保藏于1994年11月11日转化为布达佩斯条约保藏，保藏号为FERMBP-4881。
从保藏菌株AJ 12949中除去质粒而不损坏细胞，可以得到宿主菌株，即W3110 sucA∷Kmr。该质粒可以自发地从AJ 12949中丢失，也可以用某种脱除方法脱除(Bact.Rev.，36361-405，1972)。脱除方法的一个例子如下。用AJ 12949菌株接种L-液体培养基(细菌胰胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl 5g/l，pH7.2)，并于40℃下培养过夜。将培养液适当稀释并铺在L-培养基上。在37℃下培养过夜后，将形成的菌落转移到含100μg/ml氨苄青霉素的L-培养基上，然后分离氨苄青霉素敏感菌落。所得到的菌株是W3110 sucA∷Kmr。
本发明方法提供了埃希氏杆菌属突变体的较高L-谷氨酸生产能力，以及L-谷氨酸的高效、低成本生产。
顺序表顺序识别号1顺序长度21顺序类型核酸链数单链拓扑结构线性分子类型合成DNA特征用于扩增大肠杆菌sucA基因的引物顺序ACGCGCAAGC GTCGCATCAG G 21顺序识别号2顺序长度21顺序类型核酸链数单链拓扑结构线性分子类型合成DNA特征用于扩增大肠杆菌sucA基因的引物顺序ATCGGCTACG AATTCAGGCA G 21顺序识别号3顺序长度20顺序类型核酸链数单链拓扑结构线性分子类型合成DNA特征用于扩增大肠杆菌sucB基因的引物顺序CCGGTCGCGG TACCTTCTTC20顺序识别号4顺序长度26顺序类型核酸链数单链拓扑结构线性分子类型合成DNA特征用于扩增大肠杆菌sucB基因的引物顺序CGTAGACCGA ATTCTTCGTA TCGCTT 26顺序识别号5顺序长度21顺序类型核酸链数单链拓扑结构线性分子类型合成DNA特征用于扩增大肠杆菌gdhA基因的引物顺序GGGTGGCAAA GCTTTAGCGT C21顺序识别号6顺序长度21顺序类型核酸链数单链拓扑结构线性分子类型合成DNA特征用于扩增大肠杆菌gdhA基因的引物顺序TCGAGAAGCA TGCATTATAT A21顺序识别号7顺序长度4623顺序类型核酸链数单链拓扑结构线性分子类型基因组DNA原始来源生物大肠杆菌特征特征关键词CDS位置327..3128特征测定方法E特征关键词CDS位置3143..4357特征测定方法E顺序TCGATGTTGT TGCAACGTAA TGCGTAAACC GTAGGCCTGA TAAGACGCGC AAGCGTCGCA 60TCAGGCAACC AGTGCCGGAT GCGCGTGAAC GCCTTATCCG GCCTACAAGT CATTACCCGT 120AGGCCTGATA AGCGCAGCGC ATCAGGCGTA ACAAAGAAAT GCAGGAAATC TTTAAAAACT 180GCCCCTGACA CTAAGACAGT TTTTAAAGGT TCCTTCGCGA GCCACTACGT AGACAAGAGC 240TCGCAAGTGA ACCCCGGCAC GCACATCACT GTGCGTGGTA GTATCCACGG CGAAGTAAGC 300ATAAAAAAGA TGCTTAAGGG ATCACG ATG CAG AAC 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图2显示了破坏大肠杆菌W3110的染色体DNA上的sucA基因的步骤。
图3显示了pGK的构建步骤。
权利要求
1.一种具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，该突变体的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或降低，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶活性增强。
2.一种发酵生产L-谷氨酸的方法，该方法包括在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，所述突变体的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或降低，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶活性增强；在培养液中积累L-谷氨酸；并从中回收L-谷氨酸。
全文摘要
本发明通过改进埃希氏杆菌属微生物的L-谷氨酸生产能力，提供了一种低成本而高效的L-谷氨酸生产方法。发酵生产L-谷氨酸的方法包括在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，所述突变体的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或降低，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶活性增强；在培养液中积累L-谷氨酸；并从中回收L-谷氨酸。
文档编号C12P13/14GK1128295SQ95100509
公开日1996年8月7日 申请日期1995年1月10日 优先权日1994年1月10日
发明者小野荣治, 辻本信晴, 松井和彦, 仓桥修 申请人:味之素株式会社