热稳定性木聚糖酶的制作方法

专利名称：热稳定性木聚糖酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的微生物和新的酶。尤其是热稳定性的木聚糖酶。这些木聚糖酶来自于厌氧的嗜热细菌。该木聚糖酶在造纸和纸浆工业的条件下可应用，如pH大于9和温度高于70℃，尤其是这种酶在T＝80℃时仍保持活性。
木聚糖是植物半纤维素的一种组成成份。木聚糖由-1，4-糖苷键连接的β-D-木糖链组成。通常木聚糖含有由木糖和其它五碳糖、六碳糖、糖醛酸和乙酰基组成的侧链或基团。
在造纸工艺中纸浆的漂白是一重要的步骤。程序上造纸和纸浆工业中纸浆处理所使用的过程如下纸浆在pH10-12和80℃下在所谓的有氧去木素步骤中除去大多数的木素。剩余的纸浆含2-5％的木素。木素使纸具褐色。然后纸浆在多步漂白过程中被漂白。在此漂白过程中使用了如氯、二氧化氯、过氧化氢和/或臭氧等化学物质来获得高质量纸张所需的透明纸浆。
氯和含氯化学物质经常用于漂白过程。但由于这些化学物质的使用会导致二噁英和其它氯化有机化合物的形成，它们是环境的威胁。因此越来越倾向于省去导致这类废物的化学物质的使用。
这就促使发展无氯处理过程，完全无氯(TCF)和基本无氯(ECF)。在这些过程中使用过氧化氢或臭氧来漂白。但这些氧化化学物质的使用对纸张的质量，尤其是纸的强度有负作用。
已发现某些酶使纸浆更易受漂白剂的作用，由此可以减少漂白剂的用量。尤其发现木聚糖酶在纸张和纸浆处理过程中更为有用。已报道，木聚糖酶能提高纸浆中木素的可提取性。在目前处理过程中，木聚糖酶主要在有氧去木素步骤之后使用，因为它们在有氧去木素条件下没有活性且不能存在。
木聚糖酶能裂解对木素与纤维素网状结构紧密吸附起主要作用的半纤维素链。木聚糖酶处理后，木素在后续步骤中更容易被去除。
因此木聚糖酶的使用会使预漂白中活性氯的消耗减少25-30％。这种氯使用量的减少并不会影响纸张产品的质量参数。(Vi-ikari et al1986.Proc.of the third Int.Conf.Biotechnology in Pulp andPaper Ind.，Stockkolm，p.67-69 and Bajpai and Bajpai，1992.ProcessBiochemistry.27319-325)。
木聚糖酶处理也减了漂白过程中对别的化学物质如过氧化氢的需要。
已有报道在牛皮纸纸浆的漂白中应用真菌来源的木聚糖酶。这些酶是酸性木聚糖酶，酶的最适pH和温度是pH＝3-5和T＝30-50℃。这些数值应用在漂白过程中不是很理想，因为漂白过程中普遍的条件为pH≥9和温度≥70℃。
具有较高的最适pH和/或温度的细菌来源的木聚糖酶已报道应用于漂白过程。其中的一些酶来源于以下菌种(报道的木聚糖酶活性的最适pH和温度在括号内)短小芽孢杆菌(pH＝7-9，T＝40℃，Nissen et al.1992.Progress inBiotechnology 7325-327)，嗜热脂肪芽孢杆菌(pH＝7，T＝65℃，国际专利申请WO 91/10724)，Dictyoglomus thermophilum(pH＝6-8，T＝70℃，欧洲专利申请EP 0 511933)，Rhodothermus(pH＝5.5-6.5，T＝80-100℃，欧洲专利申请EP 0 538 177)，Thermotoga(pH＝5-6，T＝90℃，国际专利申请WO 93/19171)和Thermoanaer-obacter ethanolicus(T＝68℃，Deblois and Wiegel，1992.Pregress inBiotechnology 7487-490)。
虽然声称可应用其中的一些木聚糖酶于漂白过程，但迄今还没报道有在温度≥80℃下具有理想的显著去木素活性特性的木聚糖酶。
本发明公开了获自于厌氧嗜热微生物的木聚糖酶，此微生物从新西兰温泉的纯培养物中分离的。该微生物已于1994年4月14日保存于荷兰Baarn的Centranl Bureau voor Schimmelcultures(CBS)。
本发明也公开了在至少80℃温度下具有显著木聚糖酶活性的酶。另外，本发明公开了所述木聚糖酶在至少80℃温度下具有显著的去木素活性。所述酶可从保存的菌种中获得。
本发明进一步描述了制备在80℃温度下具有活性的木聚糖酶的方法。该方法在包括合适培养基中培养本发明保存的微生物，接着收获具有所述活性的酶。
本发明还公开了对编码所述木聚糖酶基因的克隆。还报道了在宿主细胞中这些基因的表达。以这种方式获得的酶基本上是纯化的。因此本发明还公开了获得木聚糖酶的另一种方法，即重组DNA的表达。
本发明进一步描述了在相当于工业应用条件下即高温和高pH下木聚糖的应用。

图1六株极端嗜热(extremophilic)菌株内部共有序列的种系发生分析。序列命名如下；菌株/正向引物/重组号。显示的分枝数字是通过对序列引导程序(boot-strap)分析得到的数据。图2G族内部共有序列的序列对照。图3TG456的XynD的木聚糖酶结构域以Sphl-BamHl片段插入pJLA602中。图4从按实施例15所述漂白的硬木纸浆TCF制备的纸张性能。Ref＝不加酶，715＝TG456xynD，716＝Tg53xynD。给出了与Schoppen-Riegler数据相关的抗张强度指数(A)，透气度(B)，撕裂度(C)和耐破度(D)。图5从按实施例15所述漂白的硬木纸浆ECF制备的纸张性能。Ref＝不加酶，715＝TG456xynD，716＝Tg53xynD。给出了Schoppen-Riegler数据相关的抗张强度指数(A)，透气度(B)，撕裂度(C)和耐破度(D)。图6以按实施列15所述漂白的软木纸浆TCF制备的纸张性能。Ref＝不加酶，715＝TG456xynD，716＝Tg53xynD出了与SchoppenRiegel数据相关的抗张强度指数(A)，透气度(B)，撕裂度(C)和耐破度(D)。图7以按实施例15所述漂白的软木纸浆ECF制备的纸张性能，Ref＝不加酶，715＝TG456xynD，716＝Tg53xynD出了与Schoppen-Riegel数据相关的抗张强度指数(A)，透气度(B)，撕裂度(C)和耐破度(D)。图8实施例15中测定的漂白的硬木纸浆TCF(A)和ECF(B)的磨浆曲线及漂白的软木纸浆TCF(C)和ECF(D)的磨浆曲线。Ref＝不加酶，715＝TG456xynD，716＝Tg53xynD。图9TG456 xynD木聚糖酶和Pulpzyme HB(Novo Nordisk)最适pH(A)和最适温度(B)的比较。图10TG456xynD木聚糖酶和Pulpzyme HB(Novo Nordisk)在80℃，pH7.0(A)及在65℃，pH9.0(B)下热稳定性的比较。
本发明公开了从新西兰温泉中分离的微生物。这些微生物具有厌氧嗜热细菌的特征并已根据Rainey(1992 phD论文，University ofWaikato，Aamilton，New zealand)分类。
微生物随后以木聚糖琼脂扩散分析筛选。测试中显示透明带的菌株被选为潜在的木聚糖酶生产菌株。菌株在pH7.0和T＝75或80℃(这取决于微生物)厌氧条件下培养。超滤浓缩后，在pH＝6.5和9及T＝80℃大分析培养液的木聚糖酶活性(实施例1)。
在所述条件下发现有6株不同菌株有木聚糖酶活性。这些微生物已于1994年4月14日保存在CBS，保存号为CBS 211.84，CBS212.94，CBS 213.94，CBS 214.94，CBS 215.94和CBS 216.94。
本发明还公开了有木聚糖酶活性的酶，特别是在至少80℃温度下及pH6或更高的条件下至少有相当木聚糖酶活性的酶。所述酶可来自于保存的菌株。所述酶也可来自于保存菌种的突变或变异菌株。
“相当活性”这一表述是指本发明的酶在至少80℃温度下具有它们在70℃所拥有的活性的至少40％，优选地是至少60％，更优选地是大约至少80％，甚至更优选地为大约200％。
本发明进一步描述了在大约80℃温度下具有活性或在这些条件下具有相当活性的木聚糖酶的制备方法。该方法包括在合适的培养基中培养本发明保存的微生物，接着回收有所述活性的酶，木聚糖酶的分离和纯化可用本领域已知的标准程序来进行。
酶的部分纯化在实施例2中举例说明。在此实施例中细胞首先通过中空纤维过滤除去。随后，蛋白通过添加硫酸铵至最终浓度1M被进一步纯化。溶液然后被加至苯琼脂糖柱并以1M NaCl洗脱蛋白。最后蛋白通过超滤浓缩并通过渗滤脱盐。
为确定木聚糖酶在碱性pH条件下降解木聚糖的潜力，比较了从所述菌株分离的木聚糖酶在pH7和9及70℃温度下利用不同底物时的活性(实施例3)。已显示木聚糖酶在碱性pH下具有相当的活性。根据底物和分析，pH9条件下木聚糖酶具有它们在pH7条件下所具活性的20％或更多。一种木聚糖酶显示在pH9能保持pH7时活性的80％。
从所述菌株中分离的木聚糖酶的热稳定性差别很大。其中一些木聚糖酶是非常热稳定的，它们在pH＝9和80℃条件下半衰期大于2小时(见实施例4)。本发明的木聚糖酶在pH＝9.0和80℃下的半衰期至少为10分钟，优选地在这些条件下半衰期大于20分钟，更优选地大于30分钟，更为优选地是大于60分钟和最优选地是半衰期大于120分钟。
本发明还公开了以编码从厌氧嗜热菌株获得的木聚糖酶为特征的DNA序列的克隆和表达。本发明公开了载体，包括表达载体，其特征在于它们含编码本发明木聚糖酶的DNA序列。还公开了以被这些载体之一转化为特征的微生物宿主细胞。
编码本发明木聚糖酶的DNA序列分析显示所得序列属于此酶家族的两类，如Gilkes等(1991，Microbiol.Rev.55303-325)早先定义的F-类和G-类木聚糖酶。从本发明的微生物获得的xynA，xynB和xynC序列属于F-类木聚糖酶；从这些微生物获得的xynD序列属于G-类木聚糖酶(参见实施例6，7，8，9)。就我们所知从嗜热微生物获得的G-类木聚糖酶以前没有报道过。为本发明木聚糖酶来源的嗜热微生物在这里被定义为最适生长温度高于65℃的微生物。优选地最适生长温度高于68℃，更优选地最适生长温度于70℃，及最优选地最适生长温度超过75℃。
在大肠杆菌中表达本发明F-类和G-类木聚糖酶DNA序列能产生活性蛋白(见实施例10和11)，所述蛋白在80℃温度下具有活性。
本发明描述的实施例中说明的克隆和表达使基因在同源生物体中表达成为可能。通过使用合适的表达和分泌调节序列也可以在别的微生物中实现表达。供选择的生物体为酵母、真菌和细菌。具体的微生物包括从黑曲霉、克鲁维乳酸酵母和地衣芽孢杆菌选择的菌种。
本发明的酶已显示对斯卑尔脱燕麦木聚糖和桦木木聚糖具有相当的活性。
进一步测试了本发明酶的漂白能力。这种漂白能力是由本发明的酶的去木素活性而确定的。本发明根据几种木材纸浆上测定的结果，公开了具有显著去木素活性的酶酶制剂，即木聚糖酶能在至少80℃温度下使木材纸浆去木素。“木材纸浆”这一表述要广义理解，它包含所有种类的木素纤维素材料。
已测定了酶对硬木纸浆和软木纸浆的漂白能力。木素的去除根据两种不同的方法(实施例5)来测定。培养基中的木素通过A300试验来确定。在这种测定中所有的制剂在80℃下在硬木和软木纸浆上均有显著的去木素活性。在pH9和80℃下酶在软木上的活性至少是pH6时的43％，而在硬木上3种菌株在pH9显示的活性和pH6时相比要大于50％，而另外3种为18-30％。利用卡巴测试通过测定纸浆中木素含量的减少还测定了软木纸浆的漂白。纸浆在pH9和80℃下同木聚糖酶制剂温育后卡巴数值下降了0.5至1.4个单位。
并且本发明的酶的漂白能力，例如可以通过常规处理的纸浆生产的纸张的ISO亮度的增加来测定，即通过比较常规处理纸浆与所述酶温育和不与酶温育来加以测定。所述常规处理包括使用根据本领域的如H2O2，臭氧，氯，或二氧化氯等漂白剂。
也测定了在大肠杆菌中表达的克隆的本发明F-类和G-类木聚糖酶在ECF漂白实验中对软木和硬木纸浆的作用(见实施例12)。令人惊奇地是我们观察到G-类木聚糖酶(由xynD基因编码)同F类木聚糖酶相比在漂白序列上显示出在软木和硬木纸浆上好得多的作用，比不加酶的对照实验要高多至6.8％ISO亮度，而最好的F-类木聚糖酶至多增加1.2％ISO亮度。对热稳定G-类木聚糖酶的进一步测试显示它们在TCF漂白实验中在软木和硬木纸浆上也产生极佳的结果(见实施例14和15)。从如此漂白纸浆生产的纸张的性能的测定显示同不加酶对照纸张相比没有明显的区别。
克隆的G-类木聚糖酶甚至在高pH下也是高度热稳定的。在80℃和pH7.0条件下测定的半衰期大于30分钟。在65℃和pH9.0条件下酶的半衰期甚至在温育120分钟后没有明显的降低(见实施例16)。在pH9.0和65℃条件下本发明的G-类木聚糖的半衰期至少为10分钟，在这些条件下优选半衰期大于20分钟，更优选地是大于30分钟，更为优选地是大于60分钟，最优选地是半衰期大于120分钟。
本发明公开了编码热稳定G-类木聚糖酶内部共有片段(ICF)的DNA序列，此共有片段显示与SEQ ID NO 12的ICF有80％以上的一致性。G-类ICF在这里被定义为位于相当于SEQ ID NO.12中SEQ ID NO 4和SEQ ID NO5的序列之间的片段(核苷酸位置295至623)。优选地同G-类ICF的一致性大于87％，更优选地是一致性大于95％，最优选地是一致性大于99％。
在进一步的实施方案中，本发明公开了同SEQ ID NO 13的氨基酸序列有至少70％一致性的G类木聚糖酶序列。优选地这种氨基酸一致性大于80％，更为优选地是氨基酸一致性大于95％，最优选地是氨基酸一致性大于99％。
本发明的酶在上述的纸浆制备过程中有氧去木素步骤后可立即使用。由于这些酶的温度和pH特点，可避免广泛地冷却和调节pH。在本发明的另一实施方案中，在有氧去木素步骤之间或前使用该酶。在该步骤之前木素浓度很高，因此应用木聚糖酶的效果要大得多。
另外，描述了本发明酶制剂的应用，尤其是用根据本发明所述的酶制剂处理纸浆的方法。
同样，绒毛浆也可用本发明的酶制剂处理。
本发明还涉及从用本发明的酶制剂处理的木材纸浆制造的纸张、纸板、绒毛纸浆。
实施例1分离产生木聚糖酶活性的菌株产生木聚糖酶的微生物是从新西兰各种热带地区的温泉中获得的。以斯卑尔脱燕麦木聚糖为底物通过原位富集从温度在70℃以上，pH在6.5至8.0的温泉中获得了菌株。实验室中，在添加木聚糖的2/1培养基上和相应于取样地点温度的条件下(70℃，75℃或85℃)通过进一步的厌氧培养得到了菌株的培养物。
添加木聚糖的2/1培养基组成如下厌氧2/1培养基刃天青(0.1％) 1.0ml/LSL10微量元素 1.0ml/LFeCl3溶液(0.28mg/ml) 1.0ml/LWolin′s％维生素 0.1ml/LNaCl 0.9g/LMgCl2·6H2O0.2g/LK2HPO41.5g/LKH2PO40.75g/LNH4Cl 0.9g/L半胱氨酸 0.75g/L酵母提取物 0.5g/LBacto蛋白胨 1.0g/L斯卑尔脱燕麦木聚糖 2g/LpH7.0在氮气下溶解Wolin′s维生素混合物 mg/100ml生物素 2.0叶酸 2.0盐酸吡哆素 10.0核黄素 5.0硫铵素 5.0尼克酸 5.0泛酸 5.0维生素B120.1对氨基苯甲酸 5.0硫辛酸 5.0SL10微量元素，改性 mg/l5M盐酸 15mlZnCl270MnCl2·4H2O100H3BO36CoCl2·6H2O130CuCl2·2H2O2NiCl2·2H2O24NaMoO4·2H2O 36从琼脂试管的单菌落获得菌株的纯培养物。在70℃和80℃，pH6.5和9.0条件下利用染色木聚糖方法(见下)和PAHBAH方法(见实施3)测定通过超滤所得培养液浓缩物的木聚糖酶活性。
表1描述了保存于CBS(Central Bureau voor Schimmelcultures)的六株菌株。
表1本专利申请使用菌株的保存号
由落叶松木聚糖和Remazol亮蓝R(Sigma)偶链而形成的染色木聚糖是按照Biely等(1985)(Anal.Biochem 144，142-146，)描述的方法制备的。落叶松木聚糖(6.7g)置于250ml水中并于室温下搅拌几小时使之溶解。将Remazol亮蓝R(10.0g)加至此混合物中。溶解后逐滴加入20ml醋酸钠溶液(2.7g醋酸钠溶于20ml双蒸水中)。然后加入由6g氢氧化钠溶于70ml水中所得的溶液继续搅拌18小时。形成的染色木聚糖通过添加700ml 96％乙醇而被沉淀，静置六小时后通过过滤(Whatman GF/A)分离沉淀。滤饼以3升96％乙醇/0.05M醋酸钠的2∶1混合物洗涤，然后以1升96％乙醇和3升丙酮洗涤直至过滤液无色。染色木聚糖的产量为10.5克。
对于酶的分析，5.1克染色木聚糖溶于150ml 0.1M MOPS缓冲液，pH6.8。混合物在70℃搅拌4小时使之溶解。冷却至室温后通过1000×g离心去除未溶解物质。为作活性分析，含3.34％w/v染色木聚糖的贮存液以0.1M pH6.8的MOPS缓冲液稀释(pH6.8)，使之成为含0.5％染色木聚糖的反应溶液。
利用染色木聚糖的酶分析是通过加0.9ml染色木聚糖溶液(0.5％)至0.6ml溶于适当缓冲液的酶制剂中混合来进行的。此混合物的一部分(0.4ml)转移到0.8ml 96％乙醇中作为对照(空白)。剩余溶液在70℃温育90分钟。反应通过转移0.4ml测试混合物至0.8ml 96％乙醇而终止。此溶液于室温放置30分钟使未被分解的染色木聚糖形成沉淀。测试样品以Beckman Microfuge E全速离心5分钟，以分光光度计在595nm测定上清液的吸收值。
实施例2酶制剂的分离在两升含1800ml加木聚糖2/1培养基的Schott瓶中于75或80℃(依赖于培养的生物体)下静止培养24小时进行厌氧发酵。在0.01％曲拉通×100(Amicon DC.10 LA和Amicon 0.1μmH5MP01-43滤膜)存在下通过中空纤维过滤从10升生长良好的培养液中去除细胞。向无细胞培养基中加入硫酸铵至终浓度1M。将最终溶液泵入一含1升以1M硫酸铵平衡的苯琼脂糖凝胶(Pharmacia-快流-低取代)的9×15cm柱上。流速为150-200ml/分钟。以5升1M硫酸铵洗柱子。以5升1M氯化钠洗脱木聚糖酶。洗脱流份以500-1000ml的体积收集。测定洗脱流份的木聚糖酶活性(以实施例3中描述的PAHBAH方法)，合并有活性的洗脱流份，超滤至小体积，以YM2膜利用Amicon Stirred Cell(Model 2000A或8400)渗滤以降低盐浓度。
实施例3部分纯化的酶制剂的木聚糖酶活性的特征描绘分析方法木聚糖酶活性的分析是以修改的Sumner分析程序(Sumner etal.1921.J.biol.Chem.475-9)进行的。另一种测定木聚糖酶活性的方法是利用基于Lever方法(1973，Biol.Med.1274-281)的改良PAHBAH分析方法。程序1斯卑尔脱燕麦木聚糖上木聚糖酶活性的Sumner分析斯卑尔脱燕麦木聚糖底物溶液制备如下4克斯卑尔脱燕麦木聚糖悬浮于100ml去矿物质水中。将悬浮液超声波处理6分钟(超声滤发生器Sonics & Materials，Vibracell type VC 250B)，在100℃温育10分钟，以Sorvall Rc-5B离心机10000rpm离心10分钟。上清液用作底物溶液，大约含有2％斯卑尔脱燕麦木聚糖。
分析如下进行试管中加入200μl斯卑尔脱燕麦木聚糖溶液，600μl适当缓冲液稀释的酶制剂(实施例2)。测试条件下试管在水浴中温育15分钟。温育后，加入7.2毫升DNS(二硝基水杨酸)试剂。混合物在100℃水浴中加热10分钟，然后试管于冰上冷却。测定575nm处的吸收值。为消除酶样品的背景吸收，进行如下对照实验含有无酶制剂底物的试管在与测试样品相同条件下温育。15分钟后加入7.2毫升DNS和酶样品(按此顺序)。
一个单位的木聚糖酶(×U)定义为产生1微摩尔按还原糖测定的木糖当量所需的酶量。
实际测定条件为pH7.0，9.0和70℃。在pH7时使用50mM磷酸缓冲液，在pH9时使用50mN的硼酸盐/氢氧化钾缓冲液。
表270℃下测定的对斯卑尔脱燕麦木聚糖的木聚糖酶相对活性
程序2桦木木聚糖上木聚糖酶活性的Sumner分析基本上使用程序1中描述的相同方法。以桦木木聚糖悬浮液代替斯卑尔脱燕麦木聚糖溶液。按如下制备桦木聚糖底物溶液4克桦木木聚糖悬浮于50ml 0.2N的氢氧化钠中并搅拌至可见性溶解。以冰醋酸调节溶液的pH至7.0，加水至100ml。溶液以Sorvall RC-5B离心机10000rpm离心。上清液用做底物溶液，大约含有3％的桦木木聚糖。最好的条件为pH7和9和70℃。结果见表3。表3在70℃下测定的对桦木木聚糖的木聚糖酶相对活性。
程序3斯卑尔脱燕麦木聚糖上木聚糖酶活性的PAHBH分析PAHBH方法的修改是针对PAHBAH试剂的，即0.05M柠檬酸三钠，0.1M亚硫酸钠，0.02M氯化钙，0.5M氢氧化钠和0.1M对羟基苯甲酸肼(PAHBAH)。
进行酶制剂的分析时，0.05毫升或0.1毫升酶制剂与0.3ml底物缓冲液(50mM Bis-TrisPropane，pH如要求，悬液中加0.2％斯卑尔脱燕麦木聚糖)混合。加入适量的水至终体积为0.5毫升。通常在70℃温育30分钟。为终至反应，温育后加入1.0毫升的PAHBAH试剂，样品于100℃加热6分钟。含底物缓冲液的对照和样品一样温育，并在加入PAHBAH试剂后再加入酶。测定420nm吸收值之前，所有样品在Beckman Microfuge E中全速离心一分钟以去除上清中悬浮的木聚糖。结果见表4。从此表中可得出结论，即所有菌株在pH9.0、80℃时与pH6.0、70℃时相比仍具有相当的活性。表4以PAHBAH分析法测定的斯卑尔脱燕麦木聚糖的木聚糖酶相对活性
实施例4木聚糖酶活性的热稳定性酶制剂的木聚糖酶活性半衰斯如下确定。酶制剂以100mMTAPS缓冲液(pH9.0，80℃)稀释1/10倍，并于80℃温育。于0，10，20，40，60和120分钟时取样加至放于冰上的100mM MOPS缓冲液中(pH6.0，70℃)，使最终稀释度为适于最终分析的1/20至1/100。样品置于冰上直到按实施例3，程序3描述的PAHBAH分析方法在PH6.0和70℃条件下进行分析。
表5用PAHBAH分析方法在斯卑尔脱燕麦木聚糖上及pH9.0和80℃条件下测定的木聚糖酶活性的热稳定性
实施例5去木素活性木聚糖酶的去木素活性以两种不同的方法加以确定。用A300方法估计酶处理后从纸浆中释放的木素量。利用卡巴测试测定处理后纸浆的剩余木素含量。方法1A300测试为以A300分析法测定去木素作用，酶制备物以每克湿纸浆两个PAHBAH单位的浓度(大约每克干纸浆六个PAHBAH单位)与软或硬木纸浆温育。在pH6.0的MOPS缓冲液中和pH9.0的TAPS缓冲液中80℃条件下进行温育两小时。温育的纸浆浓度为每毫升0.1克温重。使用两类不同的纸浆有氧去木素后的牛皮纸软木纸浆和有氧去木素后的牛皮纸硬木纸浆。这些纸浆的性能见表6。表6去木素实验中使用的纸浆类型的性能
从纸浆去除的木素数量是在通过由烧结玻璃支持的WhatmanGF/C滤纸过滤从纸浆分离上清液后，测定上清液在300nm的吸收值确定的。A300测试的结果见表7。在此分析中，A300值大于等于0.2比背景水平明显地高。因此，此例显示酶在80℃具有显著的去木素活性。表7软木和硬木上，在pH6.0和9.0，80℃条件下测定的A300去木素作用 同pH6相比在pH9时活性的百分数方法2卡巴测试卡巴测试是根据TAPP1方法T236(来自TAPP1，TechnologyPark，Atlanta，USA)略加修改进行的。酶制剂以10×U/克纸浆(干重)的剂量加入并在pH9，80℃条件下温育两小时。作为对照不加酶的纸浆在相同的条件下温育相同的时间。使用有氧去木素的软木纸浆，其性能见表6。
加酶时的卡巴数和不加酶时的卡巴数之间的差别被称作卡巴差，是一个去木素化的数值。卡巴差见表8。在此分析中，大于等于0.5的数值明显地高出背景水平。因此如前面的实施例，此实施例显示了酶在80℃具有显著的去木素活性。表8在pH9和80℃条件下，在软木纸浆上以卡巴差测定的去木素化作用
实施例6编码热稳定F类木聚糖酶基因内部共有片段的克隆和序列测定6.1木聚糖酶基因内部片段的PCR扩增使用三条PCR引物来扩增木聚糖酶基因的内部共有片段两条不同的正向引物(xynFA；{5’CAC ACK CTK GTK TGG CA 3’，SEQID NO 1}和xynFB{5’CAT ACK TTK GTT TGG CA 3’，SEQ ID NO2}和一反向引物xynR{TMG TTK ACM ACR TCC CA，SEQ ID NO3}.xynFA和xynFB引物结合在相同位置，但由于在上游共有区域木聚糖酶基因序列的微小区别，此两引物在序列上稍有差异。PCR条件如下(94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟)×30。所有种类的F内部共有片段大约为350bp。6.2 PCR产物的序列测定所有内部木聚糖PCR产物(约350bp)按如下描述进行末端修补(尾部填平)，然后克隆到M13mp10测序载体的Smal位点(磷酸化酶处理过的)。步骤1-醋酸铵沉淀(a)以TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)将50μlPCR混合物补充至100μl。(b)加入100μl 4M醋酸铵和250μl100％乙醇。(c)于冰上放置15分钟(或-20℃过夜)。(d)16,000rpm离心15分钟弃上清。(e)以500μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。16,000rpm再离心5分钟并弃上清。(f)真空干燥沉淀5分钟，溶于20μlTE缓冲液中。步骤2 PCR片段的末端补平(a)于20μl沉淀DNA中加入3μl 10X连接酶缓冲液(BoehringerMannheim)，0.5μl(5单位)大肠杆菌DNA聚合酶大片段(Klenow)(BRL technologies Ltd)，0.25μl(2.5单位)T4 DNA聚合酶(BoehringerMannnheim)，0.25μl(2.5单位)T4多聚核苷酸激酶(BoehringerMannheim)和H2O至30μl。(b)37℃温育30分钟，于70℃温育10分钟以热灭活酶。步骤3末端补平的木聚糖酶片段的凝胶纯化(a)以2％LMP琼脂糖凝胶在1×Tris-醋酸缓冲液中电泳DNA。(b)从凝胶中切下350bp的木聚糖酶带。(c)利用Geneclean方法(Biolol Inc.)从凝胶中纯化DNA。步骤4连入M13mp 10(Smal-磷酸化酶处理过的)(a)混合1μl M13mp10载体DNA(约稀释至10ng/μl)，20-50ng插入DNA(木聚糖酶通用引物片段)，1μl10×连接酶缓冲液(BoehringerMannheim)，1μl T4 DNA连接酶(Boehringer)(b)室温过夜。步骤5连接混合物转化入大肠杆菌菌株TM101(a)利用Chung等(1989，Proc.Natl Acad.Sci.862172-2175)的DMSO介导的转化技术以整个10μl连接混合物转化JM101。(b)M13/JM101涂平板，利用标准程序筛选重组的M13质粒(Sambrooket al，1989，Cold Spring harbour Laboratory Press)。
含有内部木聚糖酶共有片段的重组M13噬菌体利用染料-引物化学(使用的测序引物是通用M13上游{染料-标记}引物，ABILtd)在Amplied Biosystems 373S自动DNA测序仪上从ssDNA进行测序。所有的DNA序列数据通过GCG序列分析软件(装于Irix上)进行分析和操作，此软件运行于Silicon Graphics Personal Iris Worksta-tion。F类木聚糖酶内部片段序列结果基于利用木聚糖酶通用引物从表1描述的六株菌株扩增的PCR片段，可以预测每种生物体都含有一至三系F木聚糖酶基因。已通过众所周知的引导程序分析(Wisconsin Molecular Biology Packege，Derverux，1984，Nucleic Acids Res.12，387-394)对结果进行了分析。图1中显示了各种木聚糖酶和菌株的树形图(dendogram)。从F类共有片段的核苷酸序列现在可以看出，每种生物体含有三种不同的F系基因。每种生物体的每一种F系木聚糖酶基因属于一个单独的木聚糖酶簇(基于核苷酸和一级氨基酸序列的同源性)，现称为A簇，B簇和C簇。从TG-456扩增出的全长木聚糖酶属于A簇，并在之后被命名为TG456 xynA。除此之外从TG456 B簇木聚糖酶(TG456 xynB)和C簇木聚糖酶(TG456 xync)已鉴定出一内部共有片段。
实施例7编码热稳定G类木聚糖酶基因的内部共有片段的克隆和序列测定7.1G类木聚糖酶基因的内部片段的正向PCR扩增G系内部共有片段(ICF)是利用正向逆向G属通用引物(GF和GR)通过聚合酶链式反应(PCR)分离出来的，PCR程序如下n.b.℃指摄氏温度X指循环数(例如×1等于一个周期)(94℃，4分钟)×1(94℃，1分钟；45℃，1分钟；72℃，6分钟)×35(94℃，1分钟；45℃，1分钟；72℃，6分钟)×1。
PCR是利用下面的试剂在50μl反应体系中进行的100ng GF引物；100ng GR引物；0.25mM dNTPS；1单位的Taq聚合酶；0.25mM氯化镁；10mM Tris-盐酸，pH8.8；50mM氯化钾；0.001％明胶；1-10ng模板DNA。
有两种引物被用来扩增木聚糖酶基因的共有片段GFTATNTGRSTNTMTATGGWTGG(正向内部通用引物)SEQ IDNO 4GRCCGCTNCTTTGGTANCCTTC(逆向内部通用引物)SEQ ID NO5。
对所有六株菌株发现用通用引物能扩增出一PCR片段。
扩增出了两种PCR产物(DNA片段)一预定大小的300bp片段，和一非预想的600bp PCR产物—此600bp片段是300bp PCR产物头尾相接的二聚体；可能此600bp片段是由于GF和GR引物间的同源性在PCR反应期间自身引导的结果。7.2 PCR产物的序列测定将从每种生物体扩增出的300bp片段未端补平(见实施例6)。
利用Geneclean(Bio 101，La JoHa，Calif)方法从1％的低溶点琼脂糖凝胶中纯化末端补平的片段(在Tris-醋酸电泳缓冲液中电泳)。
大约10ng末端补平的并经电泳纯化的300ICF在10μl反应体系中以BMT4DNA连接酶连接至M13mp 10的Smal位点。7.3 PCR产物的序列测定来自菌株TG457和TG53的六种不同的噬菌体被测序。从序列对照看出每一种菌株仅有一单一的G类木聚糖酶基因。除此之外对来自于TG453、TG456、TG479和TG631的含G系ICF的M13mp10重组体进行序列测定。这些生物体都包含了一编码基本上相同的木聚糖酶的G系木聚糖酶基因，虽然DNA序列中的变异率达13％。
实施例8全长F类木聚糖酶的序列基于内部PCR片段已鉴定出三种不同的F木聚糖酶基因xy-nA，xynB和xynC。
利用基因组步行PCR(GWPRCR)已从大多数菌株中分离出全长的木聚糖酶基因。
TG456 xynA基因的全长序列已被确定。SEQ ID NO 6给出了xynA基因的完整序列。SEQ ID NO7给出了TG456木聚糖A的编码氨基酸序列。
对xynB和xynC，发现基因编码含有一个木聚糖酶结构域的多结构域酶。这些木聚糖结构域已应用根据木聚糖结构域接界处序列设计的引物被亚克隆。SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 10分别给出了来自于TG 456的xynB和xynC基因的部分序列信息。SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 11分别给出了TG456木聚糖酶B和C的编码氨基酸序列。
实施例9G类木聚糖酶基因的全序列利用基因组步行PCR(GWPRCR)，全长xynD基因已从大多数菌株中分离出来。
SEQ ID NO 12给出了TG456 xynD基因的全序列，SEQ ID NO13给出了编码的TG 456木聚糖酶D的氨基酸序列。
实施例10构建用于从克隆基因产生木聚糖酶的表达载体和宿主在通用PCR引物中设计了合适的限制性酶切位点，它们使木聚糖酶基因能亚克隆到合适的表达载体中。
xynA和xynC基因以NcoI-BamHI插入pJLA 602表达载体中[Schauder，B.，Blucker，H.，Frank，R.，and McCarthy，J.E.G.(1987)。整合了大肠杆菌atpE转录起始区域的诱导型表达载体。Gene 52279-283])使之与λL和R启动子的阅读框架相符[Gibbs，M.G.，Saul D，J，Luthi，E.，and Bergquist，P.L.(1992)。来自“Caldocellum saccharolyticum”的β-甘露聚糖酶是多结构域酶的一部分。Appl.Environ Microbiol.58(12)3864-3867]。
将xynB和xynD基因插入pJLA602的单一SphI-BamHI位点。
利用标准转移技术将构建物转进宿主E.coli JM101和E.coliDH5α。
图3显示了以SphI-BamHI片段插入pJLA602的TG456的xynD木聚糖酶结构域的序列。
实施例11克隆的木聚糖酶的产生和回收为了从克隆的F-类木聚糖酶获得蛋白样品，大肠杆菌克隆于一10.0升容量的LH发酵罐中发酵(210系列)。培养物保持在30℃直至以连续通气(4.8升/分钟)、搅拌(5000rpm)和pH控制(pH7.1)下诱导(42℃)。使用的培养基和其它添加剂如下Luria培养液(用于接种培养)蛋白胨10克酵母提取物 5克氯化钠10克水 至1000毫升用于发酵罐发酵的BGM2大批生长培养基(所述量为最终培养基中的量，如8.5升两批)氯化铵 3.22克磷酸二氢钾 1.05克七水硫酸镁 0.135克硫酸钾 0.043克七水硫酸亚铁 0.003克SL-10微量元素1毫升蛋白胨10克酵母提取物 4.7克甘油 34ml水 至1000毫升含大约6升水的发酵容器在121℃高压消毒30分钟后，冷却到30℃。培养基浓缩液(8.5倍浓缩液)经过一消毒的0.2μm软滤膜(Sartorius)泵入发酵容器。接种前加入下列物质消泡剂(Bevaloid 5901) 10毫升(高压消毒)氯化钙(17毫克/毫升母液) 1毫升(高压消毒)氨苄青霉素 850毫克(过滤消毒)硫胺素(仅为JM101培养)8.7毫克(过滤消毒)然后调节液体体积至8.5升、调节培养基的pH至7.1。过滤消毒空气以每分钟4.8升的流速喷射入发酵罐。发酵罐的温度通过手指探头以热水和冷水循环控制在30℃。通过添加高压消毒的NaOH(5M)或H2SO4(2M)控制pH。发酵罐搅拌速度为500rpm。
用一等份(约10.0毫升)生长于含100μg/ml氨苄青霉素的Luria培养液中且OD 650达0.2至0.4的大肠杆菌克隆新鲜培养物开始接种。细胞于30℃生长至OD650达11至13之间，然后分批加入培养基浓缩液，并生长至OD650达14至16之间。随后升高温度至42℃进行诱导。
达到最大OD650后4小时收集细胞。通过中空纤维过滤(0.1μm，Amicon)回收细胞，并重新悬浮于50mM Tris-HCl(pH8.0)、7.5mM EDTA、7.5mMβ-巯基乙醇、0.02％PMSF、1.0μM胃酶抑制剂A 0.02％DNA酶和0.02％溶菌酶，于4℃温育一小时(总体积约为1升)。细胞以160毫升一个批次冰上超声波处理4至6分钟，超声波每次冲击1分钟直到细胞裂解(以显微镜监测)。超声波每处理两分钟加入一等份56mM PMSF(异丙醇中)(每一份相当于160μM)使最终浓度不超过1mM PMSF。裂解完全后，通过离心除去细胞碎片。上清于70℃热处理直至出现明显的蛋白沉淀(通常约20至30分钟)，并通过离心去除变性蛋白。苯琼脂糖层析之前，于热处理的上清中加入硫酸铵至终浓度为1.0M(这被称为1°热处理提取)。来自超声处理过细胞的细胞沉淀通过悬浮于1升50mMTirs-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，7mMβ-巯基乙醇，然后70℃15分钟进行第二次热处理而被再提取，通过离心再次去除沉淀的蛋白。发现这样能再提取20-40％的木聚糖酶，并被称为2°热处理提取。向2°热处理提取物中加入硫酸铵至1.0M，在苯琼脂糖分离之前把1°和2°热处理提取物合并。木聚糖酶活性用1.0M NaCl从1100毫升床体积的苯琼脂糖柱(以1.0M硫酸铵彻底洗涤并使回到基线)分步洗脱，洗脱的蛋白用YM3膜(Amicon)通过超滤浓缩和脱盐。制备物的最终浓度为25mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，7mM β-巯基乙醇，约250mM NaCl，20％甘油和0.05％叠氮钠。
G-类木聚糖酶的生产方法几乎和上述方法相同，除了在提取(pH8.0)和脱盐(pH7.3)步骤以HEPES缓冲液代替Tris-HCl。最终制备物的缓冲液组成为50mM HEPES，pH7.3，1mM EDTA，7mMβ-巯基乙醇，0.05％叠氮钠，20.0％甘油和±250mM NaCl。
总共获得足够纯度的六种F类制备物(5xynA和1xynB)及两种G类制备物。以标准的BCA方法(Pierce，Rockford，Illinois，USA)确定了F类和G类制备物的蛋白浓度。样品的纯度通过SDS-PAGE凝胶电泳做粗略估计(Phast-系统，Pharmacia，20％胶)，比较约40kDa处F-类带和约经25KDa G-类带同杂质带的宽度。样品的纯度介于20％至70％间(表9)。表9F-类和G-类木聚糖酶制剂的纯度
实施例12以克隆的F和G类木聚糖酶进行的ECF漂白结果ECF漂白是利用来自于一端典纸浆厂的有氧去木素牛皮纸浆进行的。软木(SW)纸浆的卡巴数值为16.0，硬木纸浆的卡帕数值为10.6。在表10所给条件下使用了XDED程序。表10漂白条件
x＝酶，D0，D1＝二氧化氯E＝用NaOH提取这些实验的结果列于表11。可以看出当在酶蛋白的基础上比较时，G-类木聚糖酶同F-类木聚糖酶相比作用更为显著。表11克隆的F类和G类木聚糖酶进行的ECF漂白
1-6)指六组独立实验。这些实验的参考ISO亮度值如下实验173.5；实验278.3；实验352.0；实验452.3；实验579.0；实验680.5。
实施例13克隆的G-类木聚糖酶的ECF剂量反应曲线利用实施例12中描述的相同的XDED漂白程序，改变两种G类木聚酶的剂量。结果见表12。每克纸浆1至3微克的剂量已可以使ISO亮度增加至少两个百分点。表12两种G-类木聚糖酶的剂量反应曲线
实施例14克隆的G-类木聚糖酶TCF漂白结果利用实施例15中描述(下面的)XQPP程序在PCF漂白中测定了两种G-类木聚糖酶。使用了有氧去木素硬木牛皮纸浆(每份样品30克o.d.)。G-类木聚糖酶的剂量如表13所示变化。表13给出了每份样品在X、P1和P2阶段后得到的ISO亮度。数值代表了双份样品的平均值。表13G-类木聚糖酶的TCF漂白-剂量反应实验
利用每克纸浆3和6微克蛋白重复实验。只测定了P2阶段后得到的亮度值。结果由表14给出。表14.G-类木聚糖酶的TCF漂白-剂量反应实验
实施例15包括纸张性能的ECF和TCF结果测定了木聚糖酶样品在对一瑞典纸浆厂提供的Kraft H/W和Kraft S/W纸浆ECF漂白和TCF漂白中的漂白效果。克隆的TG456xynD和TG53 xynD(在此实施例中分别指715和716)用“无酶”参照样品比较。在Lampen球磨中进行的磨浆测试显示715从整体水平看作用最好，在撕裂度指数上有较大提高并在抗张强度和耐破度指示上没有明显的降低。筛选方案硬木软木1.TCF RefQPP 1.TCF RefQPP2.Enz 715XQPP 2.Enz 715XQPP3.Enz 716XQPP 3.Enz 716XQPP4.ECF RefNoXDEDED 4.ECF RefNoXDEDED5.Enz 715XDEDED5.Enz 715XDEDED6.Enz 716XDEDED6.Enz 716XDEDED7.Chem Ref DEDED 7.Chem Ref DEDED未漂白纸浆的性能
测定的漂白参数TCF
ECF
漂白条件A)TCF H/W & S/W(两种纸浆的漂白条件相同)
B)ECF H/W
C) ECF S/W
上述试验中所得结果列于表15(硬木)和16(软木)中。表15硬木漂白结果一览表
表16软木漂白结果一览表
纸张性能的鉴定所有的程序完全漂白后，取30克样品在一Lampen球磨中精磨10,000、20,000和30,000个循环。测定Schoppen-Rieglers后制做约两克的纸张，以测定抗张强度指数、透气度、撕裂度指数和耐破度指数。纸张于23℃和50％相对湿度条件下放置24小时。得到的结果见图4-8。
实施例16TG456 xynD的最适pH，最适温度和热稳定性以斯卑尔脱燕麦木聚糖为底物按实施例2方法l所述测定活性。所有的分析于50mM磷酸缓冲液中在所示的pH和温度下进行。结果列于图9和图10。
TG456木聚糖酶D比参照酶Pulpzyme HB(Novo Nordisk)热稳定性好得多，并且最适pH稍高。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Gist-brocades B.V.
(B)街道Wateringseweg 1(C)城市Delft(E)国家荷兰(F)邮政编码2611 XT(ii)发明名称热稳定性木聚糖酶(iii)序列数13(iv)计算机可读形式
(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)AEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iii)反义无(vi)最初来源(C)单独分离xynFA(xi)序列描述SEQ ID NO1CACACKCTKG TKTGGCA(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑型线性
(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iii)反义无(vi)最初来源(c)单独分离物xynFB(xi)序列描述SEQ ID NO2CATACKTTKG TTTGGCA(2)SEQ IN NO3的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iii)反义是(vi)最实来源(C)单独分离物xynR(xi)序列描述SEQ ID NO3TMGTTKACMA CRTCCCA(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度21碱基(B0类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑型单链(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iii)反义无(vi)最初来源(C)单独分离物GF(xi)序列描述SEQ ID NO4TATNTGRSTN TMTATGGWTGG(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iii)反义是(vi)最初来源(C)单独分离物GR(xi)序列描述SEQ ID NO5CCGCTNCITT GGTANCCTTC(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征
长度1065碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iii)反义无(vi)最初来源(A)生物体Extremophile(C)单独分离物TG456(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置3…1058(D)其他信息/产物“木聚糖A”/基因＝xynA”(xi)序列描述SEQ ID NO6CC ATG GAC CTT TAT TCA ATC TCA GAT GAA AAT TGG GGG CAG CCT GTG47Met Asp Leu Tyr Ser Ile Ser Asp Glu Asn Trp Gly Gln Pro Val1 5 10 15CCT GAT TAT AAA CTG CCA TCA CTT TGT GAA AAG TAC AAA AAC TAT TTC 95Pro Asp Tyr Lys Leu Pro Ser Leu Cys Glu Lys Tyr Lys Asn Tyr Phe20 25 30AAG ATT GGA GTT GCT GTG CCC TAC AGG GCT CTG ACA AAT CCA GTT GAT 143Lys Ile Gly Val Ala Val Pro Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Pro Val Asp35 40 45GTG GAG ATG ATA AAA AGG CAT TTC AAC AGC ATA ACA CCG GAG AAC GAG 191Val Glu Met Ile Lys Arg His Phe Asn Ser Ile Thr Pro Glu Asn Glu50 55 60ATG AAA CCA GAG AGC CTT CAG CCT TAT GAA GGT GGT TTT AGC TTT AGC 239Met Lys Pro Glu Ser Leu Gln Pro Tyr Glu Gly Gly Phe Ser Phe Ser65 70 75ATT GCA GAT GAG TAT ATA GAT TTT TGC AAA AAG AAC AAT ATC TCA CTG 267Ile Ala Asp Glu Tyr Ile Asp Phe Cys Lys Lys Asn Asn Ile Ser Leu80 85 90 95CGA GGG CAC ACK CTT GTT TGG CAT CAG CAA ACC CCG AGC TGG TTC TTT 335Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Gln Gln Thr Pro Ser Trp Phe Phe100 105 110ACA AAT CCT GAG ACG GGC GAA AAA CTT ACT AAC AGT GAG AAG GAC AAG 383Thr Asn Pro Glu Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asn Ser Glu Lys Asp Lys115 120 125RAA ATA CTA TTG GAT AGG CTA AAG AAG CAC ATC CAG ACA GTT GTT GGC 431Xaa Ile Leu Leu Asp Arg Leu Lys Lys His Ile Gln Thr Val Val Gly130 135 140AGG TAT AAG GGG AAA GTA TAT GCA TGG GAC GTT GTG AAT GAG GCG ATT 479Arg Tyr Lys Gly Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Ile145 150 155GAT GAG AAT CAG CCG GAT GGG TAT AGA AGA AGT GAC TGG TAC AAT ATC 527Asp Glu Asn Gln Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Asp Trp Tyr Asn Ile160 165 170 175TTR GGA CCG GAG TAC ATT GAA AAG GCA TTT ATC TGG GCG CAT GAA GCA 575Xaa Gly Pro Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Phe Ile Trp Ala His Glu Ala180 185 190GAC CCG AAA GCA AAG CTT TTC TAC AAT GAC TAC AGT ACA GAA GAM CCA 623Asp Pro Lys Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Ser Thr Glu Xaa Pro195 200 205TAT AAA AGA GGG AAT TTA TAT ACA CTA ATT AAA AAY TTA AAA GCM AAA 671Tyr Lys Arg Gly Asn Leu Tyr Thr Leu Ile Lys Asn Leu Lys Ala Lys210 215 220GGT GTG CCA GTT CAT GGT GTT GGG CTT CAG TGT CAT ATT TCA CTT GAC 719Gly Val Pro Val His Gly Val Gly Leu Gln Cys His Ile Ser Leu Asp225 230 235TGG CCG GAT GTG AGT GAA ATC GAG GAG ACT GTC AAA TTA TTT AGC AGG 767Trp Pro Asp Val Ser Glu Ile Glu Glu Thr Val Lys Leu Phe Ser Arg240 245 250 255ATT CCA GGA CTT GAA ATA CAC TTC ACA GAA ATT GAT ATA AGT ATT GCT 815Ile Pro Gly Leu Glu Ile His Phe Thr Glu Ile Asp Ile Ser Ile Ala260 265 270AAA AAC ATG ACC GAT GAT GAT GCA TAT AAC CGC TAT CTT TTG ATT CAG 863Lys Asn Met Thr Asp Asp Asp Ala Tyr Asn Arg Tyr Leu Leu Ile Gln275 280 285CAG GCA CAA AAA TTA AAA GCA ATT TTT GAT GTT TTG AAA AAG TAC AGA 911Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ala Ile Phe Asp Val Leu Lys Lys Tyr Arg290 295 300AAT GTA GTT ACA AGT GTT ACA TTC TGG GGA CTG AAG GAT GAT TAC TCA 959Asn Val Val Thr Ser Val Thr Phe Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser305310 315TGG CTA CGG GGA GAT ATG CCA CTT TTA TTC GAT AAA GAC TAC CAG CCA 1007Trp Leu Arg Gly Asp Met Pro Leu Leu Phe Asp Lys Asp Tyr Gln Pro320 325 330 335AAG TTT GCG TTC TGG AGC TTA ATT GAC CCA TCA GTT GTC CCA AAA GAG 1055Lys Phe Ala Phe Trp Ser Leu Ile Asp Pro Ser Val Val Pro Lys Glu340 345 350TAATGGATCC 1065(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度351氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Asp Leu Tyr Ser Ile Ser Asp Glu Asn Trp Gly Gln Pro Val Pro1 5 10 15Asp Tyr Lys Leu Pro Ser Leu Cys Glu Lys Tyr Lys Asn Tyr Phe Lys20 25 30Ile Gly Val Ala Val Pro Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Pro Val Asp Val35 40 45Glu Met Ile Lys Arg His Phe Asn Ser Ile Thr Pro Glu Asn Glu Met50 55 60Lys Pro Glu Ser Leu Gln Pro Tyr Glu Gly Gly Phe Ser Phe Ser Ile65 70 75 80Ala Asp Glu Tyr Ile Asp Phe Cys Lys Lys Asn Asn Ile Ser Leu Arg85 90 95Gly His Thr Leu Val Trp His Gln Gln Thr Pro Ser Trp Phe Phe Thr100 105 110Asn Pro Glu Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asn Ser Glu Lys Asp Lys Xaa115 120 125Ile Leu Leu Asp Arg Leu Lys Lys His Ile Gln Thr Val Val 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Gly Pro Tyr Val Ser Arg Ile Thr Tyr Pro Phe Asn260 265 270GGT ATA GCA CTT TAT GCG AAC GGA GAT AGA GCA ACG GCA AAT GTA AAC 864Gly Ile Ala Leu Tyr Ala Asn Gly Asp Arg Ala Thr Ala Asn Val Asn275 280 285TTT TCA GCA AGC CGT AAC TAT ACT TTT AAA TTA CGT GGA TGT GGA AAT 912Phe Ser Ala Ser Arg Asn Tyr Thr Phe Lys Leu Arg Gly Cys Gly Asn290 295 300AAC AAT AAT TTG GCA TCA GTT GAT TTA CIG ATA GAT GGA AAG AAA GTA 960Asn Asn Asn Leu Ala Ser Val Asp Leu Leu Ile Asp Gly Lys Lys Val305 310 315 320GGT TCG TTC TAT TAT AAG GGA ACA TAT CCT TGG GAA GCY TCT ATA AAT1008Gly Ser Phe Tyr Tyr Lys Gly Thr Tyr Pro Trp Glu Ala Ser Ile Asn325 330 335AAT GTG TAT GTA AGT GCA GGT ACC CAC AGA GWG GAG CTT GTA CTT TCT1056Asn Val Tyr Val Ser Ala Gly Thr His Arg Xaa Glu Leu Val Leu Ser340 345 350GCT GAT AAT GGT ACA TGG GAT GTC TAT GCG GAT TAT TTG TTA ATA CAA1104Ala Asp Asn Gly Thr Trp Asp Val Tyr Ala Asp Tyr Leu Leu Ile Gln355 360 365TGAAATTCGG AAATGTTTTT AAAAATACTG CTTCGRAGAA GCAGGTATTT TTTTATGTTC 1164ACTATTATAA AGCGATTGAA GTCAGTCTTA GTTCATCCTA GTTGTTCTTC ARACCGRTCA 1224TAGCTGTTTC CKGCGCCATG 1244(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)长度386氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO13Lys Val Leu Leu Ala Ala Leu Met Cys Val Val Leu Ala Asn Pro Phe1 5 10 15Tyr Ala Gln Ala Ala Met Thr Phe Thr Ser Asn Ala Thr Gly Thr Tyr20 25 30Asp Gly Tyr Tyr Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Thr Gly Asn Thr Thr Met35 40 45Thr Val Asp Thr Gly Gly Arg Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Asn50 55 60Asn Ala Leu Phe Arg Thr Gly Lys Lys Phe Ser Thr Ala Trp Asn Gln65 70 75 80Leu Gly Thr Val Lys Ile Thr Tyr Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly85 90 95Asn Ser Tyr Leu Cys Ile Tyr Gly Trp Ser Arg Asn Pro Leu Val Glu100 105 110Phe Tyr Ile Val Glu Sar Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr115 120 125Ser Leu Gly Thr Val Thr Ile Asp Gly Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys130 135 140Thr Thr Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Glu Gly Thr Arg Thr Phe Asp145 150 155 160Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr165 170 175Val Thr Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Ala Lys Gly Leu Asn Leu Gly180 185 190Thr Ile Asp Gln Ile Thr Leu Cys Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly195 200 205Ser Ala Asn Ile Thr Gln Asn Thr Phe Thr Ile Gly Gly Ser Ser Ser210 215 220Gly Ser Ser Asn Gly Ser Asn Asn Gly Ser Asn Asp Gly Ser Asn Gly225 230 235 240Gly Thr Asn Ala Gly Ile Ser Thr Ala Ser Arg Ile Glu Cys Glu Ser245 250 255Met Ser Leu Ser Gly Pro Tyr Val Ser Arg Ile Thr Tyr Pro Phe Asn260 265 270Gly Ile Ala Leu Tyr Ala Asn Gly Asp Arg Ala Thr Ala Asn Val Asn275 280 285Phe Ser Ala Ser Arg Asn Tyr Thr Phe Lys Leu Arg Gly Cys Gly Asn290 295 300Asn Asn Asn Leu Ala Ser Val Asp Leu Leu Ile Asp Gly Lys Lys Val305 310 315 320Gly Ser Phe Tyr Tyr Lys Gly Thr Tyr Pro Trp Glu Ala Ser Ile Asn325 330 335Asn Val Tyr Val Ser Ala G1y Thr His Arg Xaa Glu Leu Val Leu Ser340 345 350Ala Asp Asn Gly Thr Trp Asp Val Tyr Ala Asp Tyr Leu Leu Ile Gln355 360 36权利要求
1.一种木聚糖酶，其特征在于它在80℃或更高温度下具有显著的去木素活性。
2.根据权利要求1的木聚糖酶，其在80℃和pH9.0下半衰期大于10分钟。
3.根据权利要求1的木聚糖酶，其特征在于a)该木聚糖酶为G-类木聚糖酶，并且b)该木聚糖酶来自于一最适生长温度超过65℃的嗜热微生物。
4.根据权利要求3的木聚糖酶，其特征在于该嗜热微生物是厌氧的。
5.根据权利要求3的木聚糖酶，其特征在于其氨基酸序列与SEQ ID NO 13的氨基酸序列有至少70％的一致率。
6.根据权利要求3的木聚糖酶，其特征在于该木聚糖酶在80℃和pH7.0条件下半衰期大于10分钟。
7.根据权利要求3的木聚糖酶，其特征在于该木聚糖酶在65℃和pH9.0条件下半衰期大于10分钟。
8.根据前述权利要求中任一项的木聚糖酶，其特征在于该木聚糖酶来源于选自以下列保藏号保藏的菌株CBS 211.94，212.94，213.94，214.94，215.94和216.94。
9.一种分离和纯化的DNA序列，其特征在于它编码前述权利要求任何一项中的木聚糖酶的至少一部分。
10.一种载体，其特征在于它含有权利要求9的DNA序列。
11.一种微生物宿主细胞，其特征在于它被权利要求10的载体所转化。
12.一种分离的微生物，其特征在于其为厌氧和嗜热细菌并具有如下保藏号CBS 211.94，212.94，213.94，214.94，215.94或216.94。
13.一种制备木聚糖酶的方法，其特征在于通过培养权利要求12中任何一种保藏的微生物或通过在一合适的培养基中培养权利要求11的转化的宿主细胞，然后再回收具有所述活性的酶可获得该木聚糖酶。
14.一种降解木聚糖的方法，其包括利用根据权利要求13定义的方法获得的木聚糖酶。
15.根据权利要求14的方法，其中在80℃和更高温度下使用该木聚糖酶。
16.一种木材纸浆去木素的方法，其特征在于在80℃或更高温度下使用一种木聚糖酶。
17.一种木材纸浆去木素的方法，包括使用根据权利要求13定义的方法获得的木聚糖酶。
18.根据权利要求16的方法，其中在80℃或更高温度下使用该木聚糖酶。
19.根据权利要求16至18任何一项的方法，其特征还在于在有氧去木素步骤之前或期间使用该木聚糖酶。
20.利用权利要求16至19任何一项的方法在处理木材纸浆后获得的产品。
全文摘要
本发明公开了具有木聚糖酶活性的酶。该木聚糖酶的特征在于它们在80℃或更高温度下有活性。这些酶可从厌氧嗜热细菌获得，适用于纸张和纸浆的生产工艺中。本发明还描述了从所保藏菌株获得的具有木聚糖酶活性之基因的克隆和表达。
文档编号C12S3/08GK1143387SQ95190553
公开日1997年2月19日 申请日期1995年6月14日 优先权日1994年6月14日
发明者V·格罗比尔, S·福斯特, D·穆德, D·P·威廉斯, S·艾弗森, R·L·法里尔, P·L·伯奎斯特, R·M·丹尼尔, H·W·摩根, W·J·奎克斯, M·A·赫威尔, B·E·琼斯 申请人:吉斯特·布罗卡迪斯股份有限公司