转化植物中的蜡酯的制作方法

专利名称：转化植物中的蜡酯的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物酶，纯化和得到这类酶的方法，与这类酶有关的氨基酸序列和核酸序列，以及应用这类组合物的方法，尤其是应用这类组合物在植物细胞中生产蜡酯的方法。
随着植物基因工程技术的发展，使得有可能转化和再生各种植物品种以提供具有新的和所需的特性的植物。这种植物基因工程技术的一个令人感兴趣的应用领域是在植物组织中生产有价值的产物。这种应用需要在转化过程中使用各种DNA构建物和核酸序列以产生能生产所需产物的植物。例如，需要植物功能性启动子以进行基因序列的合适表达，这种表达可以在整个植物中或在选定的植物组织中进行。另外，通常还使用选择性标记序列以确定转化的植物材料。这种植物启动子和选择性标记提供了获得新型植物有用的工具。
脂肪酸是具有约4-24个碳原子的烃链的有机酸，已知许多链长、双键的存在与否、双键数和双键位置均不同的各种脂肪酸。在细胞中，脂肪酸典型地以共价结合的方式存在，羧基部分是指脂酰基团。这些分子的链长和饱和度通常由式CXY表示，其中“X”是指碳原子数，“Y”是指双键数。
脂酰基因是许多脂类的重要组分，其长的非极性烃链决定了这些脂类分子的水不溶性。脂酰基与其它因子的共价结合类型可以各不相同，例如，在生物合成反应中，根据特定的酶反应，其可通过硫酯键共价结合于酰基载体蛋白(ACP)或辅酶A(CoA)。在蜡中，脂酰基通过酯键与脂肪醇连接，三酰甘油具有3个通过酯键连到甘油分子上的脂酰基。
已经研究了许多以主要由长链(具有16或18个碳原子)脂酰基组成的三酰甘油作为脂类贮存的植物。非常长的长链(具有20-24个碳原子)的单不饱和酯酰基是由酰基-CoA延伸反应从C181形成的，其见于许多植物种子中，特别是十字花科的成员。
沙漠灌木希蒙得木，通常称为希蒙得木，在高等植物(具种子植物)中以其生产并贮存大量脂蜡作为其种子贮存脂类的主要组分的能力而很不寻常。这些简单的蜡化合物是非常长长链单烯脂酰基和醇的氧酯(Oh lrogge et al.Lipids(1978)13203-210)。国际申请WO 93/10241，1993年5月27日公布，描述了在植物细胞中与还原酶一起表达蜡合成酶以生产蜡酯的方法。在1992年9月3日公布的WO 92/14816中公开了希蒙得木脂酰还原酶的核酸序列。
许多其它的生物也由醇和酰基底物产生蜡酯，例如，植物产生表皮蜡(Kolattukudy(1980)in The Biochemistry ofPlants(Stumpf，P.K andConn，E.E.，eds.)Vol4，P.571-645)。已报道许多细菌如不动杆菌(Fixter et al.(1986)J.Gen.Microbiol.1323147-3157)和微球菌(Lloyd(1987)Microbios 5229-37)，以及单细胞生物裸藻属(Khanand Kolattukudy(1975)Arch.Biochem.Biophys.170400-408)均能产蜡。另外，在牛睑板腺(Kolattukudy et al.(1986)J.Lipid Res.27404-411).尾脂腺的微粒体制剂以及各种昆虫和海洋生物中均有报道产蜡。
这些蜡的组成和生物合成途径可能与希蒙得木种子蜡的不同。对于希蒙得木，推测非常长长链脂酰COA还原至相应的醇取决于单一的一种酶，该酶的活性已在发育的希蒙得木种子的粗提物中观察到(Pollard et al.(1979)Lipids 14651-662；Wu et al.(1981)Lipids 16897-902)。作为比较，对于植物表皮蜡的形成，已报道了二步过程(Kolattukudy(1980)in The Biochemisrty of Plants(Stumpf，P.K.and Conn，E.E.，eds)Vol 4，P.571-645)，通过NADH依赖的还原酶的作用脂酰CoA转化成自由醛，然后通过NADPH依赖的脂肪醛还原酶的作用形成醇。
Wikdner和Hallick报道了具有脂酰CoA还原酶活性的裸藻的多酶复合体的加溶性(Abstract from The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting，April 22-24，1990，Las Cruces，NM)。在裸藻属贮存蜡的形成过程中，醇部分是由脂酰CoA还原酶催化的脂酰基化合物的NADH依赖的还原作用形成的。附图的简要说明

图1提供了希蒙得木脂酰还原酶的核酸序列和翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO19)。
图2为再合成的希蒙得木脂肪酸还原酶的核酸序列和翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO20)。
图3为pCGN7677转化的reston植物的转基因油的高温气相色谱比较，是根据痕量希蒙得木油和对照reston植物油作出的。
本发明概述本发明提供了在植物细胞中生产蜡酯的方法，包括培养具有从与所述植物不同源的序列表达的脂酰还原酶的植物细胞的步骤。在本发明之前尚不知道可以在由与一植物不同源的序列表达的蜡合成酶不存在下在该植物细胞中生产蜡酯。
植物细胞优选在该植物中有功能的调节因子的控制下进行培养，所述植物细胞具有由重组构建物表达的还原酶，该重组构建物包括编码希蒙得木脂酰还原酶的核酸序列。表达希蒙得木还原酶并产生蜡酯的十字花科植物种子细胞的具体例子为芥属和拟南芥细胞。因此，本发明可用于在不天然产生蜡酯的植物细胞中生产蜡酯。
在表达所述还原酶序列的细胞中产生蜡酯的机制还不清楚。有可能非希蒙得木细胞的植物细胞含有一些能从由还原酶产生的脂肪族醇和植物细胞内源的脂酰基底物合成蜡酯的能力。本文还描述了确定植物细胞含有蜡合成能力的方法。
本发明所用的还原酶可对各种脂酰基底物具有活性，包括酰基CoA和酰基ACPs。这些底物的碳链长度可以变化，尽管一给定的还原酶优选一特定链长的酰基底物或者根据优选的碳链长度可以有较宽范围的酰基底物。举例性的还原酶序列是从希蒙得木得到的长链脂酰还原酶，当然还提供了使用其它脂酰还原酶在植物细胞中生产蜡酯的方法。
希蒙得木油已被用来作为适合于极端压力条件下的鲸油的替代品，一部分原因是这种目的的常用油鲸油的进口受到限制。希蒙得木油含有超过97％的蜡酯，不含三酰甘油酯。鲸油含相当量的三酰甘油酯，多至总脂类的20％或更多。本发明使得能够避开在种植希蒙得木收获种子的尝试中遇到的许多困难。
本发明提供了一种新的植物油和新的蜡组合物。提供的蜡组合物含有的蜡酯组分多达总脂类的约7％，其余为三酰甘油酯。或者是，本发明提供了一种蜡酯组合物，其中的主要蜡组分为长链44∶2蜡酯，该44∶2蜡酯可多达蜡组合物的约60％或更多。
根据脂肪族醇和脂酰基的链长和饱和度，蜡酯的性质将发生变化。本领域普通技术人员会认识到存在着若干可用来生产含各种所需蜡酯产物的植物细胞的机制。由宿主植物细胞提供的底物的改变是改变由该细胞产生的蜡酯的一个途径，然而，通过改变希蒙得木还原酶编码序列的特异性或通过使用不同来源的还原酶编码序列，所述细胞产生的蜡酯也可以改变。
另外，例如当植物细胞不含希蒙得木还原酶的内源长链脂酰基底物时，或当植物宿主细胞不具备对由希蒙得木还原酶产生的长链脂肪族醇有活性的蜡合成能力时，可能必须使用一种另外的还原酶编码序列。结果是，根据宿主细胞提供的底物和活性及还原酶，本发明提供了具有各种性质的蜡酯。
还原酶编码序列的潜在来源可通过其产生脂肪族醇或蜡酯的能力来确定。描述了可用来从本文举例性的还原酶蛋白氨基酸序列得到并鉴定其它序列的方法。描述了用于分离其它还原酶序列以及在重组构建物中用于还原酶核酸序列的转录和/或在宿主细胞中表达还原酶蛋白的结构基因序列的用途。还描述了与还原酶蛋白有关的其它核酸序列的用途，如5′端和3′端非编码区的用途。
在本发明的另一方面还涉及含有本发明蜡酯的细胞。可例举的是含有希蒙得木还原酶的优选底物的细胞，如在某些十字花科植物的胚中的那些细胞。蜡酯以多达约7％的水平作为种子细胞的总脂类的一个组分而存在。本发明的详细描述脂酰还原酶，或称“还原酶”具有催化脂酰基还原成相应的醇的活性。作为参考文献的US专利申请07/659,975(申请日为1991年2月22日)(其继续申请为08/149,007(申请日为1993年11月8日))、07/767,251(申请日为1991年9月27日)和07/920,430(申请日为1992年7月31日)涉及这类还原酶蛋白。在作为本文的参考文献的PCT申请WO92/14816(公布日为1992年9月3日)中也提供了希蒙得木还原酶的信息，其中包括核酸编码序列。用于本发明的脂酰还原酶包括具有催化脂酰基还原成相应的醇的活性的任何氨基酸序列，如蛋白质、多肽或肽片段。脂酰基可以是共价结合于诸如ACP或辅酶A的载体的任何脂酰基。
通过本发明，证实了异源脂酰还原酶蛋白可以在植物细胞中表达以生产蜡酯。植物细胞中蜡酯的生产使得由异源于所述植物的序列表达的蜡合成酶不表达。既然例举的十字花科植物细胞已通过本方法表达了长链蜡酯，对还原酶蛋白的进一步的研究可以是位点特异性诱变研究以进一步确证及改进其催化性质或改变其酰基底物特异性。具有改变的底物特异性的还原酶可以与其它FAS酶结合应用，例如，一种优选中链(C12-C14)的植物硫酯酶(见US专利申请07/662,007)和一种合适的酰基转移酶可与一种改变的还原酶结合使用以生产中链醇，该中链醇随后可通过宿主植物细胞内源的蜡合成活性转化成中链蜡酯。
另外，已认识到用于纯化希蒙得木还原酶的方法现可用于纯化来自其它生物体的类似的膜结合酰基CoA还原酶，该酶随后可类似地被用于在植物宿主细胞中生产蜡酯。以这种方式可获得各种具有一定范围的底物优选性或特异性的还原酶。这类酶所希望的来源为不动杆菌、微球菌和绿藻(裸藻属)。
可使用各种方法回收得到大体上纯的还原酶蛋白，例如，可进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并将蛋白转移至膜支持物如硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)上，随后可获得含鉴定蛋白的膜组分，该鉴定蛋白基本上不含其它蛋白，使用本领域已知的并在下述实施例中描述的技术，可将蛋白从膜上移走并进行进一步操作以确定其氨基酸序列。
例如，氨基酸序列可通过从整个蛋白的N末端氨基酸区开始测序而确定，或通过用化学溴化氰消化或使用蛋白酶酶解来制备所需蛋白的片段来确定。有用的蛋白酶的例子包括内切蛋白酶lysC、gluC、AspN和胰蛋白酶。以这种方式得到的片段随后可经纯化并根据本领域人员熟悉的方法进行测序。
为了提供在药品、化妆品、洗涤剂、塑料中有用的酰基醇产物并且获得润滑油，也希望在植物细胞中表达还原酶蛋白。如本文所述，在转基因的芥属和拟南芥植物中表达希蒙得木还原酶能够在这些植物的种子中产生长链蜡酯，该蜡酯通过已知的皂化作用或转酯作用可很容易地转化为相应的脂酰醇和脂酰基底物。
在一些情况下，例如在利用其它的还原酶来源时，可能必须使用不同的操作以在细胞中表达还原酶活性，例如，可能需鉴别负责膜插入的前导肽并制备只含成熟还原酶编码序列的构建物。本发明的还原酶核酸可以是基因组的或cDNA，并且可从cDNA或基因组文库中分离或者直接从分离的植物DNA中分离。当蛋白分离后和/或该蛋白的氨基酸序列得到后分离基因序列的方法是本领域人员公知的。
例如，可制备该分离蛋白的抗体用于筛选表达文库，由此鉴定产生植物酰基还原酶蛋白或其抗原性片段的克隆。或者，可从氨基酸序列合成寡核苷酸并用于分离核酸序列。该寡核苷酸可用于PCR以产生核酸片段，该核酸片段随后可用于筛选cDNA或基因组文库。在一不同的方法中，该寡核苷酸可直接用于分析Northern或Southern印迹以确定合适的探针以及这些寡核苷酸可用于筛选cDNA或基因组文库的杂交条件。
本发明中可举出的酰基还原酶核酸序列的例子包括那些对应于希蒙得木酰基CoA还原酶蛋白的序列，以及由希蒙得木蛋白或核酸序列得到的序列。“对应于”是指核酸序列，为DNA或RNA，包括那些编码希蒙得木酰基还原酶蛋白或其一部分的序列。即在所述编码序列的5′或3′端发现的能指导在希蒙得木胚中还原酶的转录或转录和翻译(表达)的调节序列、在cDNA中不存在的内含子序列以及编码在插入内质网膜时所需的但在成熟或加工后的酰基还原酶中末发现的还原酶蛋白前体的任何前导肽或信号肽的序列。
从希蒙得木序列或蛋白中“可获得的”序列是指与所需脂肪酸还原酶蛋白有关的任何核酸序列，该所需的脂肪酸还原酶蛋白可以是由希蒙得木酰基还原酶氨基酸序列合成的，或者在不同的生物体中鉴定的并用希蒙得木还原酶核酸序列或用由希蒙得木还原酶蛋白制备的抗体作为探针分离的。以这种方式，可以看出使用希蒙得木序列由核酸杂交或抗原性方法从所希望的生物体中分离的其它酰基还原酶的序列可以类似地用于分离另外其它的酰基还原酶。这类由通过希蒙得木还原酶分离的种子植物还原酶衍生的还原酶在本文中也可被认为是“可获得的”。
为分离核酸序列，可以本领域公知的质粒或病毒载体和技术制备cDNA或基因组文库。可用于筛选所需序列的有用的核酸杂交和免疫学方法也是本领域人员公知的并描述于如Maniatis，et al(Molecular CloningA Laboratory Manual，Second zEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。
典型地，由使用核酸探针得到的序列在靶序列和给定的编码感兴趣的酰基还原酶的序列之间显示60-70％的序列同一性，然而也可能获得序列同一性小至50-60％的长序列。核酸探针可以是核酸序列的较长的核酸片段，或者也可以是较短的寡核苷酸探针。当采用较长的核酸片段作为探针时(大于约100bp)，可以以较低的严格性从与用作探针的序列有20-50％偏差(即50-80％序列同源性)的靶样品中得到序列。寡核苷酸探针可以比编码酰基还原酶的完整核酸序列短得多，但至少应具有约10个、优选至少约15个、更优选至少约20个核苷酸。当使用较短区时，与使用较长区相反，希望有较高程度的序列同一性。因此希望的是确定氨基酸序列同一性高的酶活位点以设计用于检测同源基因的寡核苷酸探针。
为确定一相关基因是否可通过与给定序列的杂交而得以分离，通常用放射活性标记序列以便检测，当然也可使用其它方法。标记的探针加到杂交溶液中，与Northern或Southern印迹的含有所需核酸的滤膜一起温育(以筛选所需的来源的同源性)，或与含待筛选的cDNA或基因组克隆的滤膜一起温育。可以改变杂交和洗脱条件以优化探针与所感兴趣的序列的杂交。较低的温度和较高的盐浓度允许较少相关性序列的杂交(低严格性)。如果在低严格性条件下背景杂交成为一个问题，可以在杂交或洗脱步骤升高温度和/或降低盐浓度以改善对特异杂交序列的检测。如Beltz，et al.(Methods in Enzymology(1983)100266-285)所述，根据估计的探针解链温度可调节杂交和洗脱温度。
如上所述确定有用的探针和合适的杂交和洗脱条件后，使用标记序列和优化条件筛选cDNA或基因组文库。文库先在固体琼脂培养基上铺板，将DNA转移至合适的膜上，通常为硝酸纤维素或尼龙滤膜，然后如上述将这些滤膜与标记探针杂并洗脱以确定含相关序列的克隆。
对于免疫学筛选，可通过将纯化的蛋白注射入兔或大鼠中来制备希蒙得木酰基还原酶的抗体，这种制备抗体的方法是本领域人员公知的。可生产单克隆抗体或多克隆抗体，而通常多克隆抗体在基因分离中更有用。
为筛选所希望的植物种类，进行Western分析以确定相关蛋白存在于所希望的植物的粗提物中，并确定与希蒙得木还原酶抗体有交叉反应。这通过以下方法得以实现，将植物抽提蛋白固定于膜上，通常为硝酸纤维素膜，然后电泳，并与抗体一起温育。许多不同的用于在硝酸纤维素滤膜上检测抗体/蛋白复合物的系统是可购得的，包括抗体的放射标记和第二抗体/酶缀合系统。Oberfelder(Focus 1989)BRL/Life Technologies，Inc.111-5)描述了一些有用的系统。当观察到交叉反应性时，通过筛选代表所希望的植物种类的表达文库分离编码相关蛋白的基因。如Maniatis，et al(如上所述)所述，可在各种商购可得的载体，包括lambda gtll中构建表达文库。
如上所述用DNA杂交或免疫学筛选技术鉴定的克隆随后被纯化并提取DNA，用已知技术进行分析。以这种方式证实了所述的克隆编码一相关的酰基还原酶蛋白。使用这些还原酶以与使用希蒙得木还原酶相同的方式可以得到其它种子植物的脂酰还原酶。
本领域普通技术人员会认识到使用位点特异性诱变或PCR标准技术可以修饰本发明的酰基还原酶核酸序列，或者通过产生一合成核酸序列而完成对所述序列的修饰。这些修饰后的序列也被视为本发明的酰基还原酶核酸序列。例如，可以如此地改变密码子中的摆动位置以使得核酸序列编码相同的氨基酸序列，或者，可改变密码子以产生保守的氨基酸取代。在每种情况下，肽或蛋白还保持所希望的酶活力并因此被认为也是本发明的一部分。
本发明的酰基还原酶的核酸序列可以是由基因组DNA、cDNA、mRNA衍生的DNA或RNA序列，或者可以全部合成或部分合成。例如，通过从合适的来源分离基因组DNA，并用聚合酶链反应(PCR)扩增和克隆感兴趣的序列，可以克隆所述的基因序列。或者，可以全部或部分合成所述的基因序列，特别是在希望提供植物优选的序列的情况下。这样可以使用由一选定的宿主优选的密码子合成所希望的结构基因的全部或一部分(编码还原酶蛋白的那部分基因)。宿主优选的密码子可通过例如在所希望的宿主种类中表达的蛋白中最常用的密码子而加以确定。其中一个这种途径是再合成希蒙得木还原酶编码序列以降低AT组分，在希蒙得木还原酶编码序列的某些区域AT的使用量多达75％左右，平均超过57％。再合成的编码序列优选含有一相对均一的AT组成，即小于55％，最优选为51％或更低。
编码本发明的脂酰还原酶的DNA序列可以各种方式与外来DNA序列结合。“外来”DNA序列是指未发现天然与还原酶结合的任何DNA序列，所述的结合包括与来自同一生物体的DNA序列的未发现天然结合在一起的结合。例如，希望的是将编码一过渡肽的序列与本发明的还原酶序列结合。以这种方式，还原酶可以被定位于叶绿体，叶绿体中具备脂酰基底物，尤其是脂酰基ACPs。还希望的是导入来自希蒙得木脱饱和酶基因组DNA或其它植物基因组DNA的内含子，作为在特定植物细胞中提供表达水平的手段。来自在种胚细胞中正常表达的序列的内含子，如来自脱饱和酶或napin基因组序列的内含子是适用的。
编码本发明的酰基还原酶的DNA序列可与正常与还原酶结合的基因序列的全部或部分一起应用。在其组成上，一个编码还原酶的DNA序列结合成具有如下组分的重组构建物，即在5′→3′的转录方向上，具有能在宿主细胞中启动转录和翻译的转录起始调控区，编码还原酶的核酸序列以及一转录终止区。
根据宿主的不同，调节区将会不同，包括来自病毒、质粒或染色体基因等的区域。为在原核或真核微生物，特别是单细胞宿主中表达，可采用各种组成型或可调节启动子。在微生物中表达可以提供一植物酶的稳定来源。在已描述的转录起始区中包括来自细菌和酵母宿主如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母的区域，包括诸如β-半乳糖苷酶、T7聚合酶、色氨酸E等基因。
重组构建物的大部分是涉及用来产生酰基还原酶的在植物中起功能的调节区。编码植物还原酶或其功能片段的开放读框在其5′端与转录起始调节区相连。翻译起始区也是所希望的，并可来自还原酶cDNA序列的5′非编码区或与构建物的转录起始区天然结合的翻译起始区。转录和翻译调节区合起来通称为启动子，大量的启子区是可得到的，其能在植物中提供结构基因的各种组成型或可调节例如可诱导的表达。
已知对在植物中提供组成型基因表达有用的序列是与农杆菌属基因有关的调节区，如用于胭脂氨酸合成酶(Nos)、甘露氨酸合成酶(Mas)或章鱼氮酸合成酶(Ocs)的调节区，以及用于表达病毒基因的区域如花椰菜花叶病毒(Ca MV)的35S和19S区。本文中所用的组成型并非必须是指一个基因在所有细胞类型中均以相同水平表达，而是指尽管经常能检测到在丰度上的某些变化，但是基因能在很宽范围的细胞类型中表达。其它有用的转录起始区优选用于在一定的组织中或在一定的生长条件下提供转录，如来自napin、种子或叶ACP的区域，RUBISCO的小亚基等。
使用完整植物酰基还原酶的全部或部分可根据需要变化，即可采用5′上游非编码区(启动子)和结构基因序列以及3′下游非编码区。例如，由于现已知道希蒙得木还原酶cDNA，所以可利用PCR或杂交技术得到用于希蒙得木基因组DNA的与还原酶结构基因结合的启动子。如果需要一不同的启动子，如感兴趣的植物宿主中天然的启动子或一修饰的启动子，即具有一种基因来源的转录起始区和另一种基因来源的翻译起始区，或者增强启动子如双35S CaMV启动子，则可利用标准技术将序列结合在一起。
当5′上游非编码区是从在种子成熟过程中受调控的其它基因中得到时，需要的是那些优先在植物胚组织中表达的区域，如APC和napin衍生的转录起始调控区。这类“种子特异性启动子”可根据下列专利申请所述得到并应用，这些专利申请均作为本文的参考文献，它们是US Serial No.07/147,781，申请日为1988年1月25日(现为USSerial No.07/742,834，申请日为1991年8月8日)，以及US SerialNo.07/494,722，申请日约在1990年3月16日，名称为“在早期种子发育中优先表达的新序列及其相关方法”。在种子组织中优先表达的转录起始区在生产脂肪醇中是希望的，其可以最大限度地降低基因产物在其它植物部分中的破坏作用或副作用。
在本发明的重组构建物中也可以设有调节转录终止区。转录终止区可来自编码植物酰基还原酶的DNA序列，或由其它基因来源衍生的合适的转录终止区，特别是与转录起始区天然结合在一起的转录终止区。转录终止区典型地含有结构基因3′端以外的至少约0.5kb，优选约1-3kb序列，所述的终止区由该结构基因衍生。
具有植物酰基还原酶作为用于表达的感兴趣的DNA序列的植物表达构建物可与各种植物一起使用，特别是产生非常长长链脂酰基CoA分子的植物如芥属植物，特别是油菜子的高芥酸变种。其它感兴趣的植物产生希望的底物如中链或长链脂酰基分子，并包括但不限于油菜子(Canola变种)、拟南芥、向日葵、红花、棉花、萼距花、大豆、花生、椰子和油棕榈，以及玉米。根据将DNA表达构建物导入宿主细胞的方法不同，可能需要其它DNA序列。重要的是，本发明同时适用于双子叶植物和单子叶植物，并且容易地适用于新的和/或改进的转化和再生技术。
转化方法对于本发明不是关键性的，可使用各种通用的植物转化方法。当出现更新的转化作物的方法时，其可直接用于本文以下所述步骤。例如，许多对农杆菌侵染天然易感的植物种类可通过三分交配或农杆菌介导的转化的二分载体方法得以成功地转化。用于将核酸序列向宿主植物细胞转移的其它序列可以从植物致病病毒或植物转座因子中衍生。另外，已开发出微注射、DNA颗粒轰击、电穿孔技术，这些技术能够用于各种单子叶和双子叶植物的转化。
在开发重组构建物中，构建物的各种组分或其片段将正常地插入到一合适的克隆载体中，该载体能够在细菌宿主如大肠杆菌中复制，在文献中已描述了许多载体。每次克隆后，可提取质粒并进行进一步操作，如限制性酶切、插入新片段、连接、缺失、插入、再分(resecfion)等，以便加入所需序列的各组分。当构建物完成后，根据宿主细胞的转化方式可将构建物转移至合适的载体进一步操作。
通常重组构建物包括具有用于在宿主中表达的必须调节区以及提供用于选择转化细胞的结构基因。该基因可提供对细胞毒性制剂如抗生素、重金属、毒素等的抗性，向提供缺陷型宿主提供原养性的互补作用，病毒免疫性等。类似地，编码下述酶的基因也是有用的，所述的酶用于生产可由颜色变化鉴别的化合物，如GUS，或用于生产由发光鉴别的化合物，如萤光素酶。根据表达构建物被导入的各种不同的宿主，可采用一或多个标记用于选择或检测转化的组织，对于不同的宿主用不同的选择条件。
当用农杆菌进行植物转化时，希望的是由T-DNA在一端或两端界定核酸序列，特别是左和右边界区，更特别是右边界区。当采用其它转化方法时这些边界区也可能是有用的。
当农杆菌或根花植物序列用于植物转化时，可采用一种如下的载体，该载体可被导入到农杆菌宿主中用于与宿主中存在的Ti或Ri质粒上的T-DNA同源重组。Ti或Ri含有的用于重组的T-DNA可以有臂(能形成gall)，或无臂(不能形成gall)，只要在转化的农杆菌宿主中存在编码DNA向植物宿主细胞中转移必须的反式作用因子的vir基因的功能性互补作用，则后者是可允许的。使用有臂的农杆菌菌株能产生正常植物细胞和由于存在肿瘤形成基因而能形成gall的植物细胞的混合物，其中的一些正常植物细胞含有所需的核酸序列。可从混合物中选出含有所需的核酸序列但不合肿瘤基因的细胞，从而获得正常的转基因植物。
在一优选的方法中，该方法使用农杆菌作为转化宿主植物细胞的载体，由T-DNA边界区界定的表达或转录构建物被插入到能在大肠杆菌和农杆菌中复制的宽宿主范围的载体中，文献中描述了宽宿主范围的载体。常用的是pRK2或其衍生物，例如，见Ditta，et al；(Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A(1980)777347-7351)以及EPA0120515，这些均作为本发明的参考文献。或者，可以将要在植物细胞中表达的序列插入到含有独立的复制序列的载体中，其中一个独立的复制序列在大肠杆菌中稳定载体，另一个在农杆菌中稳定载体，例如见Mc Bride和Summerfelt(Plant Mol.Biol.(1990)14269-276)，其中采用了复制的pRi HRI(Jouanin，et al.，Mol.Gen.Genet.(1985)201370-374)起点并为植物表达载体提供了在宿主农杆菌细胞中的增加的稳定性。
优选使用上述能在农杆菌中复制的载体。以这种方式不需质粒的重组，宿主农杆菌vir区能提供T-DNA界定的序列向植物宿主细胞转移所需的反式作用因子。
对于芥属细胞的转化，例如，可采用农杆菌转化方法。Radke et al描述了其中一种方法(Theor.Appl.Genet.(1988)75685-694).
提供了确定植物细胞蜡合成活性的方法。举例性的是芥属(canola和高芥子酸油菜子(HEAR))和拟南芥的胚的检测，证实与希蒙得木胚相比每种均含有相对较低水平的蜡合成活性。以这种方式可检测任何植物的内源性蜡合成活性以确定用于生产蜡酯的候选者。另外也可确定蜡合成活性的优选底物，并且还原酶构建物可被加工以使生产内源性蜡合成活性的优选脂肪族醇底物的还原酶或选择用来增加所希望的蜡酯的产量的还原酶含有一编码序列。
芥属胚细胞中观察到的蜡合成活性似乎包括将由表达的希蒙得木还原酶产生的脂肪族醇转化成蜡酯的能力。尚未确定是否这种活性负责在由异源于植物细胞的还原酶编码序列转化的细胞中将脂肪族醇转化成蜡酯。如果是这种活性负责的，则其可以是一种贡献性(dedicated)酶或一种具有另一种基本活性的酶。例如二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)可能会增加连接酶活性。
在含有酰基还原酶的优选底物的宿主植物细胞中表达还原酶会产生具有可检测到的蜡酯组分的细胞。粗提油中含有可由高温气相色谱检测的蜡酯，但在衍生化的油中蜡酯会转化回到其脂肪族醇和脂酰基底物，因此检测到的是酯的脂酰基醇组分。
从这些转基因植物中可得到的油是蜡酯和三酰甘油酯的混合物。鲸油也是这类组分的混合物。可采用公知的并长期用于从植物油中分离蜡或从鲸油中分离蜡酯的简单方法来分离由转基因还原酶植物得到的油的蜡酯和三酰甘油酯组分。一种这样的方法是防冻法，即一种脱蜡法，由此将油冷冻使蜡组分结晶，随后蜡作为固体从油中机械地分离出。
许多用于此目的的其它分离方法是公知的，包括使用有机溶剂的抽提方法。Gunstone et al在The Lipid Handbook，2d.ed.，Chapman & Hall(1994)London中公开了各种这类方法。
现已对本发明做了大概描述，通过参照下列实施例将更容易理解本发明，除非加以说明，实施例仅仅是用于描述而不是限制本发明。
实施例实施例1酰基CoA还原酶检测描述了在微粒体膜制剂或溶解蛋白制剂中酰基CoA还原酶的活性。A、被标记的材料通过将[14C]标记的氰化钾与相应的烷基甲磺酰酯反应，然后将烷基腈碱水解成游离的脂肪酸，便可得到名为11-顺式-廿烯酸，13-顺式-廿二烯酸和15-顺式-廿四碳烯酸的长链[1-14C]脂肪酸。用醚的重氮甲烷将游离的脂肪酸转变为甲酯，再用制备硝酸银薄层层析(TLC)进行纯化。这些脂肪酸的甲酯经水解重新变为游离的脂肪酸。放射化学纯度用三种TLC方法进行估计常相硅石TLC，硝酸银TLC和C18反相TLC。用这些方法测得的放射化学纯度为92-98％。长链[1-14C]酰基辅酶A按Young和Lynen(J.Bio.Chem.(1969)244377)的方法由相应的[1-14C]游离脂肪酸制得，其比活性为10Ci/mole.其它的[1-14C]酰基辅酶A如[1-14C]廿四碳烯酰基辅酶A均购自Amersham公司(Arlington Heights，IL)。[1-14C]十六醛按Pletcher和Tate(Tet.Lett.(1987)1601-1602)方法的微量修正方法将[1-14C]十六烷-1-醇经重铬酸盐的氧化而制得。产物经制备硅石TLC纯化并以己烷溶液存于-70℃备用。B、微粒体膜制备物中还原酶活性的测定1、测定1通过将20μM[1-14C]酰基辅酶A(通常为廿四碳烯酰基辅酶A，比活为2-5Ci/mol)与待测样品及2mM NADPH以0.25ml的总体积一起保温测量微粒体膜制备物中还原酶的活性。保温混合物还含有10％(W/V)的甘油，1mM DTT并用50mM HEPES(4-[2-羟乙基]-1-哌嗪乙烷-磺酸)缓冲(在此及此后HEPES均从pH7.5的1M贮备液中取出加入)。
通过加入酰基辅酶A的底物使反应开始，30℃1小时实现保温。通过将测定试管置于冰上并立即加入0.25ml异丙醇∶乙酸(5∶1，V/V)终止反应。加入未标记的蜡酯(0.1mg)和油醇(0.1mg)作为载体，按照按比例缩小的Hara和Radin(Anal.Biochem.(1978)90420)的方法提取[14C]脂类。向终止的的反应中加入6ml己烷/异丙醇(3∶2，V/V)。振荡混合样品，加入2ml硫酸钠的水溶液(5.5％(w/V)，再次振荡。
2、测定2通过将20μM[1-14C]酰基辅酶A(通常为廿四碳烯酰基辅酶A，比活为2-5Ci/mol)与待测样品及2mM NADPH以0.25ml的总体积一起保温测量微粒体膜制备物中还原酶的活性。保温混合物还含有10％(W/V)的甘油，1mM DTT并用50mM HEPES(4-[2-羟乙基]-1-哌嗪乙烷-磺酸)缓冲(在此及此后HEPES均从pH7.5的1M贮备液中取出加入)。若欲抑制存在于膜制备物中(且消耗还原酶反应产物)的酰基辅酶A醇酰基转移酶的活性，可向反应混合物中加入0.3％(W/V)的CHAPS。此浓度的CHAPS对还原酶作用最小但可完全抑制酰基转移酶的反应，从而简化还原酶活性的定量计算。
通过加入酰基辅酶A的底物使反应开始，30℃1小时完成保温。通过将测定试管置于冰上并立即加入0.25ml异丙醇∶乙酸(4∶1V/V)终止反应。加入未标记的蜡酯(25μg)，油醇(50μg)和油酸(50μg)作为载体。按照按比例缩小的Hara和Radin(Anal.Biochem.(1978)90420)的方法提取[14C]脂类。向终止的反应中加/4ml己烷/异丙醇(3∶2，V/V)，振荡混合样品，加入2ml硫酸钠的水溶液(6.7％(W/V)，再次振荡。C、增溶的还原酶活性的测定为测定增溶的还原酶的活性，需做几个改动，包括加盐以激活酶。增溶的还原酶的测定缓冲液如上面微粒体膜制备物测定所述，同时有如下修改a、NaCl以0.3-0.5M间的终浓度加入，b、EDTA以约1mM的浓度被包含，以及c、待测的酶样品(一般含0.75％CHAPS)被稀释至≤0.3％(CHAPS的CMC约为0.5％)D、反应产物的分析为分析微粒体膜制备物还原酶测定或增溶的还原酶测定中的产物，建立了二个方法。一个方法，下面称为“深度分析”，较费时，但产生更高的定量结果。另一方法，下面称为“快速分析”，也提供了一种测定还原酶活性的方法，更快速、方便但定量性较差。
1、深度分析在加入硫酸钠并振荡混合后，取出上层的有机相，用4ml己烷/异丙醇(7∶2V/V)洗下层的水相。合并有机相，并在氮气中蒸发至干。将类脂残余物重悬于小体积的庚烷中，用液闪计数器测量一份的放射性。余下的样品可用于被标记组分的TLC分析或用于裂解蜡酯的衍生反应，并由此测量所产生的醇的总量。
为了分析类脂组分，将样品加至硅石TLC板上，并将此板在己烷/二乙醚/乙酸(如80∶20∶1或70∶30∶1，V/V/V)中展开。用AMBIS放射性分析成像系统(AMBIS Systems公司，San Diego，CA)可测量放射性在类脂组分、大量的蜡酯(当存在连接酶时，如在微粒体膜制备物测定中)，游离的脂肪酸、脂肪族醇和起始的极性类脂间的分布。
为裂解蜡酯，采用了基于Pina等(Lipids(1987)22358-361)的Grignard衍生反应方法的按比例缩小了的方法。在配有聚偏四氟乙烯线的螺丝盖的玻璃管中干燥加有200μg载体蜡酯的样品。然后依次加入无水二乙醚(0.4m1)，乙酸乙酯(3ml)和3M的溶于二乙醚的乙基溴化镁(0.1ml)振荡，室温下静置2小时以上，然后小心加入水饱和的二乙醚以破坏过量试剂。加入2ml 1M盐酸和1M己烷，振荡混合。用水洗上层的有机相(2×2ml)并在50-100μl乙醇的存在下蒸发至干。
样品重悬于50-100μl己烷中，加至TLC板。利用常相和反相TLC系统进行分析。常相TLC使用硅石TLC板，用己烷/二乙醚/乙酸(70∶30∶2，V/V/V)展开，反相系统用C18板，在甲醇中展开。
2、快速分析在加入硫酸钠并振荡后，取出已知百分比的有机相，用液体闪烁计数器计数。此结果用于估计有机相的总计数。再取出一部分有机相，在氮气下干燥，重溶于庚烷中并点至TLC板上，展开，按在详细叙述的测定中所述进行扫描。以此方式可确定掺入醇中的总计数的百分率。实施例2希蒙得木酰基辅酶A还原酶的特性以希蒙得木为例示出获得有还原酶活性的蛋白质制备物的方法和此种酶的活性的研究结果。A、种子发育和酰基辅酶A还原酶活性的概况在加州的Davis历时二个夏天依据5个植物探索了胚的发育。发现从大约80天到大约130天胚的鲜重和干重以相当稳定的比率增加，类脂提取表明当胚的鲜重达到约300mg(约80天)时，类脂与干胚的重量比达到50％的最大值。
正在发育的胚的酰基辅酶A还原酶的活性按实施例1所述的方法进行测量。由于希蒙得木的种被被确定为抑制因子的发源地，故在将胚冻于液氮中以存于-70℃之前去掉种被。
在无细胞匀浆或膜碎片中测量酰基辅酶A还原酶活性的发育概况，结果表明在开花期后约115天达到峰值的还原酶的活性有一大的诱导现象。故为了便于胚胎学研究在开花期后90-110天间收获胚，此时还原酶活性高，类脂沉积尚未达到最大值，种被易于去掉。还原酶活性上升的最大速度见于开花期后80-90天之间。因此为了构建cDNA文库在开花期后80-90天间收集胚，此时还原酶蛋白的合成率被认为最高。相应地可推测到编码酶基辅酰A还原酶的mRNA的水平在此阶段也最高。B、分级分离的研究分级分离希蒙得木胚样的早期尝试表明还原酶活性在离心所得的脂肪层、上清液和颗粒部分之间的分布各不相同。人们尝试了许多方法试图影响活性分布，如超声波处理，梯度浮选以及向提取缓冲液中加入各种试剂。在提取液中加入盐类导致100,000g离心1小时后上清液部分连接酶活性的最大恢复。提取缓冲液包含3M NaCl，0.3M蔗糖，100mM HEPES，2mMDTT和蛋白酶抑制剂1mM EDTA，0.7mg/ml抑酶醛肽，0.5mg/ml抑胃肽和17mg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)。C、微粒体膜的制备经透析并在100,000g离心或经硫酸铵分级分离可从上述上清液中得到有高水平的还原酶活性的颗粒。透析方法详见实施例3。这些有还原酶活性的颗粒的进一步分析如密度梯度离心、凝胶渗透层析和蛋白质/磷酯分析表明这些颗粒为一种膜碎片。此膜制备物也有高的细胞色素C还原酶活性，此活性被用为内质网(ER)膜的标志。因此这些研究表明还原酶蛋白是与膜有关的。
为进行硫酸铵分级分离，基本按实施例3所述从希蒙得木胚获得100,000g的离心上清液，向其中慢慢加入等体积的硫酸铵溶液(33.2g/100ml)(不断搅拌)使硫酸铵的浓度达到30％，此浓度可有效地沉淀还原酶。继续搅拌30分钟，然后26,000g离心30分钟，用由25mM HEPES，1M NaCl，1mM DTT，0.1M PMSF组成的溶液将沉淀重悬于第一上清液部分S1的十分之一体积中。悬液经100,000g离心1小时，沉淀重悬于25mM HEPES，10％甘油中(体积仍然是S1的十分之一)。在100,000g离心该悬浮液得到洗过的微粒沉淀P4，P4重悬于S1的二十分之一体积的25mM HEPES，10％甘油中，蛋白质浓度约3-4mg/ml。分成等份并冻于-70℃备用。D、还原酶活性的膜结合性的研究用Bordier(J.Bio.Chem.(1981)2561604-1607)所述的Triton X114相分级分离方法确定希蒙得木还原酶是一整合的膜蛋白还是一较松散地与膜结合的蛋白(更高亲水性蛋白)。此技术主要包括膜与1％Triton X114一起在冰上保温，然后将温度升高至此去垢剂的浊点以上(浊点是很大的胶团开始自发形成的温度，对1％Triton X114此值为-20℃)，离心后可见明显分开的二相，下层相去垢剂富集，上层相去垢剂空竭(此处指水相)。已证明整合的膜蛋白倾向于并入去垢剂富集相，而有更高亲水性的蛋白则在水相中回收到。当将此Triton X114相分级分离方法用于希蒙得木膜制备物时，还原酶的活性与去垢剂富集相相联，在水相中测不到还原酶活性。这证明此还原酶为一膜整合蛋白。E、还原酶的进一步研究上述微粒体膜制备物被用于还原酶的进一步研究，此还原酶在pH5-9的范围内有活性。试验在pH7.5下进行，此pH值接近公认的细胞质的生理pH值。
1、盐的作用检测各种盐对还原酶活性的作用，对一价盐均采用0.5M的标准浓度。二价阳离子或阴离子盐用0.167M(以产生与0.5M单价盐相同的离子强度)和0.5M进行测量。加入0.5M的NaCl观察到高达15倍的激活。其它的盐，包括一价盐和二价盐(如LiCl，KCl，MgCl2，CaCl2和Na2SO4)，也可激活还原酶的活性，虽然与NaCl的激活相比程度一般较低，强的离液盐如KSCN和NaSCN没有或仅有微不足道的激活作用。
2、其它的效应物已发现二硫苏糖醇(DTT)对还原酶活性有激活作用，但并不必然如此。乙二胺皿乙酸(EDTA)也有一些激活作用，最适浓度为2.5mM。低浓度的BSA(牛血清白蛋白)(0.02-0.075mg/ml)有小的激活作用而当浓度在0.2mg/ml以上时则有抑制活性作用。
酰基辅酶A还原酶有NADPH特异性的活性这一早期发现(Pollard等，见上述)得到证实。观测不到高于本底水平的依赖NADH的活性(小于依赖NADPH的活性的2％)。还发现还原酶反应的水溶性终产物辅酶A和NADP+都有明显的抑制活性作用(毫克分子的浓度)，而NADH和NAD+对活性的作用不明显。
3、底物特异性用各种链长的脂肪酸如酰基ACP和酰基辅酶A的硫酯作为还原酶的底物进行比较，试验在底物浓度为10μM下进行，因为廿四碳烯酰基辅酶A(24∶1-CoA)在更高的浓度时会显示强烈的底物抑制作用。试验中NaCl浓度为0.5M，底物特异性试验的结果示于下面表1中。
表1还原酶的酰基特异性还原酶活性酰基基团 酰基ACP酰基辅酶A(10μm)(10μm)120 ＜0.01 ＜0.15160 2.9＜0.4180 - 1.4181 1.05 0.75201 - 1.0221 - 1.0241 - 19.9其中廿四碳烯酰基辅酶A有最高的底物活性，故在进一步进行酶的纯化和酶的性质研究试验中用于还原酶的测定。有趣的是将十六酰辅酶A(C160-CoA)与十六酰ACP(C160-ACP)作为底物进行直接比较，十六酰辅酶A的活性仅高于本底而十六酰ACP的活性则高许多，以前的研究表明十八酰ACP(C180-ACP)有底物活性(Pollard等，见上述)。
另一有趣现象是，虽然十六酰辅酶A是还原酶的较差底物，但在用未标记的十六酰辅酶A(0-30mM)和[1-14C]廿四碳烯酰基辅酶A(20mM)作的竞争试验中，在5mM的十六酰辅酶A存在时，廿四碳烯酰基辅酶A为底物的还原酶活性被抑制了50％。故虽然十六酰辅酶A在测定条件下是较差的底物但它是一有效的抑制剂。
4、还原酶抑制剂的测定检测了几个已知的其它类型的还原酶蛋白的抑制剂以测试它们对希蒙得木酰基辅酶A还原酶活性的作用。Mevinolin是HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶)的强抑制剂，它仅在比其对HMG-CoA还原酶的抑制浓度(约1nM的Ki)更高的浓度(100μM)时才有作用。已知Ceruliner共价地与β-酮酰基硫酯合成酶结合，但对希蒙得木酰基辅酶A还原酶无强烈的抑制作用。
筛选巯基阻断试剂以研究它们对还原酶活性的作用。结果表明N-乙基马来酰亚胺有强烈的抑制活性，对羟基苯甲酸汞也有一定的抑制作用，碘代乙酰胺无作用。由此得出结论酰基辅酶A还原酶有一基本的巯基基团，它对各种巯基阻断剂有相当大的选择性。实施例3酰基辅酶A还原酶的纯化此处叙述了可用于分离有还原酶活性的希蒙得木膜制备物、增溶还原酶活性及进一步纯化还原酶蛋白的方法。A、微粒体膜的制备通过测量胚的含水量(45-70％)在开花期后约90-110天间收获希蒙得木胚。去掉外壳和种被，在液氮中迅速冷冻子叶并存于-70℃备用。为制备初始蛋白，在液氮温度下在钢制臼和杵中将胚捣碎成粉状。在典型试验中处理70克胚。
以每280ml溶液中加入70g胚的比例将粉末加入如下高盐溶液3M NaCl，0.3M蔗糖，100m MHEPES，2mM DTT和蛋白酶抑制剂1mM EDTA，0.7mg/ml抑酶醛肽，0.5mg/ml抑胃肽和17mg/ml PMSF.用Polytron组织匀浆器匀浆30秒将粉状胚分散至缓冲液中即形成无细胞匀浆(CFH)。通过三层Miracloth(Cal BioChem，LaJolla，CA)过滤匀浆，滤液100,000g离心1小时。
所得的样品由沉淀，上清液和漂浮的脂肪层组成，取出脂肪层，收集上清部分，在含1M NaCl，10mM HEPES，2mM DTT和1mM EDTA的溶液中过夜透析(换液三次)，200,000g离心透析液1小时得到沉淀DP2，将此沉淀重悬于25mM HEPES(pH7.5)，10％甘油，1mM EDTA和0.5M NaCl的溶液，体积约为初始CFH体积的1/20，以得到微粒体膜制备物。
按实施例1所述测活性。酰基辅酶A还原酶活性的回收率约为无细胞匀浆中初始活性的30％，此制备物中酰基辅酶A还原酶的活性在-70℃时稳定。B、还原酶蛋白的增溶将固体CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲基-氨基]-1-丙磺酸)加入微粒体膜制备物中至终浓度2％(W/V)。此样品在冰上保温并慢摇约1小时，然后用25mM HEPES(pH7.5)，10％甘油，0.34mM NaCl，1mM EDTA稀释将CHAPS的浓度降至0.75％，NaCl的浓度约至0.4M。然后200,000g离心样品1小时，回收上清液，按实施例1所述测定还原酶的活性。通常在上清液中可回收85％的微粒体膜制备物的还原酶活性。增溶的还原酶活性在-70℃保存时保持稳定。C、Blue A柱层析准备一含Blue A(Cibacron Blue F3GA；Amicon Division，W.R.Grace & Co.)的柱床体约25ml的柱子(1.8X约10cm)。用含0.4MNaCl的缓冲液A(25mM HEPES(pH7.5)，20％(W/V)甘油，0.75％CHAPS，1mMEDTA)平衡此柱。然后将上述增溶的还原酶制备物加至此Blue A柱。
用数倍于柱体积的含0.4M NaCl的缓冲液A洗柱，然后进一步用含0.5M NaCl的缓冲液A洗柱。大于90％的还原酶活性结合在柱上而大于85％的其它蛋白会通过此柱。用含1.0M NaCl的缓冲液A将还原酶活性从柱上洗脱。收集各部分，按例1测定还原酶活性。合并含还原酶活性的部分，存于-70℃。用含1.0M NaCl的缓冲液通常可回收上柱的还原酶活性的30-50％。D、大小排阻层析在配有YM30膜(Amicon Division，W.R.Grace)的压力小室中经超滤将由Blue A柱洗下并合并的有活性部分浓缩约10倍。由Blue A柱的洗下的活性部分通常约90ml，浓缩至约8ml，然后加至下述的二个Sephacryl S100柱。用S100HR介质(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ)填充柱子(2.5×75cm)，然后用含0.5M NaCl的缓冲液A平衡。用如下蛋白质标准对柱子进行大小标定牛血清白蛋白(66KD)，碳酸酐酶(29KD)，细胞色素C(12.4KD)和兰色葡聚糖(用于确定空隙体积)。每个S100柱中加入一份4ml的浓缩样品，柱子以约17cm/小时的线性流速展开，分部收集4小时许，按实施例1所述测量各部分的还原酶活性。
在一表观分子量约49KD的洗脱主峰内可收回上样活性的60％以上。合并的有活性部分的体积约30-35ml/柱。E、亲和层析用十六酰辅酶A琼脂糖(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)填充一柱子(1.5cm×约2cm)，并用缓冲液B(含0.1M NaCl的缓冲液A)平衡之。由凝胶过滤柱得到的被合并的活性部分按上述方法经超滤浓缩约16倍。经缓冲液A稀释，浓缩样品中NaCl的浓度由0.5M降至约0.1M。将此被稀释的样品上柱，然后用数倍于柱体积的缓冲液B洗柱，再用10ml含15mMNADH的缓冲液B洗柱，其后进一步用缓冲液B洗柱。将15ml含15mM NADPH的缓冲液B通过柱子，即可将还原醇的活性洗下。由一个凝胶过滤柱得到的材料通常一次性加入亲和柱。用NADPH洗脱可收回上柱活性的70％以上。合并活性部分，分析还原酶活性、蛋白质浓度和多肽组分。蛋白质浓度可用基于Bradford(Analy.Biochem.(1976)72248-254)所述之染料结合方法的商品化试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.Richmond，CA)进行估计，用BSA作参考蛋白。F、纯化表在一典型的纯化试验中每一步骤蛋白质的回收率和还原酶活性示于表2。
表2希蒙得木还原酶的纯化纯化步骤酶活产量 蛋白质比活 纯化(mmol/min) (g)(mg) (mol/min/mg)(倍数)粗匀浆液 380第一上清液 164 1001172 0.1 1.0微粒体膜 82 50 77.5 1.1 7.6增溶部分 64 39 68.5 0.9 6.7BlueA琼脂 39 23.8 2.218.1 130Sephacryl- 13.4 8.21.78.1 58S100十六酰辅酶A4.7 2.90.221.9 156琼脂糖G、SDS PAGE分析样品中的多肽组分经SDS PAGE(Laemmli，U.K.(1970)Nature(London)227680-685)进行分析。通过向样品中加入SDS和二硫苏糖醇的贮备液分别至终浓度2％和30mM制备用于电泳的样品。将约50μl样品加至含12％分离胶(NOVEX，San Diego，CA)的丙烯酰胺凝胶孔中。分子量标准购自Bio-Rad实验室。通过银染(Blum等，Electrophoress(1987)893-99)来测定蛋白。
从亲和柱洗脱的活性样品中可检测到二个主要的多肽带，表观分子量约52和54KD，二者占制备物蛋白质的95％以上。用一包含55KD蛋白质标准的蛋白质分子量标准体系进一步分析这些样品给出另外54KD和56KD的分子量估计值。由于天然状态下此还原酶的表观分子量为49KD(由大小排阻层析确定，见上述)，这些带可能代表还原酶的二个相关的形式，而不是一个酶的二个不同的亚单位。H、将蛋白质印迹至膜上为进行氨基酸测序，在SDS-PAGE电泳后将上述还原酶多肽转至硝酸纤维素膜或PVDF膜即Immobilon-P(Millipore；Bedford，MA)或ProBlott(AppliedBiosystems，Foster City，CA)膜。若随后对蛋白质进行酶解，则优选硝酸纤维素膜，而PVDF对N-端测序和溴化氰降解的多肽的测序有用。
1、印迹至硝酸纤维素上当蛋白质被电印迹到硝酸纤维素上时，在一如含25mM Tris，192mM甘氨酸的5-20％的甲醇的缓冲液中，典型印迹时间是1-5小时。电印迹后，用溶于1％(V/V)乙酸溶液的0.1％(W/V)的丽春红S染膜2分钟，然后更换2-3次0.1％(V/V)乙酸进行脱色，每次换液脱色2分钟。然后将这些膜湿着存于加热封闭的塑料袋中，置-20℃。若时间许可，则不冷冻吸附而是立即用于降解以产生用于下述氨基酸序列确定的多肽。
2、印迹至PVDF上当蛋白质被电印迹到Immobilon P PVDF上时，在一如含12.5mM Tris/5mM甘氨酸的10％(V/V)甲醇的缓冲液中典型印迹时间为1-2小时，电印迹到PVDF后，用溶于50％(V/V)甲醇/10％(V/V)乙酸的0.1％(W/V)考马斯蓝染膜5分钟，然后更换2-3次50％(V/V)甲醇/10％(V/V)乙酸进行脱色，每换一次脱色2分钟。然后可将PVDF膜风干30分钟再干着封入加热封闭的塑料袋中，置-20℃。即到PVDF膜如ProBloott用于完整蛋白质的N-端测序。一个将蛋白质印至ProBlott的方法述于下面的实施例4中。实施例4氨基酸序列的确定此例叙述了用于确定与酰基辅酶A还原酶活性有关的植物蛋白的氨基酸序列的方法。A、蛋白质的溴化氰裂解和多肽的分离利用述于Promega公司(Madison，WI)的探针设计多肽分离系统技术指南的一套方法将溴化氰裂解用于感兴趣的蛋白质。如上所述将还原酶蛋白质印到PVDF膜上。从吸印处切下蛋白带，置于溶于70％(V/V)甲酸的溴化氰溶液中，室温下过夜然后取出溴化氰溶液，合并，并在一连续的氮气流下在一Reacti-Vap蒸发器(Pierce，Rockford，IL)中干燥。为保证洗脱彻底，可用一多肽洗脱溶剂如70％(V/V)异丙醇，0.2％(V/V)三氟乙酸，0.1mM赖氨酸和0.1mM巯基乙醇进一步洗脱溴化氰裂解的多肽。然后取出洗脱溶剂加至一含有上述干燥的溴化氰溶液的试管中，如上所述进行干燥。洗脱步骤可用新鲜的洗脱溶剂重复进行。然后向干燥的多肽中加入50μl HPLC级的水并通过在一Speed-Vac(Savant，Inc.，Farmingdale，NY)中蒸发除去此水。
用一与Schagger和von Jagow(Anal.Biochem.(1987)166368-379)所述相似的Tris/Tricine SDS-PAGE系统分离多肽。凝胶在(125-150伏的恒压下电泳1小时或直至指示剂已开始脱离凝胶的底部边缘。在转移前将凝胶在转移缓冲液(125mM Tris，50mM甘氨酸，10％(V/V)甲醇)中浸泡15-30分钟。然后在50伏的恒压下将凝胶对ProBlott测序膜(Applied Biosystems，Foster City，CA)吸附2小时。用考马斯蓝(以0.1％溶于50％(V/V)甲醇/10％(V/V)乙酸溶液)对膜染色，再在50％(V/V)甲醇/10％(V/V)乙酸中脱色3×2分钟。将膜风干30-45分钟然后在-20℃干燥贮存。
印至ProBlott上的多肽可直接加至蛋白质测序分析仪的测序筒中而不需加入Polybrene包被的玻璃纤维膜。利用一稍作修改的反应循环BLOT-1(Applied Biosystems公司提供)即可对多肽进行测序。溶液S3(氯丁烷)也由S1和S2(正庚烷和乙酸乙酯)的50∶50混合液所取代。吸附至ProBlott上的蛋白被测序时均要采用这两处修改。B、蛋白酶消化和多肽的分离为获得多肽以测序可用蛋白酶消化吸附到硝酸纤维素上的蛋白质。所用方法为Aebersold等(PNAS(1987)846970)的方法。从硝酸纤维素膜上切下还原酶蛋白质的带和用做对照的等量的空白硝酸纤维素膜。用HPLC级的水洗几次以除去丽春红S。然后将1.0ml溶于0.5％乙酸的0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40，Aldrich，Milwaukee，WI)加至膜片上，37℃保温30分钟。为彻底除去PVP-40，用许多倍体积的HPLC级的水(8×5ml)洗涤硝酸纤维素片，同时在分光光度计上检测洗涤物在214nm处的光吸收。另外，如果在PVP-40处理和洗涤以前带不被切成小片，PVP-40更易除去。这二个修改消除了PVP40的干扰问题。
此后将膜片置于适当的消化缓冲液中，如胰蛋白酶消化缓冲液100mM NaHCO3，pH8.2或内切蛋白酶gluC缓冲液25mM碳酸铵/1mMEDTA，pH7.8，向消化混合物中加入乙腈至5-10％(V/V)的终浓度。在消化缓冲液中稀释蛋白酶，然后加入消化混合物中，一般以1∶10(W/W)(蛋白酶∶蛋白质)的比例加入。保温18-24小时进行消化。例如，胰蛋白酶的消化在37℃保温，内蛋白酶gluC的消化在室温下保温。与此相似，也可用其它的蛋白酶消化还原酶蛋白，包括lysC和aspN。虽然各消化缓冲液可能不同，但消化、多肽分离、纯化和测序的方法则与胰蛋白酶和gluC进行消化时所述的方法大体相同。
在过夜保温后，通过加入10ml 10％(V/V)的三氟乙酸或1μl 100％TFA终止消化反应。从硝酸纤维素片上取下消化混合物，用1－5×100m1体积的含5-10％乙腈的消化缓冲液洗硝酸纤维素片，在一Speed-Vac中将体积浓缩至100ml以下。在装于Applied Biosystems公司(Foster City，CA)的130型高效液相色谱(HPLC)上的Vydac反相C18柱(2.1mm×100mm)上分离多肽，用于洗脱多肽的流动相是缓冲液A0.1mM磷酸钠，pH2.2；缓冲液B70％的溶于0.1mM磷酸钠的乙腈，pH2.2。采用一个三阶梯度洗脱10-55％的缓冲液B2小时以上，55-75％的缓冲液B5分钟以上，75％的缓冲液B15分钟，流速为50ml/分。在214nm处测量多肽，手工收集，然后存于-20℃。C、蛋白质和多肽的N-端测序所有序列测定均在Applied Biosystems的477A脉冲液相蛋白质测序仪上经Edman降解来实现。用一与计算机相连的AppliedBiosystems的120A PTH分析仪分析测序仪产生的乙内酰苯硫脲(PTH)氨基酸。对Apple Macintosh用Applied Biosystems的610A型数据分析系统收集并贮存数据，也可用PENELSON公司(Cupertino，CA)的ACCESS*CHROM软件收集并贮存数据。从一由PTH分析仪获得输入的图表记录仪上读取序列信息，并用得自610A型软件的定量化数据进一步证实。所有的序列信息均在数据分析系统的帮助下由二个操作员独立读出。
对作为高峰从HPLC上流出的多肽样品，将其加至已在测序仪上被预循环了三次的Polybrene包被的玻璃纤维膜(Applied Biosystems，Foster City，CA)。对已被还原并被烷基化的多肽，从每个测序循环得到的PTH氨基酸产物的一部分置于液体闪烁计数器中计数。对已被电吸附到Immobilon-P上的蛋白质样品，切下感兴趣的带置于一Polybrene包被的玻璃纤维膜上，按上述进行预循环，按生产厂家的具体说明组装反应筒。对已被电印迹到ProBlott上的蛋白质样品，不要求使用玻璃纤维膜。
为了从小量样品(5-30pmoles)得到蛋白质序列，可使用Tempst和Riviere(Anal.Biochem(1989)183290)叙述的477A转换循环和120A分析仪。D、还原酶多肽的氨基酸序列将纯化的还原酶制备物走SDS-PAGE电泳以分离54KD和56KD的蛋白。被分离的物质转移到一种硝酸纤维素膜(Immobilon N)并用丽春红染色以确定带的位置。切下包含54KD或56KD蛋白的带，用胰蛋白酶处理，然后用反相HPLC分离胰蛋白酶裂解的多肽。每个还原酶蛋白的几个多肽的序列信息(序列号1-18)示于下面的表3。表354KD和56KD还原酶蛋白的肽序列56KD还原酶肽1) AILVTGATGSLAK(SEQ ID NO1)2) LQNExFGKELFK(SEQ ID NO2)3) VTVVPGDITGEDL(SEQ ID NO3)4) LGLDINVEK(SEQ ID NO4)5) TIDNVPVYYGK(SEQ ID NO5)6) YVEPVTYHVGSSAANPM(SEQ ID NO 6)7) LSALPEMAHR(SEQ ID NO7)8) LVDIYK(SEQ ID NO8)9) EGIVEADMFYFD(SEQ ID NO9)10) AINWEDYFLKTxFPGVVExVL(SEQ ID NO10)54KD原还酶肽1) AILVTGATGSLAK(SEQ ID NO11)2) LGLDINVEK(SEQ ID NO12)3) TIDNVPVYYG(SEQ ID NO13)4) YVEPVTYXVGSSAAN(SEQ ID NO14)5) LVDIYKp(SEQ ID NO15)6) EGIVEADMFYF(SEQ ID NO16)7) AINWEDYFL(SEQ ID NO17)8) THFPGVVEHVL(SEQ ID NO18)多肽序列是用氨基酸的标准单字母码列出的。“x”表示此位置的氨基酸尚未确定。以小写字母出现的氨基酸表示鉴定倾向于此氨基酸。
由上述多肽序列可见二个还原酶蛋白的相似性是明显的。54KD蛋白的所有多肽也均在测序的56KD多肽中发现。在由此确定的氨基酸序列和由编码56KD还原酶的cDNA推测的氨基酸序列(图1(序列号19))之间存在一个不一致。按照cDNA序列460位的氨基酸是丝氨酸。而54KD的多肽6和56KD的多肽9的资料表明此位置为一甘氨酸。E、Western分析编码还原酶56KD蛋白质的167-235位氨基酸(见图1)的还原酶cDNA部分(实施例5)以从Taq启动子表达还原酶多肽的读框连接至大肠杆菌的pGEX表达载体(AMRAD；BurwoodVictoria，Australia)。得到的构建物转化大肠杆菌细胞以产生还原酶多肽。纯化以此方式产生的69个氨基酸的多肽(Smith等(1989)，Gene 6731-40)并用其获得抗还原酶多肽的多克隆抗体。
为了用上述抗体制备物分析还原酶制备物，作纯化的含56和54KD带的还原酶制备物及希蒙得木无细胞匀浆物(实施例3A)的western杂交。56KD的带在无细胞匀浆物和纯化的还原酶制备物中均可检测到，而54KD的带仅纯化的还原酶制备物中可检测到。这些结果表明在纯化的还原酶制备物中所见到的54KD的带是由还原酶的纯化过程所致的56KD蛋白的一个断裂产物。
用Southern吸附分析用四种不同的限制酶消化的希蒙得木基因组DNA，检测到杂交到还原酶cDNA(实施例5)探针上的一个重要带和一个次要带。实施例5希蒙得木还原酶的cDNAA、希蒙得木RNA的分离按Jackson和Larkins(PlantPhysiol(1976)575-10)初始描述又经Goldberg等(Developmental Biol(1981)83201-207)修改的方法从多核糖体分离RNA。此过程的所有步骤，除非特别说明，均在40℃完成。将开花期后80-90天收集的10克希蒙得木胚用一Waring混合器在液氮中研磨直至组织变成细粉。蒸发掉液氮，然后加入170ml提取缓冲液(200mM TrispH9.0，160mM KCl，25mM EGTA，70mM MgCl2，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，1mM亚精胺，10mMβ-巯基乙醇和500mM蔗糖)，将组织匀浆约2分钟。用无菌的miracloth过滤匀浆液，然后12,000g离心20分钟。将上清液轻轻倒入一500ml的无菌长颈瓶中，室温下加入1/19体积的一种20％去垢剂溶液(20％Brij 35，20％Tween40，20％Noidet P-40W/V)。4℃中速搅拌30分，然后12,000g将上清液离心30分钟。
将上清液以30ml分入无菌的Ti60离心管中并用7ml含40mM Tris pH9.0，5mM EGTA，200mM KCl，30mMMgCl2，1.8M蔗糖，5mMβ-巯基乙醇的溶液铺底。将这些管子用提取缓冲液加至顶部，在Ti60转头中4℃，60,000rpm旋转4小时。离心后吸走上清液，每管加入0.5ml重悬缓冲液(40mMTris pH9.0，5mM EGTA，200mM KCl，30mM MgCl2，5mMβ-巯基乙醇)。将管子冰上放置10分钟，然后将沉淀彻底重悬并合并之。然后以120g离心10分钟以除掉不溶性物质。向上清液中加入等体积的溶于20mM Tris pH7.6，200mM EDTA，2％N一十二烷基-肌氨酸盐溶液的1mg/ml的自我消化过的蛋白酶K，室温下保温30分钟。
通过加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积的乙醇沉淀RNA，于-20℃放置数小时，然后4℃120,000g离心30分钟以沉降RNA。将沉淀重悬于10ml TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA)中，用等体积的经Tris pH7.5饱和的苯酚抽提，在4℃以10,000g离心20分钟分离各相。取出水相，有机相用等体积的TE再提取一次。合并水相并用等体积的氯仿抽提一次。通过离心再次分离各相，将水相接以前所述用乙醇沉淀以获得多核糖体RNA。
通过将RNA在高盐缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris pH7.5，1mM EDTA，0.1％SDS)中通过一纤维素柱(Sigma-Cell50)除去多核糖体RNA制备物中的多糖杂质。杂质与柱结合而RNA则收集在洗脱物中。合并洗脱的部分，用乙醇沉淀RNA。然后将沉淀的总RNA以较小体积重悬，加至d(T)寡聚体纤维素柱分离多聚腺苷酸化的RNA。B、在一质粒载体上构建cDNA文库在一质粒克隆载体pCGN1703上用多聚腺苷酸化的RNA构建cDNA文库，pCGN1703由商品化的克隆载体Bluescribe M13(Stratagene Cloning System，San Diego，CA)衍生而来，构建如下。Bluescribe M13的多酶接头用BamHI消化，绿豆核酸酶处理，平端连接以产生BamHI位点缺失的质粒pCGN1700，将pcGN1700用EcoRI和SstI(相联的限制位点)消化，用一含有BamHI，PstI，XbaI，ApaI和SmaI限制位点，5’突出的AATT和3’突出的TCGA的合成接头退火。将此接头插入pCGN1700消除了EcoRI切点，恢复了Bluescribe中存在的SstI(有时也称为SacI)切点，并加入了包含在接头中的新的限制位点，将由此形成的pCGN1702质粒用HindIII肖化并用Klenow酶补平；用PvuII部分消化此线性DNA，并用T4DNA连接酶在稀溶液中连接。筛选带有lac启动子区缺失的转化子(pCGN1703)，用作质粒克隆载体。
cDNA合成的克隆方法简述如下，用SstI消化此质粒克隆载体，用脱氧核苷酸末端转移酶在所形成的3’突出的粘性端产生同聚物T尾。由寡聚物(dA)纤维素色谱将加尾的质粒从末消化或未加尾的质粒中分离出来。用所得质粒作为引物以合成共价吸附到载体质粒任一端的cDNA的第一条链，在脱氧乌苷三磷酸存在下用末端转移酶处理上述cDNA-mRNA载体复合体，以在cDNA链上产生G-尾。用BamHI消化切下靠近BamHI位点的的额外的cDNA-mRNA复合体，余下一端为BamHI粘性端，另一端为G尾的cDNA-mRAN-载体复合体。用带有5’BamHI粘端，限制酶NotI，EcoRI和SstI识别序列和3’C尾的退火的合成环化接头使此复合体环化。连接修补后将此环形复合体转入大肠杆菌DH5α菌株(BRL，Gaithersburg，MD)以形成cDNA文库。希蒙得木胚的cDNA文库包含约1.5×106个带有平均约500bp的cDNA插入的克隆。C、在λ载体上构建cDNA文库希蒙得木的多聚腺苷酸化的RNA也被用于在克隆载体1ZAPII/EcoRI(Stratagene，SanDiego，CA)上构建cDNA文库。此文库用生产厂家所提供的方法、DNA和菌株进行构建。克隆也根据生产厂家的推荐用GigapackGold包装提取物(Stratagene)进行包装，以此种方式构建的cDNA文库约含有1×106个带有平均约400bp的cDNA插入的克隆。D、还原酶cDNA的分离利用按照还原酶多肽序列设计的引物PCR技术产生约1kb的还原酶核酸序列以便筛选pCGN1703细菌载体中的希蒙得木文库。
利用熟知的由Maniatis等(见上述)所述的技术筛选文库。获得了编码56KD还原酶蛋白的克隆pCGN7571，并进行了序列测定。pCGN7571的核酸和由此推出的氨基酸序列示于图1。E、在大肠杆菌中表达还原酶的cDNA体外诱导pCGN7571以在还原酶编码序列的第一个ATG处引入NdeI位点，在紧靠NdeI位点的上游引入BglII位点。在还原酶编码区域的下游的SphI位点引入BamHI接头。凝胶纯化1.5kb的BglII-BamHI片段，并将其克隆到BglII-BamHI肖化的pCGN3686(见下面)上，形成pCGN7582。
pCGN3686是从BluescriptKS+(Stratagene Cloning Systems；San，Diego，CA)衍生的克隆载体，但有一氯霉素抗性基因和修改过的接头区。氯霉素抗性基因的来源是pCGN565，它是一基于pUC12-Cm(K.Buckley博士论文，phiX174裂解基因的调控和表达，加利福尼亚大学，San Diego分校，1985)的克隆载体，但含有pUC18的接头(Yanisch-Perron等，Gene(1985)53103-119)。用HhaI消化pCGN565，切下含氯霉素抗性基因的片段，用绿豆核酸酶处理成平端，插入到Bluescript，KS-(StratageneLaJolla，CA)的EcoRV位点以形成pCGN2008。用EcoRI/HindIII消化切下pCGN2008之氯霉素抗性基因，用Klenow酶补平，将此片段连至DraI消化的Bluescript KS+筛选带有氯霉素抗性取代了Ap抗性的DraI片段的克隆，命名为pCGN2015。修饰pCGN2015的接头处以形成pCGN3686，它含有如下限制酶位点，在lacZ接头区从5’到3’PstI，BglII，XhoI，HincII，SalI，HindIII，EcoRV，EcoRI，PstI，SmaI，BamHI，SpeI，XbaI和SacI。
由于还原酶基因下游的BamHI位点在pCGN7582的构建过程中被破坏，将BamHI接头在还原酶基因下游的XbaI载体位点插入pCGN7582，并将含还原酶基因的NdeI-BamHI片段插入BamHI-NdeI消化过的PET3A(Studier et al.(1980)Methods Enzymol 18560-89)。这一质粒命名为pCGN7800。用pCGN7800转化E.coli BL2I(Studier等；如上所述)，此菌株含有在一可诱导启动子控制下的TiRNA聚合酶。
将含有还原酶构建物的大肠杆菌细胞BL21(pCGN7800)与仅含有pET3A载体的BL21对照细胞比较。培养物在含40μg/ml羧苄青霉素的ECLB中过夜生长，用含40μg/ml羧苄青霉素的新鲜ECLB稀释至1/10，生长1小时，加入IPTG至ImM，在收获前让细胞再长3小时，离心收获细胞，细胞沉淀存于-70℃，在french压力机中破碎细胞，用实施例1C所述的还原酶测定检测蛋白质提取物的还原酶活性，只是将DADPH的浓度由2mM提高到5mM。测定产物按实施例1D所述进行分析，BL2I(pCGN7800)细胞提取物的测定产物的薄层层析(TLC)分析表明有醇形成，而BL21(pET3A)对照细胞的提取物不催化醇形成。另外，BL21(pCGN7800)和BL21(pET3A)细胞的SDSPAG E分析表明56KD的蛋白在BL21(pCGN7800)细胞中存在而在BL21(pET3A)细胞中不存在。
为确定大肠杆菌还原酶表达细胞是否在产生醇，用己烷∶异丙醇(3∶2)从BL21(pCGN7800)细胞和对照细胞中提取总的类脂(在摇床上过夜)。将有机相蒸发至干，将类脂溶于小体积的己烷中，用TLC分析，用碘染色的显色。此分析表明从BL21(pCGN7800)细胞提取的类脂中含有醇类，而从对照细胞中提取的类脂中不含醇。
为确定BL21(pGCN7800)细胞产生的醇的碳链长度，醇带从TLC板上取下并用反相TLC和气相色谱分析(GC)，GC分析是按Pina et al.(Lipids(1987)22358-361)所述进行，它使用一个30m SUPELCOWAXTM10(Supelco，Inc.；Bellefonte，PA)，30m SUPELCOWAXTM10又与一个毛细管相融合(0.32mm内径，0.2mm壁厚)，实验参数如下在190℃保持15分钟，然后以每分钟升高5℃的速度达到250℃，在250℃保持3分钟。用这种方式得出，16∶0和18∶1醇作为希蒙得木还原酶基因表达的结果是E.coli中产生的最多的醇，没有蜡在转化的E.coli中检测到，转化的E.coli显然没有包含对这些脂肪醇底物发生反应的内源性蜡合成活性。实施例6植物表达构建物A表达盒在种子组织优选表达的基因的表达盒包含5′和3′的调节区，该表达盒可以从napin，Bce4和ACP基因制备得到，例如在WO92/03564。例如，napin表达盒的制备如下，可用于蜡合成酶和蜡还原酶基因构建物表达的napin表达盒，即质粒pCGN1808已在Kridl et al中描述(Seed Science Research(1991)1209-219)其作为本文的参考文献。
另一方面，pCGN1808可被修饰而获得侧翼限制性位点，从而允许仅仅是表达序列而不是抗性标记被转移到二元载体中，例如pCGN1557(Mc Bride和Summerfelt，见上述)中。包含KpnI，NotI和HindIII切点的合成寡聚核苷酸链退火并连接到HindIII单切的pCGN1808上，这样仅有一个HindIII限制性的酶切位点被恢复，产生的质粒，即pCGN3200通过序列分析证实了在napin3′调节序列的3′端有单个HindIII切点及NotI和KpnI限制性酶切位点。
napin表达盒的大部分是从pCGN3200亚克隆而得到，它是用HindIII和ScaI酶切pCGN3200并与HindIII和SacI酶切的PIC19R连接(Marsh，et al.(1984)Gene 32481-485)，这样产生了质粒pCGN3212。napin启动子区的5′序列的末端通过PCR方法被重建，其用pCGN3200作为模板，两个引物在SacI位点以及napin5′启动子和来自pCGN1808构建物的pCGN3200的pUC骨架交界外的旁侧，正向引物包含ClaI，HindIII，NotI和KpnI限制酶切位点以及napin5′序列的408-423核苷酸。(以EoRV位点算)，反向引物包含与napin718-739序列的互补部分，该序列的5′启动子处包含单个SacI切点。在PCR操作中，按操作说明使用Perkin Elmer/Cetus热循环仪。PCR片段被作用成平端亚克隆入pUC8(Vieira和Messing(1982)Gene，19259-268)并用HincII酶切产生pCGN3217。pCGN3217序列交叉napin插入证实PCR过程中没有被引入不正确的核苷酸，pCGN3217的napin5′序列通过ClaI和SacI的酶切与被相同酶切的pCGN3212连接，从而与napin表达盒的剩余部分连接上。产生的表达盒，即pCGN3221被HindIII酶切，napin表达序列通过凝胶纯化并与用HindIII酶切的pIC20H(Marsh，见上述)连接，最终产生的表达盒是pCGN3223，它包含了氨苄青霉素抗性以及与pCGN1808基本相同的1.725napin5′和1.2653′调节序列。该调节序列被HindIII，NotI和KpnI位点旁侧化，并且单个SalI，BglII，PstI和XhoI克隆位点位于5′和3′非编码区之间。
类似地，也可制备在油质蛋白基因的5′和3′区控制下的转录调节序列的克隆的盒子。Brassica napus由质蛋白基因序列已被Lee和Huang所报道(Plant Phys(1991)961395-1397)。己公布序列的引物被用于PCR反应，从Brassica napus CV.Westar的油质蛋白基因中获得了5′和3′调节区。进行了两个PCR反应，一个用于扩增油质蛋白基因中ATG起始密码子上游的大约950个核苷酸，另一个PCR法扩增油质蛋白基因的TAA终止密码子以及下游大约600bp片段。按照操作手册，PCR产物被克隆入载体pPAMP1(BRL)，从而产生了质粒pCGN7629和pCGN7630，pCGN7629包含了油质蛋白的5′旁侧区，而pCGN7630包含3′旁侧区，PCR引物包含了方便的限制酶切位点，用于将5′和3′的旁侧区一起克隆入表达盒。pCGN7629被PstI酶切后产生的包含5′旁侧区的片段被克隆进入PstI酶切的pCGN7630而产生了pCGN7634，pCGN7634用BsshII(New England Biolabs)酶切后，包含整个油质蛋白表达盒的片段被克隆进入BssHII酶切的pBCSK+(Stratagene)，从而将油质蛋白盒提供给质粒pCGN7636。pCGN7636中的oleosin盒的序列见图4，油质蛋白盒被BssHII，KpnI和XbaI位点旁侧化，并且包含SalI，BamHI和PstI位点以便插入蜡合成酶，还原酶或别的5′和3′油质蛋白e区之间的感兴趣的DNA片段。
插入这样一个盒子的基因序列为植物转化方法提供了表达构建物，例如，这个构建物被插入二元载体可用于下述农杆菌介导的植物转化。B.植物转化的载体二元载体可以从pCGN1578，pCGN1559和由Mc Bride et al.(见上述)描述的其它载体制备，它用包含下列限制酶切位点的接头区代替了pCGN1578和pCGN1559的接头区Asp718/AspI/PacI/XbaI/BamHI/SwaI/Sse8387(PstI)/HindIII。由此产生pCGN1578PASS或pCGN1559PASS和其它其似设计的修饰的载体。AscI，PacI，SwaI和Sse8387有8个碱基限制性识别位点，这些酶可从不同公司获得，New England BiolabsAscI，PacI，Boehninger ManheimSwaI，以及Takara(日本)Sse8387C.用于植物转化的还原酶构建物如下制备利用napin基因中5′和3′调节区的用于在植物细胞中表达还原酶的构建物。
命名为pCGN7571的还原酶cDNA(在上文描述的pCGN1703载体中)用SphI酶切(切点在3′非翻译区的碱基1594-1599处)，同时一个SalI接头在该位点插入，产生的质粒被BamHI和SalI酶切，包含还原酶cDNA的片段凝胶纯化后克隆入BglII/XhoI酶切的pCGN3223(即上文所述的napin盒)产生了质粒pCGN7585。
用HindIII酶切pCGN7585，产生的包含napin5′/还原酶/napin3/构建物的片段被克隆入HindIII酶切的pCGN1578(Mc Bride和Summerfelt，见上述)，产生pCGN7586，它是用于植物转化的一个二元载体。
植物转化构建物即pCGN7589，也包含可在napin启动子作用下表达的希蒙得木还原酶基因，其制备如下pCGN7571通过体外诱变在还原酶编码序列的第一个ATG处引入了NdeI位点，并且在紧邻NdeI位点的上游引入了BglII位点。BamHI接头引入还原酶编码区下游的SphI位点。1.5kbBglII-BamHI片段被凝胶纯化并克隆入BglII-BamHI酶切的pCGN3686(见下文)，产生pCGN7582。
pCGN3686是来源于BluescriptKS+的克隆载体(Stratagene克隆系统；San Diego，CA)，但含有氯霉素抗性基因和一个已修饰的接头区。氯霉素抗性基因是来源于pCGN565，它是建立在PUC12-cm基础上的克隆载体。(K.Buckley博士论文，phiX174裂解基因的调节和表达加利福尼亚大学San Diego，1985)，但包含pUC18接头(Yanisch-Perron，et al.，Gene(1985)53103-119)。pCGN565用HhaI酶切，将包含氯霉素抗性基因的片段切下，再用绿豆核酸酶补平，插入Bluescript KS-(StratageneLaJolla，CA)的EcoRV位点，产生了质粒pCGN2008。pCGN2008的氯霉素抗性基因用EcoRI/HindIII切除，然后用Klenow补平末端，再连接到DraI酶切的BluescriptKS+上。这样包含扩氯霉抗性代替氨苄抗性的DraI酶切片段的克隆被选择出并命名为pCGN2015。pCGN2015的接头区被修饰以提供pCGN3686，其包括下列酶切位点，沿lacZ接头区的5′到3′方向PstI，BglII，XhoI，HincII，SalI，HindIII，EcoRV，EcoRI，PstI，SmaI，BamHI，SpeI，XbaI，SacI.
一个XhoI接头被插入pCGN7582的XbaI位点。包含还原酶基因的BglII-XhoI片段被分离并克隆入BglII-XhoI酶切的pCGN3223，产生的质粒命名为pCGN7802，它缺乏来自希蒙得木基因的5′非翻译前导序列。pCGN7802的napin/还原酶片段用HindIII切下并克隆入HindIII酶切的pCGN1578，产生了pCGN7589。
另一种napin/还原酶构建物制备如下还原酶cDNA pCGN7571(图1)被诱变以在ATG起始密码子的5′端引入SalI位点(位点是ATG5′的8个碱基对)，在紧邻TAA翻译终止密码子的3′端也引入SalI位点，产生PCG7631。pCGN7631用SalI酶切产生包括还原酶编码序列的大约1.5kb片段，该片段被克隆入SalI/XhoI酶切的napin盒pCGN3223。产生的质粒在有意义方向上包含还原酶序列，该质粒命名为pCGN7640。pCGN7640用HindIII酶切，产生的含有油质蛋白/还原酶结构的片段被克隆入HindIII酶切的二元载体pCGN1559PASS，产生二元构建物pCGN7642。
在油质蛋白调节区控制下的用于还原酶表达的构建物的制备如下还原酶编码序列通过SalI酶切pCGN7631获得，并该与SalI酶切的pCGN7636，即油质蛋白盒，相连接，产生的质粒在有意义的方向上包含还原酶序列，该质粒被命名为pCGN7641，PCHN7641用XblI酶切，包含油质蛋白/还原酶构建物的片段克隆进XbaI酶切的二元载体pCGN1559PASS，产生二元构建物pCGN7643。D.还原酶基因的再合成为将希蒙得木还原酶基因的AT含量。从57.5％减少到约51％，再合成了该基因，这并末改变蛋白质的氨基酸组成，而且产生了一个相对均的AT含量的序列，而在再合成之前的希蒙得木编码序列含有75％AT的局部区域，基因再合成是通过Bambot和Russll方案(Bambot.S.B和Russell，A.J(1993)PCR methodsand applications 2266-271)进行的，包含再合成基因的质粒命名为pCGN7675。
来自pCGN7675的再合成的还原酶基因的XhoI-BamHI片段被克隆进已用SalI和BamHI酶切的油质蛋白盒pCGN7636(见前文)。
利用ASP718，油质蛋白-还原酶融合基因被克隆进植物转化载体pCGN1559PASS，产生pCGN7677。这样，pCGN7677基本上同pCGN7643相同，除了来自pCGN7643的希蒙得木酰基辅酶A还原酶基因被低AT含量的合成基因取代。
同一个片段在用SalI和BglII酶切后也可以被克隆进pCGN3223的napin盒。利用ASP718，napin-还原酶基因融合随后被克隆进植物转化载体PCGN1559PASS，产生pCGN7698。质粒pCGN7698与pCGN7642基本一样，仅仅是来自pCGN7642的希蒙得木酰基辅酶A还原酶基因被低AT含量的合成基因取代。
利用Holsters等的方法(Mol.Gen，Genet，(1978)163181-187)，二元载体构建物被转化进农杆菌细胞，如EHA101菌株(Hood et al.，J.Bacteriol(1986(1681291-1301)，并用于下述植物转化方法。实施例7蜡合成活性的分析描述了分析蜡合成酶或蜡合成能力的方法。A放射性标记材料常用蜡合成酶分析的底物，即[1-14C]棕榈酰辅酶A是从Amersham(ArlingtonHeights IL)购买的。为用于链长专一性的研究，其它链长的底物是合成得到的。长链[1-14C]脂肪酸(比活性51-56Ci/mole)，即11-顺-二十碳烯酸，13-顺-廿二碳烯酸，15-顺-廿四碳烯酸可以通过[14C]氰化钾与相应的醇甲磺酰酯反应，然后碱水解乙腈产生游离脂肪酸而制备，游离脂肪酸与醚的重氮甲烷作用转化成它们的甲基酯，并用已制备好的硝酸银薄层色谱(TLC)纯化，脂肪酸甲基酯被水解重新形成自由脂肪酸，放射化学纯度可用三种TLC方法检测常相硅石TLC，硝酸银TLC，C18反相TLC)。用这些方法检测的放射化学纯度达到92-98％。利用Young和Lynen(J.Bio.Chem.(1969)244377)方法，长链[1-14C]酰基辅酶A可从相应的[1-14C]游离脂肪酸制备，其比活为10Ci/mole。[1-14C]十六醛是根据Pletcher和Tate按比例缩小的改进方法(Tet.Lett.(1978)1601-1602)，从[1-14C]十六烷-1-醇的重铬酸盐氧化而制成。产物用硅石TLC纯化，在-70℃己烷溶液中保存。B蜡合成酶活性分析蜡合成酶活性的检测是通过将待测样与40mu[1-14C]酰基辅酶A(一般是棕榈酰辅MM，比活为5.1-5.6mCi/mmol)和200mM油醇温浴，总体积为0.25ml，温浴混合液也包括了20％(W/V)甘油，1mM DTT，0.5MNaCl并由25mM HEPES(4-[2-羟乙基]-1-派嗪乙烷-磺酸)缓冲。本文此处及以后提及的HEPES都是从调至PH为7.5的1M贮存液中取出的。
混合底物是在玻璃小瓶中制备，油醇在使用前才加入，然后加进样品，在30℃温育1小时，然后将分析的试管放置冰上并迅速加入0.25ml异丙醇∶乙酸(4∶1V/V)以终止反应。未放射标记的蜡酯(0.1mg)和油醇(0.1mg)作为载体也被加入。[14C]脂通过Hara和Radin的按比例缩小方法被提取出(Anal.Biochem.(1978)90420)。4ml的己烷/异丙醇(3∶2，V/V)被加入终止的分析，样品振荡打匀，然后加入2ml硫酸钠溶液(6.6％W/V)，样品再一次被振荡打匀。C产物分析蜡合成酶分析的产物分析如下。
在加入Na2SO4并打匀样品以后，提取出一定的有机相百分比进行液闪计数。这个计算被用于估算整个有机相中的总数量，有机相的另一部分被提取出用氮气干燥，然后重溶于己烷。为进行脂类分析，使用了硅石TLC板，板在己烷/二乙醚/乙酸(80∶201V/V/V)中展开，利用AMBIS放射成绿系统(AUBIS系统Inc.San Diego，CA)，可检测到在脂类，蜡酯，自由脂肪酸，脂肪醇，极性脂类中的放射分布。如果必要的话，单个脂类可从TLC板上回收，进行进一步分析。D底物特异性具有不同碳链长度和不饱和度的酰基辅酶A和醇底物被加入具有蜡合酶活性的微粒体膜片来检测希蒙得木蜡合成酶的底物识别范围，蜡合成酶的活性可按实施例1检测，用80mM的酰基辅酶A底物和100mM的放射性标记的油醇来检测酰基特异性。用100mM醇底物和40mM的放射性标记的二十碳烯酰辅酶A来检测酰基特异性，实验结果见表4。表4希蒙得木蜡合成酶酰基和醇底物的特异性底物 蜡合成酶活性(皮摩尔/分钟)结构 酰基 醇基120 12 100140 95 145160 81 107180 51 56200 49 21220 46 17181 22 110182 7 123201 12272221 39 41241 35 24
上述结果表明，希蒙得木蜡合成酶利用广泛的脂酰辅酶A和脂肪醇底物。
此外，蜡合成酶对于不同酰基硫酯底物的活性，类似地用棕榈酰辅酶A，棕榈酰酰基载体蛋白和N-乙酰-S-棕榈酰半胱胺，进行检测最高活性是用酰基辅酶A作为底物。用酰基酰基载体蛋白为底物的活性是用酰基辅酶A为底物的10％，用N-乙酰-S-棕榈酰半胱胺作为底物检测不到活性。
实施例8植物转化方法开发了各种方法用于将感兴趣的DNA序列插入植物宿主的基因组中，从而获得影响表型改变的序列的转录或转录及翻译。
芥属转化高芥子酸的种子，如栽培品种Reston或Brassica napus的Canola变种在95％乙醇中浸泡2分钟，种子表面在包含一滴吐温20的1.0％次氯酸钠溶液中灭菌45分钟，用无菌蒸馏水洗三次，然后种子和1/10浓度的Murashige基本有机培养基(Gibco；Grand Island，NY)放进Magenta盒子里，基本培养基补加了吡哆素(50μg/l)，烟酸(50μg/l)，甘油(200μg/l)。和0.6％phytagar(Gibco)PH5.8。种子在22℃于Percival Chamber中发芽，在16小时的光周期中，用冷荧光和强度大约为65μEm-2S-1的红光照射。
下胚轴从已生长5-7天的籽苗上切下，切成长度大约为4mm的片，放置在饲养板上(Horschet al.，Science(1985)2271229-1231)。饲养板在使用的前一天准备好，它是用1.0ml烟草悬浮培养液铺在培养皿上(100×25mm)，该培养皿包含大约30ml MsSalt base(Carolina Biological，Burlington，NC)，100mg/l肌醇，1.3mg/l硫胺素-HCl，以及含3％蔗糖的KH2PO4200mg，2，4-D(1.0mg/l)，0.6％W/V phytagar，在高压灭菌之前调PH至5.8(MS0/1/0培养基)。一个灭菌的滤纸片(华特曼3mm)在使用前放在饲养板上面。烟草悬浮培养液每星期转移10ml到100ml新制MS培养基中传代培养，MS培养基中加上了2，4-D(0.2mg/l)和激动素(0.1mg/l)。在不用饲养细胞时，下胚轴移植体便被切除并放在滤纸圆片上，滤纸片已放在MS0/1/0培养基上面，所有下胚轴移植体便被切除并放在滤纸圆片上，滤纸片已放在MS0/1/0培养基上面，所有下胚轴移植体均在饲养板上预保温24小时(22℃，30μEm-2S-1到65μEM-2S-1的光强范围)。
根癌农杆菌菌株EHA101的单克隆包含一个含目的基因的二元质粒，该克隆被转移到5ml MG/L肉汤培养基中，30℃过夜培养。下胚轴移植体在7-12ml含1×108个l/ml的肉汤培养基中浸泡10-25分钟后放置在饲养板上。每升MG/L肉汤培养基含5克甘露糖，1克L-葡萄糖酸或1.15克谷氨酸钠，0.25克KH2PO4，0.10克氯化钠，0.10克MgSO4、7H2O，1mg生物素，5克蛋白胨，2.5克酵母提取物，调PH至70。下胚轴外植体与农杆菌共培养48小时后，被转移到B50/1/0愈伤组织诱导培养基中，该培养基包含过滤灭菌的羧苄青霉素(500mg/l，在高压灭菌后加入)和卡那霉素的硫酸盐25mg/l(Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN)。
在65μEM-2S-1持续光照培养3-7天后，可以在切口表面看到愈伤组织，然后下胚轴的外植体被转移到茎诱导培养基，B5BZ(B5盐和维生素加上3mg/l苄基氨基嘌呤，1mg/l玉米素。1％蔗糖，0.6％phytagar，并调PH至5.8)。这个培养基也含羧苄青霉素(500mg/l)和卡那霉素硫酸盐(25mg/l)。下胚轴每两个星期在新制的茎诱导培养基上传代培养。
一到三个月以后，茎从下胚轴愈伤组织处再生出来，至少1cm高的绿色茎从愈伤组织上切下来，并放在包含B5盐，维生素，1％蔗糖，羧苄青霉素(300mg/l)，卡那霉素硫酸盐(50mg/l)和0.6％W/V phytagar的培养基上，2-4星期后，保持绿色的枝条在茎部被切下，移植到Magenta盒子中，它包含根诱导培养基(B5盐和维生素，1％蔗糖，2mg/l吲哚丁酸，50mg/l的卡那霉素硫酸盐及0.6％Phytagar)，绿色已扎根的枝条被用于硫酯酶活性的检测。
拟南芥转化转基因的拟南芥植物可以根据Valverkens et al所述(Proc.Nat，Acad，Sci，(1988)855536-5540)从农杆菌介导的转化中获得。通过Holsters et al方法(Mol.Gen Genet(1978)163181-187)，构建物被转化到农杆菌细胞中如EHA101菌株(Hood et al.，Bacteriol(1986)1681291-1301)花生转化感兴趣的DNA序列可作为表达盒通过粒子轰击引入植物基因组中，该表达盒至少包含一个启动区，一个感兴趣的基因，一个终止区。
简单地说，0.5mM-3mM大小的钨或金粒子被表达盒DNA所包裹，这DNA可以以液体混合物形式或干的DNA/颗粒沉淀存在。
用于粒子轰击的靶组织可以来自具子叶的外植体，茎分生组织，未成熟的小叶或花药。使用BiolisticsTM粒子枪(Dupont，Wilmington，DE)实现用DNA包裹的颗粒轰击靶组织，颗粒放进枪管的不同位置，离枪口1到14厘米，靶组织放在固定的板下，在组织上20cm处检测。在轰击的同时，组织用尼龙网或网眼范围从10mM到300mM的尼龙网保护。
轰击后，植物可以按Atreya，et al.(Plant Science Letters(1984)34379-383)方法再生。简而言之，胚轴组织或子叶片放在MS培养基上(Murashige和Skoog，Physio.Plant(1962)15473)(子叶片需要MS培养基中加入2.0mg/l6-苄基腺嘌呤(BA))，在黑暗中培养1个星期，25℃±2℃，然后转移到冷荧光(6.8Wm2)持续照射。在第10天的培养物中，小植株被转移到有无菌土的盒中，在暗处放置3-5天后移至温室，可能的转基因苗已经扎根，这时可通过各种已知的方法证实外源DNA整合进入植物基因组。实施例9分析已转化的植物用pCGN7586napin/还原酶构建物转拟南芥植物，它产生的种子被用来进行还原酶活性分析，方法见例1C。在15个已分析的植物中，有11个已经发现有还原酶活性，其比活性范围在5到30pmol/min/mg蛋白。Westrn分析证明在转基因的拟南芥植物胚胎中的还原酶大约占总蛋白的0.01％。
已转化的植物被用来分析计算脂肪醇和蜡酯成分，这样的植物可以用上面提到的农杆菌转化方法制备得到。植物可用来作蜡酯存在的分析，例如用TLC方法从蜡酯中分离三酰甘油酯(TAG)，GC分析法可对产生的蜡酯作进一步分析。A.转化植物的气相色谱分析法(GC)非酯化油或粗提油不能通过常用的GC柱，因为它必须的高温易破坏TAG成分(大约350℃到365℃)例如SUPELCOWANXTM10柱的最高温度为280℃。
从成熟的拟南芥的种子中提取的脂类，被衍生成醇(Browse et al.(1986)A.B.152141-145)并用前文提及的GC分析醇成分，分析表明在3个已转化的拟南芥植物中存在20∶1醇。
通过下列方法，来自对照油菜子植物和pCGN7643油菜子植物的种子油在甲醇/硫酸中转酯化。来自每个植物的25个种子在4ml含硫酸的5％甲醇溶液中80℃温浴90分钟，再加入1ml0.9％NaCl和1ml已烷。取出上层有机相进行分析，用SUPELCOWAXTM10柱气相色谱(GC)分析，表明pCGN7643样品含22∶1醇，而末转化的对照植物并未含醇。用质谱仪(MS)也证明了该峰为醇。
从T2种子提取的粗油也被用来分析，从每个植物中采集25个种子，放入2ml己烷中进行均化作用。抽提物被过滤并用CHROMPAKTM甘油三酯柱(最高温度大约为370℃)进行高温GC分析，这个柱适合TAG及蜡分析。一些与蜡酯保留时间一致的峰可以在pCGN7643样品中检测到，但该样品中没有与脂肪醇一致的峰。在末转化的样品中不存在蜡酯峰，最显著的峰是与40∶2蜡酯保留时间一致的峰。由于唯一检测到的在转酯油的脂肪醇是22∶1醇，因此这个最显著的蜡酯峰被认为是由18∶1脂肪酸与22∶1脂肪醇酯化而成。
高温GC分析方法被用于进一步分析在甲醇/硫酸中转酯化的转化的油菜子油。在pCGN7643植物转酯油中并不存在蜡酯峰，这是因为从油的蜡组分转酯化产生的是脂肪酸甲酯和醇。衍生油的22∶1脂肪醇成分存在于一些转化的油菜植物种子中，从重量上估算，大约组成了总脂的0.5％。
用CHROMPAKTM甘油三酯柱对T2种子油(油菜子植物)进行高温GC/MS分析。T2油的质谱(已选择离子监测)表明了峰的保留时间及峰数和转基因油中的38∶2，40∶2，42∶2及44∶2蜡酯峰一致。这些峰在对照油中不存在。来自pCGN7643植物油的40∶2蜡酯峰的质谱证实了它是由22∶1醇和18∶1脂肪酸组成。
使用甘油三酯柱的高温GC分析pCGN7643植物的T3种子油，表明转基因油包含40∶2蜡酯峰，该峰同GC/MS分析T2种子油的特征一致。蜡酯峰在末转化的对照油中没有检测到。
用质粒pCGN7677转化reston植物，从30个转基因的reston植物上采集T2种子进行油成分分析。在用此质粒转化的植物中，一半植物的衍生油表明它比用pCGN7643转化最好的植物中油的醇含量还高。在采集的T2种子中，用pCGN7677转化最好的植物中的脂肪醇含量为0.9％，而用pCGN7643转化的最高含量为0.16％。取含脂肪醇最高的pCGN7677植物的50个半种子(half-seeds)进行分析。因为T2种子是接合(segrating)种子。半种子是转基因结果的更好检测，并且包含了末表达的和杂合子种子，以及有转基因性状的纯合种子。取自7677-R-15和7677-R-16植物的T2半种子衍生油表明含有最高的醇含量。在这些植物种子中，衍生油中有3.5％的脂是脂肪醇。由于在蜡酯中，脂肪醇占了大约一半的总重量，因此在转基因植物中，能产生最高占油总重量7.0％的蜡酯。
用单个T2种子(7677-R-15-49)油作的高温GC分析表明，存在一系列蜡酯，可能是由38∶1，38∶2，40∶1，40∶2，40∶3，40∶4，42∶1，42∶2，42∶3，44∶1，44∶2和44∶3(图3)组成，其中仅仅38∶2，40∶2，42∶2和44∶2占相当大比例。表5提供了使用GC分析来自一些单个7677-R-15种子油得出的油中蜡酯相对量的结果，是给出的结果是蜡总量的百分比。
表5蜡酯种子 38∶240∶242∶244∶26 6.2 39.8 21.5 32.5106.1 36.5 23.7 33.7110.0 31.3 18.4 50.3123.7 32.5 21.9 41.8173.9 27.0 14.8 54.2184.0 32.4 22.6 40.9193.1 27.2 16.0 53.7215.3 36.2 21.9 36.6233.2 27.6 17.4 51.8255.6 38.2 21.2 35.0325.7 35.0 21.6 37.7366.1 17.3 12.9 63.7404.3 29.7 16.5 49.6447.2 17.7 13.4 61.7486.0 36.2 21.6 36.2493.520.117.958.5525.833.520.739.9574.029.218.348.5590.032.418.748.9603.932.118.545.5674.129.814.551.5694.233.721.141.0715.230.118.046.7825.533.220.141.1884.229.617.648.7895.732.619.542.2905.536.921.636.0936.636.422.034.9940.036.120.143.8980.034.820.145.1希蒙得木 9.6 35.0 47.4 8.0在许多从7677-R-15半种子取出的油中，按含蜡酯丰富程度排列，从高到低是44∶2，40∶2和42∶2。相反在7643转化的Reston植物中，最丰富的蜡酯是40∶2蜡酯。在7677-R-15的一些半种子中，44∶2蜡酯组成了油中蜡组分的60％以上。这也被高温GC图谱所证实(图3)。
7677-R-15植物油的图谱与希蒙得木植物的蜡酯图谱有相当大差别，在希蒙得木中，42∶2蜡酯占蜡含量的47％，并且44∶2蜡酯成分仅占油的8％。
含44∶2成分为主要蜡酯的蜡组合物油比希蒙得木油有优势，占主导地位的蜡酯分子量越高，转基因的蜡组合物就具有更高的熔点，更高的稳定性及更高的耐剪切力。含60％或更高比例的44∶2蜡酯的油组合物，通过从高表达的T2植物分馏三酰甘油酯/蜡酯混合油，结晶。或在相应的蜡和三酰甘油酯成分中溶剂抽提法，很容易获得。B.已纯化的蜡成分分析制备薄层色谱被用于从蜡中浓缩油菜子油样，并从油中去除甘油三酯。油样点样于Silica-GTLC板上，在己烷∶乙酸乙酯(95∶5)中展开，通过吲哚染色识别出蜡带的位置，蜡成分从硅面介质上用己烷∶乙酸乙酯(70∶30)洗脱下来，然后用N2干燥，再重悬于己烷，最后用甘油三酯柱的高温GC分析蜡组分。从pCGN7643植物取的样品中，40∶2蜡酯峰是最丰富的成分之一，但是它并不存在于未转化的对照样中。
随后用TLC纯化的蜡用甲醇/硫酸转酯，高温GC分析表明样品中不再存在蜡峰，这是因为从蜡酯中转酯化应产生脂肪酸甲酯和醇。
被转酯的蜡组分用SUPELCOWAXTM10柱的GC分析表明，来自pCGN7643植物转基因样品包含大部分22∶1脂肪醇峰，而来自对照样品的组分并不包含脂肪醇。
用TLC纯化的蜡也用银柱HPLC作进一步分析，从pCGN7643转基因植物中提取的油中，有一些峰的洗脱保留时间与44∶2，42∶2，40∶2和38∶2的希蒙得木蜡标准样一致。这些峰在末转化的对照油中不存在。
结合正相TLC和银HPLC从7643油中纯化40∶2蜡酯，这些纯化的蜡酯被转酯化。GC分析表明蜡酯是由18∶1脂肪酸和20∶1的脂肪醇组成，用高温GC和银柱HPLC处理纯化的样品，表明当从转基因油中分离出的蜡酯，并与参考标准样混合时，两个化合物分作为单峰被洗脱。
纯化的蜡酯也用红外光谱，核磁共振及高分辨质谱仪进行分析，样品的红外光谱与核磁共振谱和参考标准样的谱相比较，证实了40∶2蜡酯存在于转基因油中，高分辨的质谱和参考标准样的谱相比较，证实了40∶2蜡酯存在于转基因油中，高分辨的质谱分析蜡酯表明它有一个与40∶2蜡酯相似的分子量和分子式。
上述结果证明了在植物细胞中产生蜡酯的能力，植物细胞产生蜡酯的方法包括异源序列转化植物，表达脂酰还原酶以及植物细胞生长各步骤。包含长链蜡酯的细胞举例示出，其是用希蒙得木还原酶核苷酸序列转化的。还提供了获得其它还原酶蛋白和编码序列，用来在植物细胞中产生不同的脂肪醇和蜡的方法。
在本文中引用的所有的出版物及专利申请都作为本文的参考文献，就象每个出版物或专利申请在参考文献中被专门介绍作为本文的参考文献。
尽管为清楚和便于理解起见，本发明已通过实施例和附图进行了较详细的描述，根据本发明所述，本领域人员显而易见的是在不背离所附权利要求书的实质或范围内可作出一定的改变和改进。
权利要求
1.在一种天然不产生希蒙得木脂酰还原酶的植物细胞中生产蜡酯的方法，所述的方法包括在调节因子的控制下培养具有编码希蒙得木脂酰还原酶的核酸序列的植物细胞，所述的调节因子能使所述的植物细胞产生希蒙得木脂酰还原酶，所述的方法的改进包括从AT百分含量低于55％的再合成序列中表达所述的还原酶。
2.权利要求1的方法，其中所述的还原酶序列的AT百分含量低于52％。
3.权利要求1的方法，其中所述的还原酶序列的AT百分含量约为51％。
4.权利要求1的方法，其中所述的编码序列为图2所示的再合成序列。
5.权利要求1的方法，其中所述的植物细胞为种胚细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述的细胞为芥属细胞。
7.一种包含由权利要求1的方法生产的蜡酯的种胚细胞。
8.根据权利要求7所述的芥属种胚细胞。
9.一种天然不产生希蒙得木脂酰还原酶的植物种胚细胞，包含具有高于1.0％(重量)蜡酯的体内脂类贮存。
10.如权利要求9所述的细胞，其中所述的体内脂类贮存包括高于5.0％(重量)蜡酯。
11.如权利要求10所述的细胞，其中所述的体内脂类贮存包括高于7.0％(重量)蜡酯。
12.根据权利要求9所述的芥属细胞。
13.如权利要求9所述的细胞，其中所述的蜡酯主要为44∶2蜡酯。
14.如权利要求13所述的细胞，其中所述的44∶2蜡酯包括所述的体内脂类贮存的高于50％蜡酯组分的组分。
15.如权利要求14所述的细胞，其中所述的44∶2蜡酯包括所述的体内脂类贮存的高于60％蜡酯组分的组分。
16.由权利要求7-15任一项的细胞获得的油。
17.包含高于10％44∶2蜡酯的油组合物。
18.包含高于50％44∶2蜡酯的油组合物。
19.包含高于60％44∶2蜡酯的油组合物。
全文摘要
本发明提供了在植物细胞中生产蜡酯的方法。本发明还提供了含有蜡酯、新的油组合物以及包含44∶2蜡酯作为主要组分的蜡组合物的植物细胞。
文档编号C12N15/53GK1129014SQ95190504
公开日1996年8月14日 申请日期1995年6月1日 优先权日1994年6月1日
发明者迈克尔·莱斯纳, 詹姆斯·乔治·梅茨 申请人:卡尔金公司