具有可耐低温丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽与将其编码的dna和含有该dna的重组载体以...的制作方法

专利名称：具有可耐低温丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽与将其编码的dna和含有该dna的重组载体以 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为赋予植物以耐低温性的手段的、具有新型可耐低温丙酮酸磷酸双激酶(以下简称“PPDK”)活性的多肽，将其编码的无性系化DNA，和含有该DNA的重组载休。此外，还涉及用上述本发明DNA转型的植物。
背景技术：
C4植物在强光、高温、低CO2的条件下有高的光合作用能力，但除一部分能适应低温条件外，一般在低温时光合成量大大降低。PPDK(EC 2.7.9.1，能催化从ATP、丙酮酸和正磷酸生成AMP、磷酸烯醇丙酮酸和焦磷酸的反应)是C4途径的重要酶之一，但其活性与叶组织的光合作用速度相比是不够的，因而成为C4光合作用中制约二氧化碳固定速度的酶之一。此外，在人们发现PPDK的同时，就已指出它是低温敏感酶。在玉米PPDK的情况下，酶活性的内弯点是11.7℃，这个温度与玉米的生长极限温度是一致的。从这些事实，可以认为PPDK是C4植物低温光合成速度低的原因之一，通过改善PPDK的低温敏感性，说不定能降低玉米这种C4植物的生长极限温度。菊科植物棕黄花菊(Flaveria brownii)属于C3/C4中间型类别，已知它的PPDK即使在0℃的低温处理时也几乎不会失活(Burnell JNA comparative study of the cold-sensitivityof pyruvate，Pi dikinase in Flaveria species.Plant CellPhysiol，31，295-297(1990))。
如果使将上述棕黄花菊的耐低温PPDK编码的基因无性系化，再用它使植物转型，则可望能赋予植物以耐低温性。
发明公开因此，本发明的目的是提供作为赋予植物以耐低温性的手段的、具有新型可耐低温PPDK活性的多肽，将其编码的无性系化DNA以及含有该DNA的重组载体。此外，本发明的目的还提供用上述本发明的DNA转型的植物。
本申请的发明者等人进行深入研究的结果，成功地使棕黄花菊的全PPDK基因无性系化并确定了其碱基序列和将其编码的氨基酸序列，此外，还成功地在该PPDK基因中识别出赋予耐低温性的区域，从而完成了本发明。
即，本发明提供在下列(1)、(2)任意一种中，具有在从氨基酸序列的C端算起占全长1/6的范围内至少一个以上的氨基酸残基置换成其它氨基酸残基的氨基酸序列，且具有可耐低温丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽(1)具有序列表序列号1至4任意一种中所示氨基酸序列的丙酮酸磷酸双激酶；(2)具有与(1)中所示氨基酸序列50％以上相同的氨基酸序列、且具有丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽。
此外，本发明还提供将具有本发明可耐低温PPDK活性的多肽编码的无性系化DNA。而且，本发明还提供含有本发明DNA、可在宿主中表达具有可耐低温PPDK的多肽的重组载体。进而，本发明还提供用本发明DNA转型的植物。
本发明使具有耐低温性的PPDK基因无性系化，并确定了其碱基序列。而且，也确定了该基因中赋予耐低温性的区域。因此，通过用本发明的基因使具有低温敏感性PPDK的植物转型，可使低温敏感性的PPDK变成耐低温性。此外，通过使上述赋予耐低温性的区域组合到低温敏感性PPDK的相同部分，也可以使低温敏感性PPDK变成耐低温性。通过这样做，使得即使在原来不能栽培该植物的塞冷地区也有可能栽培该植物。因此，本发明可望对农业做出巨大贡献。
附图简单说明

图1是一幅模式图，说明含有本发明PPDK基因之一例的表达载体的构建方法。
图2是说明用大肠菌表达的棕黄花菊、双齿黄花菊(Flaveriabidentis)和玉米的PPDK在0℃保存时酶活性随时间变化的图。
图3是一幅模式图，说明玉米PPDK和棕黄花菊PPDK的嵌合体基因的构建方法。
实施本发明的最佳形态按照本发明，使具有耐低温性的棕黄花菊PPDK基因无性系化，并确定了其碱基序列及将其编码的推算氨基酸序列。该碱基序列和氨基酸序列用序列表的序列号5表示。这个序列如以下实施例中详细叙述的那样，是从棕黄花菊的绿叶提取全RNA，按常法制作cDNA库，以双齿黄花菊(Flaveria bidentis)(序列号1)和玉米的PPDK基因碱基序列(序列号2)的高同系性区域作为探子进行噬菌斑杂化，选择阳性无性系进行无性系化，再用双脱氧法确定碱基序列而确定的。这个序列具有与同属棕黄花菊PPDK基因一样高的同系性，也具有比玉米PPDK还要高的同系性，而且还与从棕黄花菊绿叶直接精制的PPDK的N末端序列、C末端序列和内部序列完全一致，因而，显然是棕黄花菊的PPDK基因。而且，双齿黄花菊的PPDK基因序列也是以玉米cDNA作为探子进行噬菌斑杂化、选择阳性无性系进行无性系化再用双脱氧法确定的。
序列号与所示氨基酸序列是新型的，与同属双齿黄花菊的PPDK氨基酸序列相比，有40个氨基酸残基不同。而且，与玉米的PPDK氨基酸序列相比，也有大约180个氨基酸残基不同。序列号5所示的棕黄花菊PPDK氨基酸序列，尤其与同属双齿黄花菊PPDK氨基酸序列相比，尽管有如此高的同系性，但双齿黄花菊的PPDK是低温敏感的，而棕黄花菊的PPDK则是耐低温的，这表明氨基酸序列的微小差异引起了性状上的重要差异。本发明提供将这种序列号5所示氨基酸序列编码的无性系化PPDK基因。如上所述，这种氨基酸序列是新型的，而且有具有耐低温性这样的显著效果。本发明的基因不限于有序列号5所示碱基序列的基因，只要是能将这种氨基酸序列编码，也可以有任何碱基序列。
本申请的诸发明者也曾试图识别序列号5所示棕黄花菊PPDK基因中与赋予耐低温性有关的区域。即，如以下实施例中详述的那样，用限制性内切酶把棕黄花菊的PPDK基因切成大小均等的三部分，把分割的区域与玉米PPDK基因的对应区域交换而形成嵌合体PPDK基因，确定该嵌合体基因编码的PPDK是否有耐低温性。结果确认在棕黄花菊的最后1/3区域中存在着赋予耐低温性的领域。此外，这个最后1/3区域又用限制性内切酶进一步切割成两等分，用同样方法确认其任意一部分中是否存在赋予耐低温性的区域。其结果确认了在序列号5所示棕黄花菊PPDK基因的XhoI部位下游，即在序列号5所示氨基酸序列中从第832号精氨酸至第955号缬氨酸的氨基酸序列(以下称这个序列为“赋予耐低温性序列”)中，存在着赋予耐低温性的功能。
即，判明了PPDK与耐低温性有关的区域存在于从C末端起占全长1/6的范围内。另一方面，在序列表序列号1中列出了双齿黄花菊PPDK编码基因的碱基序列及推断的氨基酸序列，而在序列号2中列出了玉米PPDK编码基因的碱基序列及推断的氨基酸序列(Journalof Biochemistry 263，11080-11083(1988))。序列号3中列出了细菌类共生拟杆菌(Bacteroides symbiosus)的PPDK编码基因的碱基序列及推断氨基酸序列(Biochemistry 29，10757-10765(1990))。序列号4中列出了细菌类组织溶解内变形虫(Entamoebahistolytiea)的PPDK编码基因的碱基序列及推断氨基酸序列(Molecular and Biochemical Parasitology 62，153-156(1993))。如上所述，赋予PPDK以耐低温性的区域由于已由本发明判明是在从C末端算起占全长的1/6范围内，因而通过使序列号1至4所示这些氨基酸序列从C末端算起占全长1/6范围内的至少1个以上氨基酸残基置换成其它氨基酸残基，有可能得到耐低温性PPDK。此外，这里的所谓“耐低温性”系指酶在0℃的温度下放置20分钟时其活性是放置前的60％以上。
如上所述，序列号5所示氨基酸序列中从第832号精氨酸至第955号缬氨酸的区域决定了耐低温性，因而把序列号1至4中所述低温敏感性PPDK的对应部分置换成序列号5所示氨基酸序列中从第832号精氨酸至第955号缬氨酸的氨基酸序列，可以使其低温敏感性PPDK变成耐低温性。这个发现非常重要，因为利用这个结果可以赋予所希望的PPDK以耐低温性。此外，作为赋予PPDK以耐低温性的方法，如以下实施例所述，不限于通过使棕黄花菊PPDK中的赋予耐低温性序列与低温敏感性PPDK的对应部分交换来制作嵌合体基因的方法，也可以使其植物本身的低温敏感性PPDK的对应部分发生部位特异性变异(site-directed mutagenesis)，从而改变成与棕黄花菊PPDK的赋予低温性序列相同的序列。因此，包含上述赋予低温性序列、具有PPDK活性的多肽编码无性系化DNA均属于本发明的范围。具体地说，序列号1所示氨基酸序列的第869号置换成脯氨酸的PPDK，以及第885号和第952号分别置换成亮氨酸和缬氨酸的PPDK，都有耐低温性。
赋予耐低温性的PPDK不限于序列表1至4中所示的那些，只要是有其各自同系性50％以上者即可。较好的是与棕黄花菊PPDK碱基序列的同系性可以在48.5％以上，更好的是可以在90％以上。
一般来说，即使在有生理活性的肽的氨基酸序列发生微小改变的情况下，即，即使在该氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被置换或缺失或者增加了1个或多个氨基酸的情况下，该肽的生理活性仍可保持的情况是众所周知的事实。因此，有序列号5所示氨基酸序列的多肽中进行这样的改性后仍具有耐低温性PPDK活性的多肽也属于本发明的范围。即，在序列号5所示氨基酸序列中，加成、缺失或置换了1个或多个氨基酸后仍具有耐低温性PPDK活性的多肽也属于本发明的范围。同样，在序列号5所示碱基序列中，加成、缺失或置换了1个或多个核苷酸后仍具有耐低温性PPDK活性的多肽编码DNA也属于本发明的范围。
引起氨基酸加成、缺失或置换的DNA可诸如借助于诱发部位特异性变异这种众所周知的技术(例如，Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p 6487-6500，1982)实施，本说明书中所谓“1个或多个氨基酸”系指可借助于部位特异性变异诱发法加成、缺失或置换的氨基酸数目。
部位特异性变异的诱发，可诸如利用除所希望变异的特定不一致外与应受到变异的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引子按如下进行。即，用上述合成寡核苷酸作为引子在噬菌体中合成互补链，再用所得到的双链DNA使可载带噬菌体的宿主细菌转型。把转型细菌的培养物涂在琼脂上，从含有噬菌体的单细胞形成噬菌斑。如果这样进行，在理论上，50％的新菌落含有作为单链、有变异的噬菌体，其余50％则含有原来的序列。然后，使所得到的噬菌斑在一个能和与具有上述所希望变异的DNA完全一致的DNA杂化但不和与原有链不一致的DNA杂化的温度，与激酶处理的合成探子发生杂化。然后收集、培养与该探子杂化的噬菌斑，回收DNA。
此外，作为在酶的氨基酸序列中置换、缺失或插入1个或多个氨基酸又不使之丧失酶活性的方法，除上述部位特异性变异诱发法外，还有用变异原处理基因的方法，以及使基因发生选择性断裂、然后脱除、加成或置换所选择的核苷酸再将其连接起来的方法。
通过用棕黄花菊的PPDK基因或含有其赋予耐低温性序列并具有PPDK活性的DNA使植物转型，可以获得耐低温性的植物。此时，作为转型植物的较好实例，可以列举玉米、甘蔗、稷(粟)、稗子和高梁等，但不限于这些。
植物的转型方法是已经成熟的，较好采用基于肿胀土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的方法。利用肿胀土壤杆菌的植物转型方法在本领域中是众所周知的，用这种方法，无论双子叶植物(例如特开平4-330234号公报)还是单子叶植物(W0 94/00977)都能转型。或者，还可以用常用方法如electroporation法等导入植物的原生质中，以及使DNA附着在钨粒子等上、打入植物的胚中等办法，也可以进行转型。这些转型的具体方法在以下实施例中叙述。
实施例以下参照实施更具体地说明本发明。当然，本发明不限于下述实施例。
1.棕黄花菊PPDK基因的无性系化和碱基序列的确定(1)cDNA库的制作和全长cDNA的无性系化(i)cDNA库的制作从棕黄花菊(F.brownii)的绿叶(60g)，用盐酸胍/苯酚法分离全RNA。用这种方法可以在锂沉淀后得到26.5mg RNA。然后用填充了oligo dT Cellulose Type 7(Pharmacia公司)的柱子，按常用方法从13.2mg RNA得到118.9μg poly A(+)RNA。在cDNA库的制备中，使用了TimeSaver cDNA Synthesis kit(Pharmacia公司)、Lambda ZAPII载体(Stratagene公司)和cDNA无性系化系统λgt10(Amersham公司)附带的填料试剂。用EcoRI/NotI衔接物把DNA片段插入Lambda ZAPII载体的EcoRI部位，从而制作了cDNA库。所制作的cDNA库的尺寸是41.5万pfu。还使用了XL1-Blue作为宿主细胞。
(ii)探子的制备利用相当于加工部位附近的引子5′GACGGCTAAAAAGAGGGT(根据双齿黄花菊PPDK的cDNA和玉米PPDK的cDNA同系性高的部分设计的)和引子RTATCGAGAAACCTTCTATAC(双齿黄花菊PPDK序列的一部分，互补链)进行逆转录PCR使棕黄花菊RNA扩大，用具有扩大片段的pCRII载体(可购自Invitrogen公司)作为模板，用同样的引子进行PGR使该片段扩大、电泳后，用SUPREC-01(宝酒造)从凝胶中回收DNA。用这种工艺，可以得到成熟蛋白质N末端下游24bp开始的428bp(bp＝碱基对)的DNA片段。用Multiprime DNA标记系统(Amersham公司)对这个片段进行32P标记来制备探子。
(iii)全长棕黄花菊cDNA的无性系化以上述DNA片段作为探子，用噬菌斑杂化法筛选cDNA库。用Hybond N+(Amersham公司)作为杂化过滤器，杂化条件是在6×SSC、5×Denhalt′s溶液、0.1％SDS、100μg/ml变性鲑鱼精巢DNA中于65℃过夜。洗涤条件是用2×SSC、0.1％SDS在室温进行5分钟，用2×SSC、0.1％SDS在室温进行90分钟，进一步用1×SSC、0.1％SDS在68℃进行90分钟。其结果，得到了28个独立的阳性噬菌斑。从其中选择信号强的11个噬菌斑进行第二次筛选。第二次筛选除第二次洗涤时间为60分钟外按照与上述第一次筛选同样的方法进行。其结果，从6个无性系得到了由单一噬菌体产生的独立阳性噬菌斑。为了核对所插入DNA片段部分的尺寸，以上述R引子和M13PrimerM4(GTTTTCCCAGTCACGAC，宝酒造)以及M13PrimerRV(CAGGAAACAGCTATGAC，宝酒造)作为引子，用噬菌体作为模板进行PCR。结果，有2个无性系是全长的。然后，进行活体切割，在质粒载体pBruescript II SK(-)(Stratagene公司)中使插入DNA片段部分亚无性系化。亚无性系化的重组质粒命名为p 411和p 631。
通过上述PCR发现，如上所述制作的库是含有足够长插入物、适合于cDNA筛选的库。因此，为了分离棕黄花菊的mRNA，有利的是采用如上所述的方法，而且一旦进行如上所述的大量RNA处理，就能得到大量mRNA。
此外，由于上述cDNA库大量含有如上所述的足够长插入物，因而通过使用如上所述标的蛋白质加工部位附近的引子来制备探子，可以容易地进行全长cDNA的筛选。
(2)cDNA全碱基序列的确定和预想氨基酸序列的比较为了确定p631的插入cDNA片段的全碱基序列，制作了缺失突变体(Deletion mutants)。缺失突变体的制作是用Kilo-Sequence专用Deletion Kit(宝酒造公司)进行的。然而，核酸外切酶III的反应是通过转移到事先保温在65℃的绿豆核酸酶缓冲剂中而使之停止的。碱基序列的确定是采用以Qiagen Plasmid Mini Kit(Diagen公司)精制的质粒、用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(ABI公司)和Applied Biosystems 373A DNA Sequencer(ABI公司)进行的。两条链除一部分外都确定了其碱基序列。根据所确定的碱基序列，也确定了氨基酸序列。所确定的碱基序列和氨基酸序列表示在序列表序列号5中。
应当注意，在制备用于确定所分离cDNA的碱基序列的缺失无性系时，重要的是要把绿豆核酸酶缓冲液事先加热到65℃，因为只是把反应液转移到绿豆核酸缓冲液中是不能使核酸外切酶III引起的缺失反应停止的。此外，由于无法通过只从上游侧缺失所插入的基因来确定从与载体的联结点算起可多达约600～900bp部分的碱基序列，因而有必要从两个方向缺失。
另一方面，从棕黄花菊直接精制了PPDK，并确定了其N末端区域、C末端区域和内部区域的氨基酸序列。PPDK的精制进行如下。用3倍量的萃取缓冲剂研磨棕黄花菊的绿叶→离心后上清液中添加硫酸铵使之达到30％饱和并除去沉淀的蛋白质→进一步添加硫酸铵使之达到70％饱和、回收蛋白、用Sephadex G25(Pharmacia公司制)脱盐→通过DEASE-Sepharose柱(Pharmacia公司制)→用50-400mM的KCl浓度梯度淋洗柱中吸附的蛋白质→合并有活性的级分、用70％饱和硫酸铵浓缩、用Sephadex G25脱盐→注入羟磷灰石柱中→用磷酸浓度梯度为10mM～40mM的磷酸缓冲剂淋洗柱上吸附的蛋白质→合并有活性的级分、用70％饱和硫酸铵浓缩、用Sephadex G25脱盐。此后进行SDS-PAGE电泳、切取PPDK带，用电溶出法回收凝胶中的蛋白质。用这种工艺精制，得到PPDK样品约5～10nmol。这样得到的精制PPDK在SDS-PAGE上显示单一条带。
然后，确定了所得到的精制PPDK的N末端序列、C末端序列和内部序列。即，N末端的氨基酸序列是通过把蛋白质转录在PVDF膜上、用气相氨基酸定序器确定的。C末端序列是用羧肽酶Y消化精制的PPDK、再根据游离出来的氨基酸组成与消化时间的关系推断。内部的氨基酸序列是通过从用蛋白酶消化蛋白质时产生的肽的N末端判明氨基酸序列来确定的。详细方法如下。首先，按照确定N末端氨基酸序列时的方法把从棕黄花菊的绿叶得到的PPDK精制到一定程度，进行通常的SDS-PAGE电泳之后，凝胶用Coomassie Brilliant BlueR250染色，切取PPDK条带。所切取的凝胶在平衡化缓冲剂(Tris-HCl pH 6.8 125mM、EDTA 1mM、0.1％SDS)中平衡化并插入井中，进行第二次SDS-PAGE电泳。此时，将平衡化的凝胶与重层液(Tris-HCl pH 6.8 125mM、EDTA 1mM、0.1％SDS、0.01％BPB、20％甘油)和酶溶液(Tris-HCl pH 6.8 125mM、EDTA 1mM、0.1％SDS、0.01％BPB、10％甘油、赖氨酰端肽酶1～5μg或V8蛋白酶0.01～0.1μg)一起添加稍候电泳后，在浓缩凝胶中进行蛋白质消化(切断电源、放置45分钟)。此后再开电泳，按照确定N末端氨基酸序列时的方法转录到PVDF膜上，用气相氨基酸定序器确定消化片段从N末端起的氨基酸序列。
如上所述确定的N末端序列、C末端序列和内部序列如下所示。N末端序列Asn Pro Val Ser Pro Pro Val(72～78)C末端序列Leu-Ala Ala*-Val Val(948～955)内部序列(1)Lys Leu Tyr Gly Glu Phe Leu Val Asn Ala Gln Gly-Asp ValVal Ala(349～365)内部序列(2)Gln Leu Leu Ala Pro Pro Ala Met Ser Asn Ala Leu-Thr(592～605)内部序列(3)Leu Thr Ala Asp Thr Gly Met Ser Lys Asp Glu Ile Tyr Ser ArgIle Glu(721～738)内部序列(4)Ala - - - Ser Phe Gly Thr Asn Asp Leu Cys Gln Met ValPhe Gly-Ser(844～862)此外，在上述氨基酸序列中，“*”系指谷氨酰胺但不能用所用分析仪器分析，而“-”系指分析结果不清楚。括号内的号码系指序列号5所示氨基酸序列对应部分的氨基酸号码。内部序列(2)和(4)中有一部分与序列号5对应部分的序列不同，但这可以认为是由于氨基酸定序器的误差所致。众所周知，氨基酸定序器的误差以相当高的频率发生，而DNA定序器的误差则几乎不发生。
序列号5所示氨基酸序列与从上述精制PPDK直接确定的部分氨基酸序列有很好的一致性，因而可以确认序列号所示氨基酸序列就是PPDK的氨基酸序列。此外，序列号5所示氨基酸序列与众所周知的双齿黄花菊PPDK和玉米PPDK的氨基酸序列比较时，发现成熟蛋白质部分不同的氨基酸分别为40个(双齿黄花菊)和大约180个(玉米)。从上述结果还可以了解到，在序列号5所示氨基酸序列中第1号至第71号的氨基酸序列在成熟蛋白质中不存在，而是一种通过膜时必要的转送肽，是在通过膜后加工而成的。棕黄花菊和双齿黄花菊的成熟蛋白质中氨基酸残基的差异如以下表1所示。
表1


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2.棕黄花菊PPDK在大肠菌中的生产及其耐低温性的测定为了确认从如上所述分离的棕黄花菊PPDK cDNA确实产生了耐低温性酶，在大肠菌中的表达进行如下。
为了除去转送肽并使表达载体与解读密码结合在一起，限制性内切酶部位的导入进行如下。以p631用SacI切断再环化得到的p631Sac(缺失了SacI下游区域的p631质粒)作为模板，用以加工部位附近的序列为基础、含EcoRV的引子4GATATCAATCCGGTGTCTCCTCC与载体序列的互补引子M13RV(宝酒造)的组合进行PCR，并使扩大的片段在pCRII中进行亚无性系化。用限制性内切酶EcoRV和SacI，把含N末端部分的片段从pCRII上切下来，再与p631的SacI-HindIII(含有PPDK CDNA的残余部分)，和用NcoI切断、用Klenow酶使末端平滑化后用HindIII切断的pKK233-2一起进行三个片段的连接反应(图1)。用这种质粒使E.coli MV1184转型并用于表达实验。1ml前培养液用9ml新LB培养基(含50mg/l氨苄青霉素)稀释，在37℃振荡培养3小时后添加IPTG使之达到5mM，进一步培养3小时后用离心法回收菌体。将菌体悬浮在0.5ml萃取缓冲剂(50mMHepes-KOH pH 7.5，10mM MgSO4，1mM EDTA，5mM DTT)中，添加溶菌酶使之达到约0.5mg/ml，在冰上处理5分钟后，用超声波破碎装置(COSMOBIO UCD-130T型)边用冰冷却边按30秒钟间隔处理5分钟，提取酶。用微量离心机离心10分钟，上清液通过用柱缓冲剂(50mM Hepes-KOH pH 7.0，10mM MgCl2，2mM EDTA，10mMDTT)平衡化的Sephadex G25柱除去低分子物质后，在25℃放置30分钟，进行4聚体缔合，用于活性测定。
在大肠菌内从棕黄花菊、双齿黄花菊和玉米(Harvest Queen)的PPDK cDNA生产的PPDK在SDS-PAGE上显示出与源于植物的酶几乎相同的淌度。从各种cDNA预期的成熟酶的分子量都大致相同，但在SDS-PAGE上的表观分子量则有颇大差异。这显然是由于各多肽中所含的氨基酸组成不同，而不是由于蛋白质的缺失加工或糖链加成等的翻译后修饰。用大肠菌生产的各种PPDK的耐低温性与对应的植物酶是一致的。即，棕黄花菊PPDK的耐低温性无需用该植物特有的辅助因子或翻译后的加工就能得到，如果把这种cDNA导入玉米中予以表达，就可望产生耐低温性PPDK。图2显示酶在0℃的温度放置后所经历的时间与PPDK的相对活性之间的关系。
此外，在上述工艺中，为了用大肠菌生产有活性的PPDK，制作脱除了转送肽编码区的cDNA并将其插入表达载体中，但此时重要的是准确地使要切取的位置匹配于与源于植物的酶的N末端位置对应的部位。(棕黄花菊) 在大肠菌中的产量 (所使用的引子)MITAKKRVFTF…- 2MIPVSPPVTTTKKRVFTF…+ 3MINPVSPPVTTTKKRVFTF…++ 4NPVSPPVTTTKKRVFTF…(源于叶的酶)(双齿黄花菊)MITAKKRVFTF… ++MIPVSPPVTTAKKRVFTF… --TAKKRVFTF…(源于叶的酶)(玉米)MATKKRVFTF… ++TTKKRVFTF…(源于叶的酶)即，在进行棕黄花菊cDNA的表达实验时，既成功地表达了玉米和双齿黄花菊，也能参照玉米的切断部位进行表达。因此，即使在棕黄花菊cDNA中，也使用引子2在相同位置切断来制作表达载体并试图予以表达，但PPDK根本没有产生。然后，基于源于叶的酶的N末端序列，用引子3制作了在N末端多含7个残基的表达载体，在试图予以表达时确认产生了PPDK。但是，即使在这个阶段表达量也很少，还不能得到足以测定耐低温性的酶量。然后，进一步用引子4制作了在N末端侧延长1个残基的表达载体，在进行表达实验时能产生大量PPDK，因而能确认其耐低温性。引子2和引子3的碱基序列如下所示引子-2CGGTGTCTCCTCCGGATATCACGGCTAAAAAGAG引子-3TTGATATCCCGGTTGTCTCCTCCGGTA3.棕黄花菊PPDK基因中赋予耐低温性区域的确定(1)棕黄花菊和双齿黄花菊的嵌合体按常法用限制性内切酶重组。使pKK-brownii的EcoRI-HindIII片段与pKK-bidentis(采用与pKK-brownii的构建方法相同的方法使双齿黄花菊的cDNA插入pKK-223-2中而得到的质粒)的对应片段交换来制作pKK-011，反之，使pKK-bidentis的EcoRI-HindIII片段与pKK-brownii的对应片段交换来制作pKK-100。同样，使NdeI-HindIII片段相互交换制作了pKK-001和pKK-110。此外，使pKK-110的Xho-HindIII片段与pKK-bidentis的对应片段交换制作了pKK-1101，而使pKK-bidentis的XhoI-HindIII片段与pKK-brownii的对应片段交换制作了pKK-1110。为了使XhoI-HindIII片段进一步精细地相互重组，用PCR法(linking PCR法)进行这些片段的联接。在bidentis(双齿黄花菊)和brownii(棕黄花菊)的XhoI-HindIII片段中碱基序列相同的情况下，制作了互补的引子link-FGCAGAGATGATGTTGGCAAG和link-RCTTGCCAACATCATCTCTGC。以用pBluescript SK(-)亚无性系化的brownii或bidentis的XhoI-HindIII片段作为模板，用link-F/RV、M4/link-R的组合进行第一次PCR。所得到的片段(共4种)用凝胶切出法精制，用brownii前半部和bidentis后半部或bidentis前半部和brownii后半部的片段混合物作为模板，用引子M4/RV进行第二次PCR。扩大的结合片段用XhoI和HindIII切断，与pKK-bidentis的对应部分交换，制作了pKK-link01和pKK-link10。利用linking PCR的重组部位与HindIII之间的PstI部位，制作了另一组嵌合体基因。把pKK-link10的XhoI-PstI片段和pKK-bidentis的PstI-HindIII片段插入pKK-bidentis的XhoI-HindIII部位(3片段连接反应)，制作了pKK-link101。pKK-bidentis的XhoI-PstI片段和pKK-brownii的PstI-HindIII片段也按同样方法插入pKK-bidentis的XhoI-HindIII部位，制作了pKK-link110。
棕黄花菊和双齿黄花菊的PPDK在成熟蛋白质部分出现的40个部位的氨基酸置换较多地靠近酶的N末端和C末端区域，而在中部活性中心附近较少。因此，首先利用两种基因中共同存在的限制性内切酶EcoRI和NdeI部位把cDNA分成前、中、后三个部分，使这些片段相互交换来制作嵌合体基因，考察了到底哪一部分与耐低温性有关。其结果是，在含有棕黄花菊cDNA后1/3的情况下获得了耐低温性，反之，在含有双齿黄花菊cDNA后1/3的情况下具有低温敏感性。然后，用限制性内切酶XhoI把后1/3区域分成两个部分，分别导入pKK-bidentis的对应部分中，测定耐低温性。其结果是，获得耐低温性的必要且充分条件是含有XhoI部位的下游区域(距C最末端1/6的区域)。然后，用linking PCR法制作含有后1/6区域(XhoI-HindIII片段，含有7个氨基酸置换)的嵌合体基因，导入pKK-bidentis中，测定其耐低温性。其结果是，具有含4个置换的最后区域的嵌合体酶pKK-link10有耐低温性，而具有含3个置换的前半区域的嵌合体酶pKK-link01则在低温失活。因此，用限制性内切酶PstI使这个后半区域重组，制作了各有2个氨基酸置换的嵌合体基因，测定耐低温性，但其中任何一个嵌合体酶都显示耐低温性，因而推测存在2个以上与耐低温性有关的区域。
(2)玉米和棕黄花菊的嵌合体用引子PPDK-FCTCACTGTTCGAAGAGAAGC和含有NdeI部位的mNdeICATATGCTCTGTCCGGCATAATC(互补链上)，以玉米PPDK cDNA为模板进行PCR，所得到的片段在pCRII中进行亚无性系化。用SacI和NdeI把这个片段从pCRII上切下来，pKK-PPDK的ScaI-SmaI片段(载体片段)和棕黄花菊PPDK cDNA用HindIII切断，用Klenow酶使末端平滑化后用NdeI切断得到的片段，将其一起进行了3个片段连接反应(图3)，得到了pKK-mz/bro(Nde)。此外，用引子PPDK-F和含XhoI部位的mXhoICTCGAGGGATCTCAATCATTG(互补链上)以玉米PPDK cDNA为模板进行PCR，所得到的片段在pCRII中亚无性系化后用SacI和XhoI从pCRII上切下来，与pKK-mz/bro(Nde)的ScaI-XhoI片段(载体片段)结合，得到pKK-mz/bro(Xho)。
玉米PPDK和棕黄花菊PPDK C末端1/3区域(NdeI-HindIII片段)或1/6区域(XhoI-HindIII片段)的嵌合体酶均显示与棕黄花菊相同水平的强耐低温性。这样，便可以使氨基酸序列颇为不同的玉米PPDK具有耐低温性，因而可以认为，通过导入这个最后1/3区域或1/6区域就能使源于各种植物的PPDK具有耐低温性。由于由此制作的玉米/棕黄花菊嵌合体PPDK可以对玉米PPDK的转送肽以其原来形式加以利用，因而若其转送部分也源于棕黄花菊PPDK的转型体在耐低温性PPDK向叶绿体输送上有问题，则可考虑用导入这种嵌合体基因来取而代之的办法加以解决。
(3)点变异无性系对于pKK-brownii的XhoI-HindIII片段，制作了棕黄花菊→双齿黄花菊型的氨基酸残基逐一置换。而对于pKK-bidentis的XhoI-HindIII片段，也制作了双齿黄花菊型→棕黄花菊型的氨基酸残基逐一置换。变异导入是通过使棕黄花菊和双齿黄花菊PPDK cDNA的XhoI-HindIII片段分别在pBluescript II SK(-)中亚无性系化，再用Megalabel Kit(宝酒造)和Mutan-K Kit(宝酒造)按照Kunkel法进行的。用于变异导入的引子序列如表2中所示。变异的碱基序列用DNA定序器确认后，把这些片段插入pKK-bidentis的XhoI-HindIII部位中。
表2 用于点变异无性系制作的引子

使pKK-1110的XhoI-HindIII区域中不同的氨基酸逐一置换成双齿黄花菊型的酶全都显示耐低温性，因而可以认为存在着多个赋予耐低温性的变异(只改变一个残基无损于抗性)。然后，与此相反，使pKK-bidentis的XhoI-HindIII区域中不同的氨基酸逐一置换成棕黄花菊型，考察其是否变成耐低温性酶。即，在0℃处理20分钟后，测定酶活性。其结果是，896Gln→Pro变异获得耐低温性(上述低温处理后的活性是原来的60～70％)，而885Ile→Leu和952Ile→Val变异使得低温失活稍难以发生，如果综合考虑上述(1)嵌合体酶pKK-link110的结果，则可以推测这两种变异共存时仍能获得耐低温性。从以上结果可以断言869Pro、885Leu、925Val这三个残基与耐低温性有关。然而，在棕黄花菊与耐低温性有关的这些残基中，就869Pro和885Leu而言，玉米PPDK也具有棕黄花菊型。因此，仅仅这些残基是棕黄花菊型的不一定就能获得耐低温性，但可以认为在棕黄花菊或双齿黄花菊的氨基酸序列中它们最初就赋予了完全的抗性，因而，在使氨基酸序列差异颇大的其它物种PPDK耐低温性化的情况下不宜导入点变异，较好是像对玉米PPDK进行的那样，制作以区域单位导入的嵌合体基因。
4.用棕黄花菊PPDK基因进行的玉米转型按照Gordon-Kamm W.J.等人(The Plant Cell 2603-618，1990)或Koziel M.G.等人(Bio/Technology 11194-200，1993)的方法，把pKK-brownii包覆在钨或金的微细粒子上，将其植入玉米的未成熟胚或悬浮培养细胞中。从导入处理的细胞筛选转型细胞，然后，将所得到的转型体愈伤组织(callus)按常法培养，再生植物体。转型方法不限于粒子枪法，还包括Electro-poration法(Rhodes C.A.et al.，Science 240204-207，1988)、PEG法(Armstrong C.L.et al.，Plant Cell Reports 9335-339，1990)、Tissue-electroporation法(D′Halluin K.et al.，ThePlant Cell 41495-1505，1992)或土壤杆菌法(Hiei Y.andKomari T.，WO 9400977)等。从所得到的植物体回收种子并使之发芽，再从所得到的植物的叶分离PPDK、测定其耐低温性。测定温度对转型植物和未转型植物光合成速度的影响。通过使那些在低温显示较高光合成速度的玉米植株繁育多代、测定不同温度的光合成速度和测定从植物体分离的PPDK的耐低温性，确保了所研究的转型的稳定性。
5.用棕黄花菊PPDK基因进行的双齿黄花菊转型把含有序列号5所示全长cDNA并含有信息基因的中间载体导入肿胀土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的无害化Ti质粒中。这可以按照Draper J et al.eds.，Plant Genetic Transfomationand Gene Expression-a laboratory manual，BlackwellScientific Publications(ISBN 0-632-02172-1)中所述方法进行。
另一方面，使双齿黄花菊(F.bidentis)的叶组织或愈伤组织(callus)感染上述肿胀土壤杆菌(A.tumefaciens)。这可以通过使该组织或愈伤组织与肿胀土壤杆菌共存培养来进行。感染细胞根据抗药性进行选择。从所选择的愈伤组织按常法再生植物体。从所得到植物体得到种子、使之发芽，从所得到的植物的叶分离PPDK并测定其耐低温性。对于转型植物和未转型植物，考察温度对光合成速度的影响。通过使那些在低温显示较高光合成速度的双齿黄花菊植株繁育多代、测定不同温度的光合成速度和测定从植物体分离的PPDK的耐低温性，确保所研究的转型的稳定性。
序列表序列号1序列长2915序列型核酸序列CGATCTCCTT CTGCTATTGC TGATATCTCA ATTTCACAGG TGAAGAAGG ATG ATG AGT 58Met Met Ser1TCG TTG TCT GTT GAA GGT ATG CTT CTC AAG TCA GCC CGT GAG TCG TGC106Ser Leu Ser Val Glu Gly Met Leu Leu Lys Ser Ala Arg Glu Ser Cys5 10 15TTA CCG GCG AGA GTG AAG CAA CGG CGA AAC GGT GAT CTC CGG CGA TTG154Leu Pro Ala Arg Val Lys Gln Arg Arg Asn Gly Asp Leu Arg Arg Leu20 25 30 35AAC CAC CAC CGT CAA TCG TCG TTT GTC CGG TGT TTA ACT CCG GCG AGA202Asn His His Arg Gln Ser Ser Phe Val Arg Cys Leu Thr Pro Ala Arg40 45 50GTT AGC AGA CCA GAG TTG CGC AGC AGT GGC TTA ACT CCG CCG CGA GCA250Val Ser Arg Pro Glu Leu Arg Ser Ser Gly Leu Thr Pro Pro Arg Ala55 60 65GTT CTT AAT CCG GTG TCT CCT CCG GTG ACG ACG GCT AAA AAG AGG GTT298Val Leu Asn Pro Val Ser Pro Pro Val Thr Thr Ala Lys Lys Arg Val70 75 80TTC ACT TTT GGT AAA GGA AGA AGT GAA GGC AAC AGG GAC ATG AAA TCC346Phe Thr Phe Gly Lys Gly Arg Ser Glu Gly Asn Arg Asp Met Lys Ser85 90 95TTG TTG GGA GGA AAA GGA GCA AAT CTT GCT GAG ATG TCA AGC ATT GGT394Leu Leu 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Gln Arg Lys Val Ala Leu Asp Leu Leu660 665 670 675CTC CCA TAC CAA AGA TCC GAT TTT GAG GGC ATT TTC CGA GCA ATG GAT 2122Leu Pro Tyr Gln Arg Ser Asp Phe Glu Gly Ile Phe Arg Ala Met Asp680 685 690GGA CTT CCT GTA ACT ATC CGC CTT CTA GAC CCT CCA CTT CAT GAG TTT 2170Gly Leu Pro Val Thr Ile Arg Leu Leu Asp Pro Pro Leu His Glu Phe695 700 705TTA CCC GAA GGT GAT CTA GAA CAC ATA GTG AAC GAA CTT GCA GTC GAC 2218Leu Pro Glu Gly Asp Leu Glu His Ile Val Asn Glu Leu Ala Val Asp710 715 720ACA GGC ATG AGT GCA GAT GAA ATC TAT TCA AAA ATC GAA AAT CTA TCT 2266Thr Gly Met Ser Ala Asp Glu Ile Tyr Ser Lys Ile Glu Asn Leu Ser
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340 345CTG GTG AAC GCT CAG GGT GAG GAT GTG GTT GCC GGA ATA AGA ACC CCA 1109Leu Val Asn Ala Gln Gly Glu Asp Val Val Ala Gly Ile Arg Thr Pro
350 355 360GAG GAC CTT GAC GCC ATG AAG AAC CTC ATG CCA CAG GCC TAC GAC GAG 1157Glu Asp Leu Asp Ala Met Lys Asn Leu Met Pro Gln Ala Tyr Asp Glu365 370 375CTT GTT GAG AAC TGC AAC ATC CTG GAG AGC CAC TAC AAG GAA ATG CAG 1205Leu Val Glu Asn Cys Asn Ile Leu Glu Ser His Tyr Lys Glu Met Gln380 385 390GAT ATC GAG TTC ACT GTC CAG GAA AAC AGG CTG TGG ATG TTG CAG TGC 1253Asp Ile Glu Phe Thr Val Gln Glu Asn Arg Leu Trp Met Leu Gln Cys395 400 405 410AGG ACA GGG AAA CGT ACG GGC AAA AGT GCC GTG AAG ATC GCC GTG GAC 1301Arg Thr Gly Lys Arg Thr Gly Lys Ser Ala Val Lys Ile Ala Val Asp415 420 425ATG GTT AAC GAG GGC CTT GTT GAG CCC CGC TCA GCG ATC AAG ATG GTA 1349Met Val Asn Glu Gly Leu Val Glu Pro Arg Ser Ala Ile Lys Met Val430 435 440GAG CCA GGC CAC CTG GAC CAG CTT CTT CAT CCT CAG TTT GAG AAC CCG 1397Glu Pro Gly His Leu Asp Gln Leu Leu His Pro Gln Phe Glu Asn Pro445 450 455TCG GCG TAC AAG GAT CAA GTC ATT GCC ACT GGT CTG CCA GCC TCA CCT 1445Ser Ala Tyr Lys Asp Gln Val Ile Ala Thr Gly Leu Pro Ala Ser Pro460 465 470GGG GCT GCT GTG GGC CAG GTT GTG TTC ACT GCT GAA GAT GCT GAA GCA 1493Gly Ala Ala Val Gly Gln Val Val Phe Thr Ala Glu Asp Ala Glu Ala475 480 485 490TGG CAT TCC CAA GGG AAA GCT GCT ATT CTG GTA ACG GCG GAG ACC AGC 1541Trp His Ser Gln Gly Lys Ala Ala Ile Leu Val Arg Ala Glu Thr Ser495 500 505CCT GAG GAC GTT GGT GGC ATG CAC GCT GCT GTG GGG ATT CTT ACA GAG 1589Pro Glu Asp Val Gly Gly Met His Ala Ala Val Gly Ile Leu Thr Glu510 515 520AGG GGT GGC ATG ACT TCC CAC GCT GCT GTG GTC GCA CGT TGG TGG GGG 1637Arg Gly Gly Met Thr Set His Ala Ala Val Val Ala Arg Trp Trp Gly525 530 535AAA TGC TGC GTC TCG GGA TGC TCA GGC ATT CGC GTA AAC GAT GCG GAG 1685Lys Cys Cys Val Ser Gly Cys Ser Gly Ile Arg Val Asn Asp Ala Glu540 545 550AAG CTC GTG ACG ATC GGA AGC CAT GTG CTG CGC GAA GGT GAG TGG CTG 1733Lys Leu Val Thr Ile Gly Ser His Val Leu Arg Glu Gly Glu Trp Leu555 560 565 570TCG CTG AAT GGG TCG ACT GGT GAG GTG ATC CTT GGG AAG CAG CCG CTT 1781Ser Leu Asn Gly Ser Thr Gly Glu Val Ile Leu Gly Lys Gln Pro Leu575 580 585TCC CCA CCA GCC CTT AGT GGT GAT CTG GGA ACT TTC ATG GCC TGG GTG 1829Ser Pro Pro Ala Leu Ser Gly Asp Leu Gly Thr Phe Met Ala Trp Val590 595 600GAT GAT GTT AGA AAG CTC AAG GTC CTG GCT AAC GCC GAT ACC CCT GAT 1877Asp Asp Val Arg Lys Leu Lys Val Leu Ala Asn Ala Asp Thr Pro Asp605 610 615GAT GCA TTG ACT GCG CGA AAC AAT GGG GCA CAA GGA ATT GGA TTA TGC 1925Asp Ala Leu Thr Ala Arg Asn Asn Gly Ala Gln Gly Ile Gly Leu Cys620 625 630CGG ACA GAG CAC ATG TTC TTT GCT TCA GAC GAG AGG ATT AAG GCT GTC 1973Arg Thr Glu His Met Phe Phe Ala Ser Asp Glu Arg Ile Lys Ala Val635 640 645 650AGG CAG ATG ATT ATG GCT CCC ACG CTT GAG CTG AGG CAG CAG GCG CTC 2021Arg Gln Met Ile Met Ala Pro Thr Leu Glu Leu Arg Gln Gln Ala Leu655 660 665GAC CGT CTC TTG ACG TAT CAG AGG TCT GAC TTC GAA GGC ATT TTC CGT 2069Asp Arg Leu Leu Thr Tyr Gln Arg Ser Asp Phe Glu Gly Ile Phe Arg670 675 680GCT ATG GAT GGA CTC CCG GTG ACC ATC CGA CTC CTG GAC CAT CCT TCT 2117Ala Met Asp Gly Leu Pro Val Thr Ile Arg Leu Leu Asp His Pro Ser685 690 695TAC GAG TTC CTT CCA GAA GGG AAC ATC GAG GAC ATT GTA AGT GAA TTA 2165Tyr Glu Phe Leu Pro Glu Gly Asn Ile Glu Asp Ile Val Ser Glu Leu700 705 710TGT GCT GAG ACG GGA GCC AAC CAG GAG GAT GCC CTC GCG CGA ATT GAA 2213Cys Ala Glu Thr Gly Ala Asn Gln Glu Asp Ala Leu Ala Arg Ile Glu715 720 725 730AAG CTT TCA GAA GTA AAC CCG ATG CTT GGC TTC CGT GGG TGC AGG CTT 2261Lys Leu Ser Glu Val Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg Gly Cys Arg Leu735 740 745GGT ATA TCG TAC CCT GAA TTG ACA GAG ATG CAA GCC CGG GCC ATT TTT 2309Gly Ile Ser Tyr Pro Glu Leu Thr Glu Met Gln Ala Arg Ala Ile Phe750 755 760GAA GCT GCT ATA GCA ATG ACC AAC CAG GGT GTT CAA GTG TTC CCA GAG 2357Glu Ala Ala Ile Ala Met Thr Asn Gln Gly Val Gln Val Phe Pro Glu765 770 775ATA ATG GTT CCT CTT GTT GGA ACA CCA CAG GAA CTG GGG CAT CAA GTG 2405Ile Met Val Pro Leu Val Gly Thr Pro Gln Glu Leu Gly His Gln Val780 785 790ACT CTT ATC CGC CAA GTT GCT GAG AAA GTG TTC GCC AAT GTG GGC AAG 2453Thr Leu Ile Arg Gln Val Ala Glu Lys Val Phe Ala Asn Val Gly Lys795 800 805 810ACT ATC GGG TAC AAA GTT GGA ACA ATG ATT GAG ATC CCC AGG GCA GCT 2501Thr Ile Gly Tyr Lys Val Gly Thr Met Ile Glu Ile Pro Arg Ala Ala
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620625 630GGT GCA CAA GGG ATC GGA CTC TGT AGA ACT GAA CAT ATG TTT TTC GCT 2091Gly Ala Gln Gly Ile Gly Leu Cys Arg Thr Glu His Met Phe Phe Ala635 640 645 650TCT GAC GAG AGG ATC AAA GCT GTA AGA AAG ATG ATC ATG GCG GTC ACT 2139Ser Asp Glu Arg Ile Lys Ala Val Arg Lys Met Ile Met Ala Val Thr655 660 665CCA GAA CAA AGA AAA GCG GCT CTA GAC CTC TTA CTC CCA TAC CAA AGA 2187Pro Glu Gln Arg Lys Ala Ala Leu Asp Leu Leu Leu Pro Tyr Gln Arg670 675 680TCC GAT TTT GAG GGC ATT TTC CGA GCA ATG GAT GGA CTT CCT GTA ACA 2235Ser Asp Phe Glu Gly Ile Phe Arg Ala Met Asp Gly Leu Pro Val Thr685 690 695ATC CGC CTT CTA GAC CCT CCA CTT CAT GAG TTT CTA CCC GAA GGT GAT 2283Ile Arg Leu Leu Asp Pro Pro Leu His Glu Phe Leu Pro Glu Gly Asp700 705 710CTA GAA CAC ATA GTG AAT GAA CTT ACA GCG GAT ACA GGC ATG AGC AAA 2331Leu Glu His Ile Val Asn Glu Leu Thr Ala Asp Thr Gly Met Ser Lys715 720 725 730GAT GAA ATC TAT TCA AGA ATC GAA AAA TTA TCC GAA GTG AAC CCT ATG 2379Asp Glu Ile Tyr Ser Arg Ile Glu Lys Leu Ser Glu Val Asn Pro Met735 740 745CTT GGT TTC CGT GGT TGC CGA TTA GGG ATT TCA TAC CCC GAG CTA ACA 2427Leu Gly Phe Arg Gly Cys Arg Leu Gly Ile Ser Tyr Pro Glu Leu Thr750 755 760GAA ATG CAA GTT CGT GCG ATC TTT CAA GCT GCA GTG TCT ATG AAC AAT 2475Glu Met Gln Val Arg Ala Ile Phe Gln Ala Ala Val Ser Met Asn Asn765 770 775CAG GGG GTG ACT GTA ATA CCA GAG ATC ATG GTT CCG TTA GTC GGA ACA 2523Gln Gly Val Thr Val Ile Pro Glu Ile Met Val Pro Leu Val Gly Thr780 785 790CCT CAG GAA TTA CGG CAT CAA ATC GGC GTA ATT CGT GGT GTA GCT GGA 2571Pro Gln Glu Leu Arg His Gln Ile Gly Val Ile Arg Gly Val Ala Ala795 800 805 810AAT GTT TTT GCT GAA ATG GGG CTG ACG TTG GAG TAT AAA GTG GGA ACG 2619Asn Val Phe Ala Glu Met Gly Leu Thr Leu Glu Tyr Lys Val Gly Thr815 820 825ATG ATT GAG ATT CCT CGA GCT GCT TTG ATT GGT GAT GAG ATT GCA AAA 2667Met Ile Glu Ile Pro Arg Ala Ala Leu Ile Ala Asp Glu Ile Ala Lys830 835 840GAA GCC GAG TTC TTT TCG TTT GGA ACC AAT GAT TTG ACC CAG ATG ACA 2715Glu Ala Glu Phe Phe Ser Phe Gly Thr Asn Asp Leu Thr Gln Met Thr845 850 855TTT GGG TAC AGG AGA GAT GAT GTT GGC AAG TTT TTG CCG ATT TAT CTT 2763Phe Gly Tyr Ser Arg Asp Asp Val Gly Lys Phe Leu Pro Ile Tyr Leu860 865 870TCT CAA GGC ATT CTG CAG CAT GAT CCA TTT GAG GTT CTT GAC CAG AAA 2811Ser Gln Gly Ile Leu Gln His Asp Pro Phe Glu Val Leu Asp Gln Lys875 880 885 890GGG GTG GGT CAA TTG ATC AAG ATG GCC ACG GAG AAA GGT CGT GCA GCC 2859Gly Val Gly Gln Leu Ile Lys Met Ala Thr Glu Lys Gly Arg Ala Ala895 900 905AAT CCT AAC TTA AAG GTT GGG ATA TGT GGG GAG CAT GGT GGA GAA CCT 2907Asn Pro Asn Leu Lys Val Gly Ile Cys Gly Glu His Gly Gly Glu Pro910 915 920TCT TCT GTT GCA TTT TTT GAC GGA GTT GGA CTA GAT TAT GTG TCG TGC 2955Ser Ser Val Ala Phe Phe Asp Gly Val Gly Leu Asp Tyr Val Ser Cys925 930 935TCT CCA TTC AGG GTT CCT ATC GCA AGG TTG GCC GCT GCA CAA GTC GTT3003Ser Pro Phe Arg Val Pro Ile Ala Arg Leu Ala Ala Ala Gln Val Val940 945 950GTT TAAGCTTTGA AAGGAGGATG GCTTATTTGC TTCATGTTTT CCGCCATTGT 3056Val955ATATTATTTT GGTTTCATCC TTATTGTAAT GGTGAAAATG AACGATGTTT AAACAAAACA 3116ACCCATTATA TTTTGGTTTG GTATGCAATA ATCTACTTTT CAAACAAAAA AAAAAAAAAA 3176AAAA 3180序列号6序列长18序列型核酸序列GACGGCTAAA AAGAGGGT18序列号7序列长20序列型核酸序列TATCGAGAAA CCTTCTATAC 20序列号8序列长17序列型核酸序列GTTTTCCCAG TCACGAC17序列号9序列长17序列型核酸序列CAGGAAACAG CTATGAC17序列号10序列长23序列型核酸序列GATATCAATC CGGTGTCTCC TCC 23序列号11序列长34序列型核酸序列CGGTGTCTCC TCCGGATATC ACGGCTAAAA AGAG 34序列号12序列长27序列型核酸序列TTGATATCCC GGTTGTCTCC TCCGGTA 27序列号13序列长20序列型核酸序列GCAGAGATGA TGTTGGCAAG20序列号14序列长20序列型核酸序列CTTGCCAACA TCATCTCTGC20序列号15序列长20序列型核酸序列CTCACTGTTC GAAGAGAAGC20序列号16序列长23序列型核酸序列CATATGCTCT GTCCGGCATAATC 23序列号17序列长21序列型核酸序列CTCGAGGGAT CTCAATCATT G 21序列号18序列长18序列型核酸序列GCAATCTCTT CAGCAATC 18序列号19序列长20序列型核酸序列GCTTCTTTTC CAATCTCATC20序列号20序列长18序列型核酸序列CGAAAAGAAA TCGGCTTC 18序列号21序列长24序列型核酸序列GAAAGATAAA TCTGCAAAAA CTTG24序列号22序列长19序列型核酸序列GCCTTGAGCA AGATAAATC 19序列号23序列长21序列型核酸序列TTCTGGTCAA TAACCTCAAT G 21序列号24序列长20序列型核酸序列GCTTAAACAA TGACTTGTGC 20序列号25序列长22序列型核酸序列CCAATCTCAT CAGCTATTAA AG 22序列号26序列长20序列型核酸序列GCTTCTTTTG CAATCTCTTC20序列号27序列长18序列型核酸序列CGAAAAGAAC TCAGCTTC 18序列号28序列长23序列型核酸序列CAAGATAAAT CGGCAAAAAC TTG23序列号29序列长23序列型核酸序列GAATGCCTTG AGAAAGATAA ATC 23序列号30序列长24序列型核酸序列CTTTCTGGTC AAGAACCTCA AATG24序列号31序列长20序列型核酸序列GCTTAAACAA CGACTTGTGC 20
权利要求
1.一种多肽，其氨基酸序列系下列(1)(2)中任意一种在从氨基酸序列的C末端起占全长1/6的范围内有至少一个以上氨基酸残基置换成其它氨基酸残基，并具有耐低温性丙酮酸磷酸双激酶活性(1)一种丙酮酸磷酸双激酶，其氨基酸序列如序列表序列号1～4中任意一种所示；(2)一种多肽，其氨基酸序列有50％以上与(1)所示氨基酸序列相同，并具有丙酮酸磷酸双激酶活性。
2.一种多肽，其氨基酸序列如序列表序列号5所示，或在该氨基酸序列中增加、缺失或置换了一个或多个氨基酸，并具有耐低温性丙酮酸磷酸双激酶活性。
3.权利要求2所述多肽，其氨基酸序列如序列表序列号5所示。
4.一种多肽，其中含有序列表序列号5所示氨基酸序列第832～955号部分，或在该部分氨基酸序列中增加、缺失或置换了一个或多个氨基酸并可赋予有丙酮酸磷酸双激酶活性的肽以耐低温性的序列，并具有耐低温性丙酮酸磷酸双激酶活性。
5.权利要求4所述多肽，其中含有序列表序列号5所示氨基酸序列第832～955号部分，并具有耐低温性丙酮酸磷酸双激酶活性。
6.权利要求1所述多肽，其中，序列表序列号5所示氨基酸序列第832～955号部分，或在部分氨基酸序列中增加、缺失或置换了一个或多个氨基酸并能赋予丙酮酸磷酸双激酶以耐低温性的序列，置换了丙酮酸磷酸双激酶氨基酸序列的对应部分。
7.权利要求6所述多肽，其中，序列表序列号5所示氨基酸序列第832～955号部分置换了丙酮酸磷酸双激酶氨基酸序列的对应部分。
8.权利要求1所述多肽，其中，序列表序列号1所示氨基酸序列第869号置换成脯氨酸。
9.权利要求1所述多肽，其中，序列表序列号1所示氨基酸序列第885号和第952号分别置换成亮氨酸和缬氨酸。
10.权利要求1～9中任何一项所述多肽的编码无性系化DNA。
11.权利要求10的DNA，对具有序列表序列号5所示碱基序列或在该碱基序列中增加、缺失或置换了一个或多个核苷酸并有耐低温性丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽编码。
12.一种重组载体，其中含有权利要求10所述DNA，可在宿主中表达具有耐低温性丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽。
13.用权利要求10所述DNA转型的植物。
全文摘要
公开了作为赋予植物以耐低温性的手段、新型有耐低温性丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽、对此类多肽编码的无性系化DNA和含有该DNA的重组载体。本发明多肽有下列(1)(2)任意一种在从氨基酸序列的C末端起占全长1/6的范围内至少一个以上氨基酸残基置换成其它氨基酸残基的氨基酸序列，并具有耐低温性丙酮酸磷酸双激酶活性(1)一种丙酮酸磷酸双激酶，其氨基酸序列如序列表序列号1～4中任何一种所示；(2)一种多肽，其氨基酸序列有50％以上与(1)所示氨基酸序列相同，并具有丙酮酸磷酸双激酶活性。
文档编号C12N9/12GK1135770SQ9519094
公开日1996年11月13日 申请日期1995年5月30日 优先权日1994年7月29日
发明者太田象三, 宇佑美悟, N·J·宾柰尔 申请人:日本烟草产业株式会社