专利名称：尖孢镰孢的青霉素v酰胺水解酶基因的制作方法
青霉素V酰胺水解酶可用于将青霉素V(苯氧基-甲基青霉素)酶促水解成6-氨基青霉烷酸(6-APA)。6-APA是生产半合成青霉素需使用的活性β-内酰胺核。已在真菌、链霉菌和细菌中发现了多种青霉素V酰胺水解酶(PVA)(Lowe et al.，1986，Biotechnol.Lett.8151-156)。Lowe等人描述了来自尖孢镰孢(Fusariun oxysporum)菌株的PVA酶活性；但此酶尚未分离纯化。
本发明涉及已分离的核酸分子，它编码全部或部分的尖孢镰孢菌株435的PVA。该PVA基因已被克隆、测序和表达。
本发明另一方面涉及尖孢镰孢菌株435的新启动子、含有全部或部分PVA基因和/或新启动子的表达载体和含有表达载体的宿主细胞。本发明另一方面还涉及尤其当苯氧乙酸作为诱导物存在时PVA的生产。
图1完整PVA酶六肽片段的氨基酸序列。N-未端的氢基酸序列为SEQ.ID.NO.1；肽氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2；肽B的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.3；肽B2的基酸序列是SEQ.ID.NO.4；肽C的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.5；肽D的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.6；肽E的氨基酸序列为SEQ，ID.NO.7。
图2寡核苷酸探针。逆转录肽C的七个氨基酸(SEQ，ID.NO.5)，可得到一套四个寡核苷酸的探针。这七个氨基酸的序列为SEQ，ID.NO.8；由SEQ.ID.8逆转录的DNA序列为SEQ.ID.NO.9；与SEQ.ID.NO.9互补的DNA序列是SEQ.ID.NO.10；寡核苷酸探针是SEQ.ID.NO.11。
图3多种DNA和肽片段。PVA N-末端氨基酸序列为SEQ.ID.NO.12；2585翻译氨基酸序列为SEQ.ID.NO.13，2585DNA序列为SEQ.ID.NO.14；2585-MDNA序列为SEQ.ID.NO.15；2585-FL翻译氨基酸序列与SEQ.ID.NO.12相同；编码链的2585-FL DNA序列为SEQ.ID.NO.16；模板链(即与编码链互补)的2585-FL DNA序列为SEQ.ID.NO.17。所有核苷酸酸序列(除SEQ.ID.NO.17外)都以从左至右的5’至3’方向表示。
图42585-FL的图示说明。
图5基因组PVA基因克隆的图示说明。
图6PVA cDNA(SEQ.ID.NO.18)以及相应的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.19)。划线的DNA序列(碱基对1348后1368的SEQ.ID.NO.20)与20mer探针(SEQ.ID.NO.11)互补。星号表示终止密码子。
图7PVA基因组DNA(SEQ.ID.NO.21)以及相应的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.22)。启动子为碱基对编号1至240(SEQ.ID.NO.23)。第一个星号表示转录起始密码子。第二个星号表示终止密码子。
图8PWB 19N构建的图示。
图9PSJC62构建的图示。
图10PBMFXPVA6构建的图示。
图11PBMFXPPVA7构建的图示。
图12PFO20构建成的图示。
图13PFO20-P构建成的图示。
图14PBMPVA-P构建的图示。
图15PFO20-M构建的图示。
图16PBMPVA-M构建的图示。
图17PBMPVA-P/DAA04构建的图示。
图18PBMPVA-M/DDA04构建的图示。
本发明涉及分离的核酸分子。它包含编码全部或部分失孢镰孢PVA的核酸序列。优选地，此核酸分子是DNA分子，此核酸序列是DNA序列。本文中所有DNA序列都是由其从左至右的定向为常规的5’至3’方向的式子表示(唯一的例外是图3的SEQ.ID.NO.17)。进一步优选的DNA序列具有基本上由图6和7的所有或部分核苷酸序列(特别是SEQ.ID.NO.18和SEQ.ID.NO.21；或者与这些DNA序列其中之一互补的DNA序列；或者与这些DNA序列其中之一的互补DNA序列杂交的DNA序列。“严格条件”是指不亚于本文“优选实施方案的详细实施例”部分所述的严格条件。就编码部分PVA的核苷酸序列(例如DNA序列)而言，优选此核苷酸序列的长度至少约为20个核苷酸。
优选的DNA片段是SEQ.ID.NO.11的探针和SEQ.ID.NO.23的启动子。
本发明的PVA分子不必具有催化活性，例如，无催化活性的PVA或其片段可用于产生此蛋白质的抗体。
我们也期望本发明包括经修饰的序列，本申请中所用的术语“经修饰的”，当指的是核苷酸或多肽序列时，意思是与在自然界中发现的野生型序列不同的核苷酸或多肽序列。
使用本技术领域一般熟知的各种方法即可得到本发明的DNA序列，至少可使用三种可选择的主要方法(1)从含有此序列的基因组DNA或互补DNA(cDNA)中分离双链DNA序列；(2)化学合成此DNA序列；和
(3)通过聚合酶链反应(PCR)合成此DNA序列。
在第一种方法中，需筛选出基因组或cDNA文库以鉴定编码全部或部分PVA的DNA的序列。例如，可筛选出尖孢镰孢的基因组DNA文库以鉴定编码全部或部分PVA的DNA的序列。可使用多种技术筛选基因组DNA或cDNA文库。
例如，在对已变性为单链形式的基因组DNA或cDNA的克隆拷贝进行的DNA/DNA杂交步骤中可使用经标记的单链DNA探针序列，此序列可复制出编码全部或部分PVA的靶基因组DNA或cDNA中所存在的序列。
使用免疫印迹技术也可筛选出编码全部或部分PVA的基因组DNA或cDNA的基因组DNA或cDNA文库。
在适于免疫印迹或杂交技术的一种典型筛选方法中，首先在琼脂平板上涂布通常包含于载体中的基因组DNA文库或cDNA文库，然将克隆转移到如硝酸纤维膜的滤膜上，再与DNA探针杂交或将克隆与抗体结合以鉴定出含有编码全部或部分PVA的基因组DNA或cDNA的那些克隆。
在第二种方法中，本发明编码全部或部分PVA的DNA序列可以化学合成，例如，编码PVA的DNA序列可被合成为一系列含100个碱基的寡核苷酸，它们可被顺序连接(通过适当的末端限制性位点或互补的末端序列)以形成正确的线形核苷酸序列。
在第三种方法中，可使用PCR合成本发明编码全部或部分PVA的DNA序列。简单地说，可将与靶DNA序列的相反链杂交的长度至少为15个碱基的成对合成DNA寡核苷酸(PCR引物)用于酸促扩增靶序列DNA的间插区域。将模板热变性，使引物退火并用DNA聚合酶使退火引物的3’-未端延伸，重复上述循环可导致由PRC引物5’-未端限定的片段的扩增，例见White et al.，Trends Genet.5，185-189(1989)。
本发明的DNA序列可以根据本发明的多种方式被使用。此DNA序列最明显的用途是制备PVA以用于将青霉素V转变成6-APA。然而它们也可用作DNA探针以筛选出其它eDNA和基因组DNA文库，从而通过杂交筛选出编码PVA相关蛋白质的其它DNA序列。另外，本发明编码全部或部分PVA的DNA序列也可用作DNA探针以筛选出其它eDNA和基因组DNA文库，从而通过杂交筛选出编码除尖孢镰孢外的生物体PVA分子的DNA序列。
本发明编码全部和部分PVA的DNA序列也可经修饰(即突变)以制备多种突变。这种突变可以是简并的，即突变改变了由突变密码子编码的氨基酸序列，也可以是非简并的，即突变不改变由突变密码子编码的氨基酸序列。例如，可使用多种本技术领域的已知方法，通过突变PVA DNA序列可导致所编码多肽中一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入、倒位或添加，从而制备经修饰的DNA序列。例如，可使用Morinaga、Taylor和kunkel等(Moringa et al.，Bio/Technol.2，636-639(1984)，Taylor et al.，Nucl，Acicls Res.13，8749-8764(1985)andkunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，482-492(1985))所述的定点诱变法。另外，可从供货商处购买定点诱变的试剂盒，例如可从AmershamCorp(arlington Heights，IL)购买进行定点诱变的试剂盒，另外也可使用Sayers等人(Nucl Acids Res.16，791-802(1988))所述的断裂、缺失和截短法。简并和非简并突变都有助于产生或使用本发明多肽。例如这些突变可使产量更高、纯化较容易，或者可提供额外的限制性内切酶识别位点。所有这种经修饰的DNA和多肽分子都包括在本发明的范围之内。
本发明尤其涉及图7(SEQ ID NO.23)所示的PVA的新启动子。本发明的新启动子可与编码其它有用蛋白质或多肽的其它已知DNA序列一起使用。
本发明进一步涉及含有编码全部或部分PVA的DNA序列和/或PVA启动子的表达载体。此表达载体优选含有具有基本上由图6或7核苷酸序列的DNA序列其中之一的全部或部分，进一步优选的此表达载体含有与编码全部或部分PVA的DNA序列有效连接的一个或多个调节DNA序列。本文所用术语“有效连接”是指调节DNA序列可引导复制和/或表达编码全部或部分PVA的DNA序列。
本发明使用的表达载体通常为“质粒”形式，它指的是环状双链DNA环，其载体形式不与染色体结合。然而，本发明还将包括具有等同功能并在以后的技术中会公知的其它形式的表达载体。
用于本发明的表达载体典型地含有复制起点，位于此DNA序列前方(即上游)的启动子(优选为SEQ ID NO.23的启动子)，其后为编码全部或部分结构蛋白质的DNA序列，如PVA、D-氨基酸氧化酶、单克隆抗体、胰岛素、干扰素、表皮生长因子、生长激素等等。编码全部或部分结构蛋白质的DNA序列后紧随的是转录终止序列和其作的载体。此表达载体也可包括现有技术已知的其它DNA序列，例如提供表达产物稳定性的稳定性前导序列，提供表达产物分泌的分泌前导序列，允许调制结构基因表达的序列(例如通过培养基中营养物或其它诱导物的存在或缺乏)，能为经转化的宿主细胞提供表型选择的标记序列，为质粒提供有丝分裂稳定性的稳定性因子如着丝粒，为限制性内切酶裂解提供位点的序列。实际使用的表达载体的特征必需与所使用的宿主细胞相容。例如当在真菌细胞系统中克隆时，表达载体应含有分离自真菌细胞基因细胞基因组的启动子[例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC启动子和尖孢镰孢的PVA的启动子]。某种表达载体可含有真菌自主复制序列[ARS；例尖孢镰孢和啤酒酵母(Saccharomyces cereviziae)的ARS]，它可在真菌宿主体内启动自身复制质粒的产生。优选本发明的真菌表达载体不具有真菌ARS序列，因此可通过质粒进入宿主细胞使之整合到宿主染色体上，优选这种整合是由于它可加强遗传稳定性。本发明所期望的表达载体至少应能指导在大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制以及在真菌细胞中的整合，优选能表达本发明的PVA DNA序列。不同大肠杆菌宿主中的适当复制起点包括例如Col E1质粒复制起点，适当的启动子包括例如构巢曲霉的trp C启动子，尖孢镰孢的PVA启动子以及大肠杆菌的neo-r基因启动子，适当的终止序列包括例如构巢曲霉的trp C终止子，尖孢镰孢的PVA终止子以及大肠杆菌的neo-r基因终止子。还优选表达载体包括编码选择性际记的序列，选择性标记优选为抗生素抗性，可方便地使用腐草霉素抗性(对真菌细胞)、氨苄西林抗性和新霉素抗性(对细菌细胞)作为选择性标记，所有这些物质都是现有技术中已知的，并且可商购。
特别优选下文和图10所述的被称作pBMFXPVA6的表达载体，它含有编码PVA的DNA序列，或者优选与pBMFXPVA6特征一致的表达载体。也优选分别在下文和图8，9，11，14和16中所述的被称作PWB19N、PSJC62、PBMFXPVA7、PBMPVA-P和PBMPVA-M的表达载体或者与PWB19N、PSJC62、PBMFXPVA7PBMPVA-P和PBMPVA-M特征一致的表达载体。
根据布达佩斯条约，已于1994年12月14日将含有PBMFXPVA7、PBMPVA-P和PBMPVA-M的宿主细胞大肠杆菌DH5α菌株保藏于美国典型的培养物保藏中心(Rockville，Maryland)，其入藏ATCC登记号分别为69721、69722和69720。
可使用现有技术已知的一般重组DNA技术构建含有所需编码和控制序列的适当表达载体，这些技术中有许多描述于Sambrook etal.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd edition，Cold SproingHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。
本发明还涉及含有表达载体的宿主细胞，此载体含有编码全部或部分PVA的DNA序列和/或SEQ ID NO.23的启动子。优选此宿主细胞所含有的表达载体包含具有基本上由图6或7所示核苷酸序列的DNA序列其中之一的全部或部分。进一步优选此宿主细胞含有的表达载包含能指导复制和/或表达编码全部或部分PVA的DNA序列，并与之有效连接的一个或多个调节DNA序列。另外包括的宿主细胞含有的表达载体包含已经过修饰(例如断裂、缺失或截短)的DNA序列以编码无催化活性的PVA分子。适当的宿主细胞既包括真核宿主细胞，也包括原核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞。适当的真核宿主细胞包括例如枝顶头孢(Cephalosprinum acremonium)，尖孢镰孢和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)细胞。
特别优选的宿主细胞是尖孢镰孢菌株。
可通过现有技术已知的多种方法将表达载体引入宿主细胞，例如可通过聚乙二醇介导的原生质转化法来进行表达载体对宿主细胞的转染。然而也可使用例如电穿孔法、biolistic注射或原生质体融合的其它方法将表达载体引入宿主细胞。
一旦表达载体已被引入适当的宿主细胞，可在允许所需多肽大量表达的条件下培养此宿主细胞，在优选的情况下多肽分子含有全部或部分PVA。
可通过下述6种普通方法中的一种或多种鉴定出含有表达载体的宿主细胞，此载体含有编码全部或部分PVA的DNA序列(a)DNA-、DNA杂交；(b)标记物基因功能的存在或缺乏；(c)通过测量宿主细胞中PVA mRNA转录物的产生来评价转录水平；(d)用免疫法检测基因产物；(e)比色检测和(f)酶测定，酶测定为鉴定的优选方法。
在第一种中方法中，使用与DNA序列互补的探针，通过DNA-DNA或RNA-RAN的杂交可检测出编码全部或部分PVA的DNA序列的存在。
在第二种方法中，根据某种标记物基因功能(例如乙酰胺的利用、对抗生素的抗性、对杀真菌剂的抗性、尿嘧啶原养型等等)的存在或缺乏可鉴定和筛选出重组表达载体宿主系统。在与调节PVA编码序列所用启动子相同或不同启动子的调节之下，将标记基因置于与编码全部或部分PVA的DNA序列相同的质粒之中。响应诱导或选择的标记物基因的表达表明存在有完整的重组表达载体，它携有编码全部或部分PVA和DNA序列。
在第三种方法中，可通过杂交测定法评价PVA mRNA转录物的产生。例如可使用与RNA序列互补的探针，通过Northern印迹法或核酸酶保护测定来分离和分析聚腺苷酸化的RNA。另外，可抽提宿主细胞的总核酸和测定其与这种探针的杂交。
在第四种方法中，可通过例如Western印迹法以从免疫学上评价全部或部分PVA的表达。
在第五种方法中，可通过互补分析评价PVA蛋白质的表达。例如在已知缺乏这种酶的细胞中，通过在培养基平板上将无色底物苯氧乙酸-P-硝基酰苯胺酶促水解成黄色P-硝基苯胺可检测出PVA活性的表达。
在第六种方法中，使用已知方法通过测定PVA酶的活性可测出PVA的表达。例如可使用本文“优选实施方案的详细实施例”部分所述的测定法。
可通过现有技术已知的多种方法来测定本发明表达载体、质粒或DNA分子的DNA序列。例如可使用Sanger等人所述的双脱氧链终止法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467(1977)]或Maxam-Gilbert法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，560-564(1977)]。
当然，应理解不是所有表达载体和DNA调节序列都能起同样好地表达本发明DNA序列的作用。也不是所有宿主细胞对相同表达载体都能起到同样好的作用。然而，本技术领域普通熟练人员利用本发明范围的情况下可在表达载体、DNA调节序列和宿主细胞中作出选择。
本发明进一步涉及产生PVA的方法，它包括培养含有表达PVA的表达载体的宿主细胞。优选地，此表达载体为pBMFXPVA6或PBMFXPVA7。我们惊奇地发现在苯氧乙酸盐作为诱导物存在时，可极大地加强PVA的产生。
本发明进一步涉及含有全部或部分PVA的多肽分子，所说多肽分子优选地具有基本上由图6或7所示的氨基酸序列其中之一的全部或部分。
至于含有部分PVA的多肽分子，优选此多肽分子的长度至少约为10个氨基酸。
本文鉴定的所有氨基酸残基皆为天然L-构型。为保持标准多肽命名(J.Biol.Chem.243，3557-3559(1969))，下列对应表中表示的是氨基酸残基的缩写。
对应表
所有氨基酸序列都由其从左至右的方向为常规的氨基未端至羧基未端方向的式子来表示。
使用本领域一般熟练人员熟知的方法，通过合成的方式，即由其组成氨基酸化学合成多肽可得到本发明多肽。例如，可使用Houghhton等人[Proc.Natl.Acad.Sci.82，5131-5135(1985)]所述的固相法。优选通过原核或真核或真核宿主细胞表达编码全部或部分PVA的DNA序列产生并得到此多肽，或者优选体外翻译由编码全部或部分PVA的DNA序列所编码的mRNA得到此多肽。例如，可使用如上所述的PCR合成图6或7的DNA序列，并将之插入适当的表达载体，可以轮流使用此载体转化适当的宿主细胞。然后培养此重组宿主细胞以产生PVA。通过这些方法产生多肽的技术是本领域已知的，在本文中也有所描述。
然后分离用此方法产生的多肽，并使用多种蛋白质纯化技术将之纯化至一定程度。例如可使用如离子交换层析、凝胶过滤层析和免疫亲和层析的层析法。
除了制备6-APP外，本发明多肽也可以大量其它方式被使用。例如可以熟知的方法，将此多肽用于制备能与多肽结合的多克隆或单克隆抗体。使用如放射免疫测定或酶免疫测定的免疫测定技术，轮流使用这些抗体可检测出如细胞样品的样品中存在的本发明的多肽。此抗体也可用于亲和层析以纯化本发明多肽并将它们从各种来源中分离出来。
通过确定的DNA和推断出的氨基酸序列已经限定了本发明多肽。由于大多数氨基酸残基和终止信号都有一个以上的密码子而导致了遗传密码的简并性，因而也可使用编码与图6图和图7所述相同的氨基酸序列的其它DNA序列以产生本发明多肽。另外，应理解这些DNA和氨基酸序列天然存在等位变异，或者也可使用本领域熟知方法有目的地引入此变异。通过在整个序列中一个或多个氨基酸的差异，或者通过在所说序列中缺失、取代、插入、倒位或增加一个或多个氨基酸可阐明这些变异。例如可根据所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性来进行这种氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电的极性头基团或非极性头基团且亲水性数值相似的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。其它所期望的变异包括上述多肽的盐类和酯类以及上述多肽的前体，例如具有如甲硫氨酸，N-甲酰甲硫氨酸的N-未端取代基以及前导序列的前体，所有这种变异都包括在本发明的范围之内。
下述实施例将进一步阐明本发明，这些实施例并不想限制本发明的范围，只想提供对本发明的进一步理解。
优选实施方案的详细例子在实施例中，微生物菌株、质粒、缓冲液、生长培养基和一般方法都如下所述。
微生物菌株和质粒所用质粒、细菌和真菌菌株列于表1
表1<
(1)Staben et al.，1989，Fungal Genet.Lett.3679-81.(2)Yanisch-Perron et al.，1985，Gene 33103-119.(3)Jain et al.，1992，Mol.Gen.Genet.234489-493.*下文将描述Fig图缓冲液和培养基Luria肉汤培养基1％ Difoc Bacto胰化蛋白胨，0.5％ DficoBacto酵母浸出汁，0.5％氯化钠。
Luria琼脂培养基在Luria肉汤中增加1.5％ Difco Bacto琼脂。
SOC培养基2％ Difoc Bacto胰化蛋白胨，0.5％ Difco Bacto酵母浸出汁，10mM氯化钠，2.5mM KCl，高压灭菌后，在培养基中加入百分之一体积的1mM MgCl2、1M MgSO4和20％的葡萄糖。
镰孢属营养生长培养基6％淀粉，4％药物介质(TraderProtein，Memphis，TN)，0.3％(NH4)2SO4，0.75％ KH2PO4，0.75％ K2HPO4，用10N NaOH将PH调至6.8。
产生PVA的培养基在镰孢属营养生长培养基中增加0.4％苯氧乙酸盐。
Tris-DETA缓冲液(TE)10mM Tris-Hcl(PH7.4).1mM EDTA。
Tris-乙酸电泳缓冲液(TAE)40mM Tris-乙酸(pH8.0)，1mMEDTA.
20×SSC3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，用10N NaOH调pH至7.0。
20×SSPE3M NaCl，0.2M NaH2PO4，20mM EDTA，用10NNaOH调节PH至7.4。
50×Deharclt溶液1％ Ficoll，1％聚乙烯吡咯烷酮，1％牛血清白蛋白(BSA)。
30×NET4.5m NaCl，0.45M Tris-HCl(pH7.5)，30mM EDTA.
方法如Sambrook等人(1989，“Molecular CloningA LaboratoryManual”，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，CSH，New York.)所述，使用一般的克隆技术进行DNA测序和从大肠杆菌中抽提质粒DNA。所有限制性酶和DNA修饰酶都得自供货商，可根据制造者的教导使用它们。其它的常用方法可按下述进行。
1.大肠杆菌的电-转化(电穿孔法)将4ml大肠杆菌DH 5α细胞的新鲜过夜培养物接种于400mlLuria肉汤碚养基中，在37℃振荡培养直至OD600为0.6。在冰上冷却15分钟，并在冷转头中以7,000×g的转速离心10分钟以收获细胞。用200ml 0℃的水将细胞沉淀洗涤两次并用10ml 0℃的10％甘油洗涤一次。在0℃的10％甘油中重新悬浮细胞沉淀至终体积为1ml(1至3×1010个细胞/ml)，每个1.5ml聚丙烯试管中装入40ml等分试样，在干冰上冷冻细胞悬浮液并贮存于-70℃之下。
在室温下使冷冻细胞解冻，然后立即置于冰上，在细胞中加入约2-3μl溶于TE或连接混合物中的DNA，缓慢混合并再置冰上放1分，钟然后将混合物转移后预冷的0.2cm电穿孔样品池中(Bio-Radcatalog #165-2086，Bio-Rad Laboratories，Inc.)。将Bio-Rad基因脉冲仪装置(Bio-Rad catalog #165-2075)的电容设置为25μF，电压设置为2.50KV。将脉冲控制器(Bio-Rad catalog #165-2098)的电阻设置为200vhm。在这些设置下使样品池被脉冲一次。电穿孔后，在样品池中加入1ml SOC培养基，用Pasteur液管将细胞悬浮液转移到17×100mm聚丙烯试管中，在37℃下温育1小时，将细胞涂平板于选择性培养基上(含有浓度分别为40μg/或100μg/ml的新霉素或氨苄西林的Luria琼脂培养基)。
2.镰孢属的原生质体转化在24℃下，于20ml土豆葡萄糖肉汤培养基(PDB；DifcoLaboratories)中培养尖孢镰孢菌株。通过一层30μm目的尼龙滤网(Spectra/Mesh Nylon N，Speetrum Medical Lndustries，Inc.)过滤小分生孢子。室温下以1,500×g离心8分钟可沉淀小分生孢子，用无菌重蒸水将小分生孢子洗涤两次，在24℃下振荡15小时可使100ml PDB中萌发大约1×1010个小分生孢子。在室温下以1,500×g离心8分钟以将萌发的小分生孢子收集于无菌50ml圆锥形试管中。用0缓冲液(1.4M MgSO4，50mM柠檬酸钠，pH5.8)将沉淀物洗涤两次。在24℃下用20ml含有2％ Novozyme 234(Bios Pacitic，Inc.)的0缓冲液将萌发的小分生孢子处理1至2小时。当所形成的原生质体超过90％时，在40℃900×g下，于两只15ml圆锥形试管中将此混合物离心30分钟，从悬浮液顶端缓慢吸取原生质体，于4℃下用T缓冲液洗涤两次(1.2M山梨醇，50mM CaCl2、10mM Tr13-HCl，pH7.4)，在含有6％聚乙二醇4000和1％二甲基亚砜的T缓冲液中以每毫升1×109的浓度悬浮此原生质体，再以1.5毫升聚丙烯试管的小量等分试样于冰上冷冻此原生质体，并在-70℃下贮存。
通过在室温下将冷冻的悬浮液解冻，并加入核酸酶抑制剂金精三羧酸盐至终浓度为2mM可转化此原生质体。在200μl原生质体悬浮液中加入溶于10μl TE中的10至20μg质粒DNA，并在冰上孵育30分钟，将60％的聚乙二醇4000/50mM CaCl2溶液以两次200μl、一次800μl的体积加入，每次加入之间应缓慢混合，再置冰上孵3分钟，然后加入10ml 1.2M的山梨醇/0.5x PDB并缓慢混合，在4℃，900×g下离心8分钟以沉淀原生质体，将沉淀悬浮于0.5ml的1.2M山梨醇/0.5xPDB中，在新鲜倾倒的1.2M山梨醇/0.1xPDB/1.5％琼脂双层平板上涂布0.1ml原生质体悬浮液，下层培养基为12.5ml，它含有浓度为75μg/ml的腐草霉素，可缓慢地扩散至12.5ml的上层培养基中。在24℃下将平板温育7天，通过在含有浓度为20μg/ml的腐草霉素1xPDA培养基上的生长以及与质粒DNA探针的DNA斑点一印迹杂交可检测转化子。
3.从镰孢菌株中抽提染色体DNA
按“镰孢属原生质体转化”部分所述制备镰孢属原生质体，从悬浮液上层收集原生体，在4℃下用T缓冲液洗涤两次，然后将原生质体再悬浮于4μl裂解缓冲液中
，缓慢混合并在37℃下温育5分钟，在原生质体裂解液中加入溶于0.7M NaCl中的十分之一体积的10％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，缓慢混合并在65℃下温育15分钟，通过加入等体积的氯仿∶异戊醇混合物(24∶1)可抽提出染色体DNA，收集水溶液，加入十分之六体积的异丙醇以沉淀染色体DNA，在室温下，以1,500×9离心5分钟以收集DNA，用70％醇将DNA洗涤一次，真空干燥，将DNA再悬浮于每毫升含200μg核糖核酸酶A(EC 3.1.27.5，得自Singma Chemical Co.)的1ml TE中，在37℃下温育20分钟，加入蛋白酶K溶液制品(EC 3.4.21.14，得自Boehringer Mannheim，GmbH)至终浓度为400μg/ml，在37℃下将DNA溶液温育20分钟，加入十分之一体积的3M NaCl，用等体积的苯∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合物将DNA溶液抽提两次，收集水溶液，加入两倍体积的乙醇以沉定染色体DNA，再在室温下，以1,500×g离心5分钟以收集DNA，用70％乙醇将DNA洗涤一次，真空干燥并再悬浮于1ml TE中。
使用切口平移系统(Nick translation System)(Life Technologies，Inc)由质粒DNA或经琼脂糖纯化的DNA片段制备DNA探针，并用α-32P-dCTP(Amersham Corp.)标记。使用T4多聚核苷酸激酶，用Y-32P-ATP〔Amersham Corp.〕使寡核苷酸探针磷酸化，每次使用经标记的探针之前，应在100℃下处理5分钟以使DNA探针热变性，并在冰上迅速冷却2分钟。
5.DNA斑点-印迹杂交将DNA样品置于含有0.4M NaOH和10mM EDTA的溶液中，至总体积为0.4ml，在100℃下处理10分钟以使DNA样品热变性，在真空下，于斑点-印迹装置中(Minifold，Schleicher & Schnell，Inc.)将变性后的DNA样品加样到Bio-Rad Zeta-probe GT膜(Bio-EadLaboratories，Inc.)或硝酸纤维素膜上(Minffold，Schleicher & Schnell，Inc.)，在杂交烘箱(Laboratory Products Sales，Inc.)中进行杂交，将Zeta-probe GT膜置于瓶中，在65℃下用5ml杂交缓冲液(0.5MNa2HP4，pH7.2.7％SDS)在旋转下预杂交2小时，然后用5ml新鲜制备的杂交缓冲液取代此溶液，加入经标记的DNA探针，在65℃下用含有40mM Na2HPO4(pH7.2)和5％ SDS的缓冲液将此膜洗涤两次，每次30分钟，随后在45℃下含有40mM NaHPO4(pH7.2)和1％ SDS的缓冲液将此膜洗涤两次。当所使用的是硝酸纤维素膜时，杂交在类似条件下进行，除了杂交缓冲液的组合物为6×SSC，5×Denhardt溶液，10mM磷酸钾(pH7.2)，0.1％SDS和每ml含250μg变性的鲑精DNA。在65℃下用2×SSC-0.1％SDS将杂交膜洗涤两次，每次30分钟，然后在65℃下，用0.1×SSC-0.1％SDS再洗涤两次，每次30分钟，如使用的是寡核苷酸探针，杂交和洗涤的温度可维持在50℃，洗涤后，将膜暴露于Kodak XAR-5X-射线胶片(Eastman KodakCo.)中以放射自显影。
6.Southern DNA杂交用n种不同限制性酶中的每一种将镰孢属染色体DNA完全消化，在每ml含0.25μg溴化乙锭的TAE缓冲液中，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳，如Sambrook等人所述通过酸脱嘌呤作用、碱变性和中和以处理凝胶，使用Bio-Rad Model 785 Vaccum Blotter(Bio-Rad catalog #165-5000)将凝胶转移至Bio-Tad Zeta-probe GT膜或硝酸纤维素膜上，如上所述进行DNA杂交和放射自显影。
7.青霉素V酰胺水解酶测定用5ml无菌重蒸水洗涤1周龄马铃著右旋糖琼脂(PDA，DifcoLabratories)平板的表面可分离到尖孢镰孢菌株的小分生孢子。将0.5ml小分生孢子溶液接种于125ml摇瓶中的25ml镰孢属营养生等培养基中，在24℃下，将营养培养物置于旋转振荡器(250rpm)上培养72小时，并将0.2ml营养培养物的等分试样接种于于125ml摇瓶中的25mlPVA生产培养基中，在24℃下，用旋转振荡器培养144小时。
首先将生产培养物稀释于5mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中，向1ml于25mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中制得的3％青霉素V溶液中加入1ml适当稀释的培养物，在35℃下将反应混合物振荡15分，钟加入1ml6％(w/v)三氯醋酸(TCA)溶液以终止反应，在1,500×g下将混合物离心8分钟，向3ml对-二甲氨基苯甲醛(P-DAB)工作溶液中加入1ml澄清的上清液，此工作溶液是通过将1份于100％甲醇中的1％P-DAB与6份冰醋酸∶H2O∶1N NaOH混合物(40∶19∶1的比率)相混合而制得的。在室温下将此混合物温育5分钟，测量波长为415nm时的光密度，含有1ml 100μg/ml 6-APA和3ml P-DAB工作溶液的对照试管在415nm处所读光密度为0.27，用415nm处读出的光密度乘以稀释系数再乘以0.34便可算出酶活性(IU/ml)。青霉素V酰胺水解酶活性以国际单位(IU)表示，1个单位相当于在上述测定条件下每分钟转化1μmole青霉素V。
实施例1青霉素V酰胺酶的氨基酸序列已分离、纯化和鉴定出PVA酶的分泌形式，它是分子量为65千道尔顿的糖蛋白，用溴化氰消化经纯化的酶，在Sephadex G-100柱上，对经溴化氰消化的PVA进行凝胶过滤层析，可纯化得到6个主要片段A、B1、B2、C、D和E。通过自动的Edman降解法(Hunkapiller and Hood，1983，Science 219650-659)测定6个肽片段以及完整PVA分子的N-未端氨基酸序列，所得肽序列信息示于图1。
实施例2青霉素V酰胺酶的cDNA克隆1.提取尖孢镰孢菌株435的mRVA在PVA生产培养基中培养尖孢镰孢菌株435细胞，用重新悬浮的鸟嘌呤异硫氰酸盐缓冲液洗涤细胞，并经用超声处理以使细胞破裂。通过CsCl垫层离心(Glisin et al.，1974，Biochem，132633-2637)分离总RNA，通过寡(dT)层析(Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning-A Laboratory Mannal，2nd edition)以及随后的蔗糖梯度分级分离可制备mRNA，通过体外翻译以及免疫沉淀法可测定出每个级分中的mRNA。
2.合成cDNA并制备cDNA文库根据Gubler-Hoffman法(Gubler and Hoffman，1983，Dene 25263-269)由mRNA制备互补的DNA(cDNA)，在50ml含有3μg nRNA，50mM Tris-Hcl(pH7.5)，65mM KCl，3mM Mg mRNA，0.5μg寡(dT)，2.5μg放线菌素D，1mM 4种dNTP中的每一种以及2单位鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶的反应混合物中合成第一条链，在0℃下将反应物孵育3分钟，然后在20℃下孵育5分钟并在37℃下孵育1小时。在反应结束时加入2μl 0.5M EDTA和5μl 3M NaCl，用苯酚/氯仿抽提此混合物并用2倍体积的乙醇沉淀，使用Rnase H、DNA聚合酶和DNA连接酶通过修复合成反应以制备第二条链，将得自第一条链合成中的DNA溶解于100μl修复缓冲液中，此缓冲液含有20mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM MgCl2，10mM硫酸铵，100mM KCl，150mM β-DNA，40μm 4种dNTP中的每一种，5μg BSA，1单位大肠杆菌RNase H，20单位DNA聚合酶I以及1单位大肠杆菌DNA连接酶。将此混合物于12℃下孵育1小时然后于20℃下孵育1小时，反应结束时加入10μl 3M NaCl，并用苯酚/氯仿抽提此混合物，加入2倍体积的乙醇以沉DNA。使用未端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和dCTP使cDNA以C结尾。将1ngC-结尾的cDNA退火并与25ng以G-结尾的质粒puc19相连接，用连接后的DNA转化大肠杆菌并制备cDNA文库。
3.制备寡核苷酸探针由PVA酶羧基端附近之肽C(图1，SEQ.ID.NO.5)的七个氨基酸(SEQ.ID.NO.8)逆翻译可得到一套四个寡核苷酸的探针(图2，SEQ.ID.NO.11)。
4.鉴定PVA cDNA克隆并制备全长cDNA用简并的寡核苷酸探针(图2，SEQ.ID.NO.11)筛选cDNA文库的菌落，通过在50℃下，于杂交缓冲液(6×NET/10x Denhardts/1％SDS)中与32P未端-标记探针的杂交可筛选出菌落印迹。
在室温下用2X NET-0.1％ SDS将杂交膜洗涤两次，每次30分钟，接着在50℃下用0.5×NET-0.1％ SDS再洗涤两次，每次30分钟。筛选出强烈杂交的菌落(#362)以供进一步研究，它含有-500bp的插入片段，此片段可用作探针以重新筛选文库。第二个克隆(#2585)含有-1.7Kb的插入片段，它可与探针强烈杂交。将PVA的N-未端氨基酸序列与插入片段5’未端的翻译相比较，结果表明已克隆出成熟酶中除五个氨基酸以外的完整编码区域(图3)。通过位点特异性诱变可在5’未端生成一个PstI限制性位点以产生#2585-M，加入一合成接头以将#2585-M克隆转变为全长cDNA克隆2585-FL(图3和图4)。
5.2585-FL cDNA克隆的DNA序列分析使用Maxam-Gilbert法(Maxam and Gilbert1977，Proc.Natt.Acad.Sci.USA 74560-564)测定cDNA插入片段2585-FL两条链的序列。此插入片段含有-1521个碱基对(bp)的开放读框，它可编码55,000道尔顿的蛋白质(图6)，在此序列中可发现完整PVA分子N-未端和经溴化氰消化的肽片段的所有氨基酸序列数据，图6中划线部分是相应于20mer寡核苷酸探针(SEQ.ID.NO.11)的区域(碱基对1348至1368，SEQ.ID.NO.20)。
实施例3青霉系V酰胺酶基因组DNA克隆1.基因组PVA基因片段的鉴定用n种限制性酶消化尖孢镰孢菌株435的高分子量染色体DNA，在TAE缓冲液中，使用0.6％琼脂糖凝胶电泳并转移至硝酸纤素膜上。将由2585插入片段DNA制备的探针与Southern印迹杂交以测定含有PVA基因的片段大小，已发现此片段位于～12kb的EcoRI片段上。
2.质粒pWB19N的构建pBM11/M5(ATCC 67436〕衍生于pBM11(ATCC 67366)，其中已通过位点特异性诱变除去了存在于新霉素-抗性基因中的NcoI位点。用HindIII和SmaI消化质粒pBM11/M5 DNA，使用大肠杆菌DNA聚合酶I的klenow片段将HindIII切割后的5’突出未端转变成钝端，使DNA混合物进行0.8％制备性琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中切下含有新霉素-抗生基因的1.3kb片段，并在室温下，以100V的电压进行电洗脱1小时，收集所得洗脱液，用等体积的经TE饱和过的苯酚抽提三次，在0.3M NaCl存在下通过乙醇沉淀从水相中回收DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分的所得DNA片段。
用BspHI裂解pllC19质DNA(Yanisch-Perronet al.，1985.Gene.33103-119)，用Klenow片段使5’突出未端转变成钝端，分离含有多接头位点和复制起点的1.6Kb片段(碱基对No.2639至No.2686和No.1至No.1526)，在连接缓冲液(50mM Tris-HCl，H7.6，10mM MgCl2，1mM ATP，1mMDTT，5％聚乙二醇-8000)和T4 DNA连接酶存在下将此片段与1.3kb新霉素-抗生基因片段相连接。
所得质粒被称为pWB19N，通过电穿孔将之导入大肠杆菌DH 5α细胞，筛选出存在pWB19N质粒的新霉素抗性菌落，此质粒在用Klenow补平的HindIII和BspHI位点连接点处有一个恢复的BspHI位点，还需在X-gal平板上筛选菌落的氨苄西林敏感性以及β-半乳糖苷酶活性的α-互补作用，pWB19N的构建示于图8。
3.基因组PVA基因片段的克隆用EcoRI裂解100μg自尖孢镰孢菌株435的高分子量染色体DNA，在TAE缓冲液中，使用0.6％琼脂糖凝胶电流水泳此DNA，从凝胶上切下大小范围为11.5kb至12kb DNA，在室温下，以100V的电压，使之进行电洗脱1小时，收集所得洗脱液，用等体积的TE饱和的苯酚抽提3次，在0.3M NaCl存在下通过乙醇沉淀从水相中回收DNA，然后将～12kb DNA片段克隆进pWB19N载体以形成pF021(图5)，对pF021 DNA的限制性分析表明此克隆片段含有完整的PVA基因，另外还带有PVA编码序列上游的3.7kb和下游的6.8kb。
4.DNA序列分析通过Maxam-gilbert法(图7)测定基因组克隆编码区域的序列，除了5’未端所用密码子以外，cDNA和基因组序列完全相同，在cDNA克隆的5’未端插入了合成接头，在基因组克隆的5’未端得到一额外的315bp序列信息，这些数据表明PVA mRNA的翻译开始于图7的碱基241处，并合成了含有25个氨基酸信号序列的”前-PVA”，然后经裂解形成了PVA酶的分泌形式。
通过S1作图(Berk and Sharp，1977 Cell 12721-732；Sambrook etal.，1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2nd edition)可测出转录起始点，它位于碱基162处或其附近，在此位点和位于碱基241处的ATG之间未发现其它潜在的ATG释译起始信号。
实施例4在异源宿主中表达PVA基因1.质粒pSJC62的构建质粒pES200(Staben et al.，1989，Fungal Genet.Lett.3679-81)具有来自构巢曲霉的trp C启动子序列以引导细菌潮霉素B抗性基因的转录。用EcoRI和ClaI酶裂解pES200 DNA；用Klenow片段使5’突出未端转变成钝端。通过琼脂糖凝胶电泳分离1250bp的trp C启动子片段，并通过电洗脱回收此片段。质粒pUT 715(Jain etal.，1992，Mol.Ge.Genet.235489-493)是一启动子探针载体，它携有来自印度斯坦链异壁菌(Strproalloteichus hindus-tanus)的无启动子的腐草霉素抗性基因。用EcoRV消化pUT 715 DNA，并与1250bp trp C启动子片段连接，将连接混合物转化至大肠杆菌DH 5α中，所得质粒命名为pUT 715/trp C。
用Bam H和BgIII酶消化pUT 715/trp C DNA，经琼脂糖凝胶电泳后分离含有trp C启动子和腐草霉素-抗性基因的2.4kb片段。用BamHI酶裂解pWB 19N DNA，并与2.4kb片段连接，所得质粒命名为pSJC62(图9)。
2.pFO23的构建质粒pFO21中插入了一来自尖孢镰孢菌株435基因组DNA的～12KB EcoRI片段，用Sall酶裂解pFO21 DNA，并用T4 DNA连接酶重新环化，所得质粒pFO23缺失了pFO21中5.8kb的镰孢属DNA非编码区(图5)。
3.pBMFXDVA6的构建用EcoRI和XbaI酶裂解pSJC62 DNA，分离所得2.4kb含有曲霉属trp C启动子以及腐草霉素抗性基因的片段。用EcoRI和XbaI酶消化pFO23 DNA，在琼脂糖凝胶上分离DNA混合物，分离含有PVA基因的7.9kb片段，并与含有曲霉属trp C启动子和腐草霉素-抗性基因的2.4kb片段连接，所得质粒命名为pBMFXPVA 6(图10)。
4.BMFXPVA 7的构建用NcoI和XbaI酶裂解pBMFXPVA 6 DNA，用klenow片段将粘性未端转变成钝端，在琼脂糖凝胶上分离DNA混合物并分离含有PVA基因的4.3kb片段，用XbaI裂解pBMFXPVA 6 DNA并用klenow片段处理，将线性化的pBMFXPVA 6 DNA与4.3kb的PVA基因片段相连接可形成pBMFXPVA 7(图11)。
5.在异源宿主中表达PVA基因在pFO23(图5)中加入受构巢曲霉trp C启动子(图10)调节的腐草霉素抗性基因可衍生得到重组质粒pBMFXPVA 6，在pBMFXPVA6中加入第二拷贝的PVA的基因(图11)可衍生得到重组质粒pBMFXPVA 7。通过聚乙二醇介导的原生质体转化(Powell andRistler，1990，J.Bacteriol 1723163-3171)将这些重组质粒引入PVA基因的异源宿主(即尖孢镰孢的不同亚种)ATCC 16233菌株中(蕃茄尖孢镰孢)。对腐草霉素抗性转化分子的DNA分析证实了转化DNA已整合到宿主染色体上，此时使用聚乙二醇介导的原生质体转化法不能转化尖孢镰孢菌株435。
然后在摇瓶中发酵转化子并测定PVA活性，尖孢镰孢菌株435产生的活性为20IU/ml，未经转化的ATCC 16233菌株产生的活性为1.0IU/ml，携有pBMFXPVA 6质粒(一个PVA基因)的转化子产生的活性为10IU/ml，携有pBMFXPVA 7质粒(两个PVA基因)的转化子产生的活性为130IU/ml(表2)，总之，在异源宿主中表达的PVA活性与原始的尖孢镰孢株435相比增加了5倍。
表2 青霉素V酰胺水解酶活性
另外，在苯氧乙酸的存在下(表3)，重组PVA的表达可被诱导至与尖孢镰孢菌株435相同的水平。
表3 苯氧乙酸诱导青霉素V酰胺水解酶基因表达
实施例5真菌表达载体的构建加入苯氧乙酸可诱导PVA基因的表达，这表明可从PVA转录和翻译调节区即启动子区域开发表达载体以用来在尖孢镰孢中表达外源基因，下述的构建用于产生质粒pBMFXPVA-P以表达细胞内蛋白质，产生质粒pBMFXPVA-M以表达可分泌的蛋白质。
1.pFO20的构建用BamHI和XhoI酶裂解pFO23 DNA，在琼脂糖凝胶上分离DNA混合物，分离PVA基因5’未端上游含有转录和翻译调节序列的2.1kb片段，用XhoI和HindIII酶裂解pFO23，凝胶纯化含有PVA基因后一部分的1.5kb DNA片段，使两个片段在pUC19的HindIII和BamHI位点处连接，所得质粒命名为pFO20，PFO20的构建示于图12。
2.pFO20-P的构建使用来自Marinaga等人(1984，Bio/Technol，2636-639)的位点特异性诱变法可在PVA基因的翻译起始位点处产生一个MluI位点(SEQ.ID.NO.21的碱基对no.241)。
STGCGCGTC(SEQ.ID.NO.24)↓位置特异性诱变ATACGCGTC(SEQ.ID.NO.25)MluIMluI位点的产生使得通过MluI和BamHI裂解可除去PVA基因的编码区，取而代之的是可在PVA启动子控制之下表达的基因编码序列。已合成了一个15mer诱变寡核苷酸(GGCATATACGCGTCSEQ.ID.NO.26)。
pFO20-P的构建示于图13。用XmaI消化2-μgpFO20，再用细菌碱性磷酸酶(BAP)处理以防止所得片段I的自身连接，用EcoRI和SphI裂解2μgpFO20以除去突变靶区域(例如PVA基因的上游区域)，凝胶纯化所得5kb片段(片段II)。将等克分子量的片段I和II与200倍克分子过量的15mer诱变寡核苷酸相混合，在100℃下使混合物温育3分钟以使混合物中的DNA片段完全变性，变性后，以分步的方式逐渐冷却此混合物以使变性的DNA片段重新退火，在重新退火的过程中除去了原有的片段I和II外，还形成了两种新DNA，即DNA-a和DNA-b。如图13所示，15mer诱变寡核苷酸仅与两种环状DNA中的一种杂交形成异源双链，这是因为寡核苷酸仅与靶区域两条链中的一条互补。将DNA与klenow片段、T4 DNA连接酶和四种dNTP一起温育，此处理可使开环DNA转变为闭合状DNA。反应过后，用此混合物转化大肠杆菌DH 5α，通过MluI裂解分析筛选出转化子的质粒DNA，鉴定质粒pFO20-P中MluI位点的产生。
3.pBMPVA-P具有两个妨碍此表达载体之应用的BamHI位点，因此需从puc19载体区域除去BamHI位点。周限量的BamHI酶处理pF020-P以形成部分裂解状态，再用EcoRI裂解，用Klenow片段补平5’突出未端，凝胶纯化6.3kb的片段，用T4 DNA连接酶连接并转化到DH5α中，所得质粒pBMPVA-P(图14)可用作表达载体以在PVA启动子控制之下将所需基因的编剧码序列插入MiuI/BamHI位点。
4.pFO20-M的构建在PVA分泌信号序列和成熟PVA蛋白质(氨基酸No.24-25，SEQ.ID.NO.22)的连接处产生一个SmaI位点。
AACAAA/GGCAAC(SEQ.ID.NO.27)N KG N (SEQ.ID.NO.28)
↓位置特异性诱变AACCCC/GGGAAC(SEQ.ID.NO.29)SmaI位点SmaI位点的产生可允许在PVA分泌信号序列之后插入编码序列，因而使得表达后的蛋白质可以分泌，已合成了28mer诱变寡核苷酸(GCAGCTCCCAACCCCGGGAACGATGATT，SEQ.ID.NO.30)。
pFO20-M的构建示于图15，其过程类似于pFO20-P的构建。用XmaI裂解质粒pFO20，接着用BAP处理以产生片段I，再用SphI和HindIII消化pFO20以除去靶区域，并产生了6kb的片段II，异源双链形成以及DNA延伸的条件类似于pFO20-p的构建，筛选转化子质粒DNA中额外产生的SmaI位点。
5.pBMPVA-M的构建质粒pFO20-M具有妨碍此载体使用的两个BamHI和两个SmaI位点，来自PUC 19区的多余BamHI和SmaI位点需被除去。用BamHI部分裂解pFO20-M，然后用EcoRI裂解，用Klenow片段补平粘性未端，凝胶纯化6.3kb的片段，连接并转化大肠杆菌DH 5α，所得质粒pBMPVA-M(图16)可用作分泌表达载体以在PVA启动子的控制之下将所需基因的编码序列插入SmaI/BamHI位点。
实施例6通过PVA表达载体表达D-氨基酸氧化酶基因从变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)中克隆的D-氨基酸氧化基因可用作通过镰孢属PVA表达载体表达外源基因的例子。
1.通过pBMPVA-p表达D-氨基酸氧化酶基因Bristol-Myers Squibb科学克隆出变异三角酵母的D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因，DNA序列分析表明在编码序列的5’未端附近存在有38bp的内含子。使用寡核苷酸定向的位点特异性诱变法可除去内含子并在DAAO基因的翻译起始位点处产生一个NcoI位点，因此DAAO编码序列再加上700bp的3’-非转录区域可被纯化为2.1kb的NcoI/BamHI片段。
用MluI裂解处理质粒pBMPVA-P DNA，用klenow片段补平粘性未端，然后用BamHI裂解此DNA，凝胶纯化含有PVA启动子区域的4.7kb片段，将DAAO基因片段与DAAO基因2.1kb的NcoI/Klenow/BamHI片段相连接可产生质粒pBMPVA-P/DAA01。通过用NdeI裂解、Klenow补平质粒pBMPVA-P/DAA01并经过凝胶纯化可制备3.4kb的PVA启动子/DAAO基因融合片段。将此片段插入pSJC62 DNA以及经klenow补平的XbaI位点，所得质粒命名为pBMPVA-P/DAAO2。完整的构建图示于图17。
使用聚乙二醇介导的原生质体转化法可将pBMPVA-p/DAA02DNA引入ATCC 16322菌株，通过对腐草霉素的抗性筛选转化子，在PVA生产培养基中培养n个转化子并测定D-氨基酸氧化酶活性，结果表明D-氨基酸氧化酶基因在ATCC/16322转化子中的表达水平为0.2-0.8IU/ml。
2.通过pBMPVA-M表达D-氨基酸氧化酶基因用SmaI和BamHI酶裂解质粒pBMPVA-MDNA，凝胶纯化含有PVA启动子区域以及PVA分泌信号序列的4.8kb片段。通过NcoI裂解加上绿豆核酸酶处理以除去5’粘性末端并维持DAAO基因适当的阅读框，然后用BamHI消化以产生2.1kb的片段即可制备得到DAAO基因片段。将4.8kb的PVA启动子/信号序列片段与2.1kb的DAAO基因片相连接即可产生质粒pBMPVA-M/DDAO3，用NdeI裂解pBMPVA-M/DDAO3 DNA，用klenow片段补平5’粘性未端，纯化3.5kb的PVA启动子-信号序列、DAAO基因融合片段，并在经klenow补平的XbaI位点处插入pSJC62 DNA中，所得质粒命名为pBMPVA-M/DDAO4(图18)。
将pBMPVA-M/DDAO4 DNA转化进ATCC 16322菌株，测定n个腐草霉素抗性转化子的D-氨基酸氧化酶活性，不幸的是这些转化子都未显示出D-氨基酸氧化酶活性。通过pBMPVA-M载体表达D-氨基酸氧化酶基因的失败可能是由于D-氨基酸氧化酶的细胞内特性。人们普遍认为编码细胞内蛋白质的基因不能通过分泌表达系统表达并转移到细胞外(Model and RuSsel，1990，Cell 61739-741)。即使此基因能在细胞内表达，PVA信号序列的结合也会使D-氨基酸氧化酶活性丧失，因此，pBMPVA-M载体仍然可用于表达其它分泌蛋白质基因。
权利要求
1.分离的核酸分子，其序列编码SEQ.ID.NO.19或22的氨基酸序列。
2.分离的核酸分子，其序列与编码SEQ.ID.NO.19或22之氨基酸序列的核酸序列互补。
3.分离的核酸分子，其序列能与具有同编码SEQ.ID.NO.19或22氨基酸序列的核酸序列互补之序列的核酸杂交。
4.如权利要求1的核酸分子，其为DNA分子。
5.如权利要求2的核酸分子，其为DNA分子。
6.如权利要求3的核酸分子，其为DNA分子。
7.分离的DNA分子，其序列编码SEQ.ID.NO.19的氨基酸序列。
8.分离的DNA分子，其序列能与具有同编码SEQ.ID.NO.19氨基酸序列的核酸序列互补之序列的核酸杂交。
9.分离的DNA分子，其序列编码SEQ.ID.NO.22的氨基酸序列。
10.分离的DNA分子，其序列能与具有同编码SEQ.ID.NO.22氨基酸序列的核酸序列互补之序列的核酸杂交。
11.分离的DNA分子，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.18。
12.分离的DNA分子，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.21。
13.分离的DNA分子，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.11。
14.分离的DNA分子，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.23。
15.分离的DNA分子，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.14、15、16或17。
16.分离的DNA分子，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.9或10。
17.分离的DNA分子，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.26或30。
18.分离的多肽，其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1、2、3、4、5、6、8或12。
19.如权利要求18的多肽，其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1或12。
20.表达载体，它含有编码SEQ.ID.NO.19或22的部分氨基酸序列的核酸序列。
21.如权利要求20的表达载体，它含有编码SEQ.ID.NO.19氨基酸序列的DNA序列。
22.如权利要求20的表达载体，它含有编码SEQ.ID.NO.22氨基酸序列的DNA序列。
23.如权利要求20的表达载体，进一步包括复制起点、启动子和转录终止序列。
24.如权利要求23的表达载体，进一步包括选择性标记序列。
25.如权利要求24的表达载体，其中选择性标记是腐草霉素抗性。
26.如权利要求23的表达载体，它可整合到真菌染色体上。
27.如权利要求20的表达载休，其DNA序列为SEQ.ID.NO.18或21。
28.如权利要求20的表达载体为质粒。
29.表达载体，它含有的启动子具有如SEQ.ID.NO.23的DNA序列。
30.如权利要求29的表达载体，进一步包括复制起点、编码结构蛋白质的DNA以及转录终止序列。
31.如权利要求30的表达载体，其中编码结构蛋白质的DNA编码PVA。
32.如权利要求30的表达载体，进一步包括选择性标记序列。
33.如权利要求32的表达载体，其中选择性标记是腐草霉素抗性。
34.如权利要求30的表达载体，它可以整合到真菌染色体上。
35.名称为pBMFXPVA6的表达载体。
36.名称为pBMFXPVA7的表达载体。
37.名称为pBMFXPVA-P的表达载体。
38.名称为pBMFXPVA-M的表达载体。
39.含有如权利要求20的表达载体的宿主细胞。
40.含有如权利要求23的表达载体的宿主细胞。
41.含有如权利要求25的表达载体的宿主细胞。
42.含有如权利要求26的表达载体的宿主细胞。
43.含有如权利要求27的表达载体的宿主细胞。
44.含有如权利要求28的表达载体的宿主细胞。
45.含有如权利要求29的表达载体的宿主细胞。
46.含有如权利要求30的表达载体的宿主细胞。
47.含有如权利要求31的表达载体的宿主细胞。
48.含有如权利要求32的表达载体的宿主细胞。
49.含有如权利要求33的表达载体的宿主细胞。
50.含有如权利要求34的表达载体的宿主细胞。
51.含有如权利要求35的表达载体的宿主细胞。
52.含有如权利要求36的表达载体的宿主细胞。
53.含有如权利要求37的表达载体的宿主细胞。
54.含有如权利要求38的表达载体的宿主细胞。
55.如权利要求39的宿主细胞，它是真核生物。
56.如权利要求45的宿主细胞，它是真核生物。
57.如权利要求39的宿主细胞，它是镰孢属的种。
58.如权利要求45的宿主细胞，它是镰孢属的种。
59.如权利要求39的宿主细胞，它是尖孢镰孢。
60.如权利要求45的宿主细胞，它是尖孢镰孢。
61.如权利要求51的宿主细胞，它是尖孢镰孢。
62.如权利要求52的宿主细胞，它是尖孢镰孢。
63.如权利要求53的宿主细胞，它是尖孢镰孢。
64.如权利要求54的宿主细胞，它是尖孢镰孢。
65.大肠杆菌ATCC 69720的生物学纯培养物。
66.大肠杆菌ATCC 69721的生物学纯培养物。
67.大肠杆菌ATCC 69772的生物学纯培养物。
68.生产含有SEQ.ID.NO.19或22氨基酸序列的多肽之方法，它包括在导致多肽表达的条件下培养如权利要求39的宿主细胞。
69.如权利要求68的方法，其中表达是通过在苯氧乙酸盐存在下培养而诱导的。
70.生产多肽的方法，它包括在导致多肽表达的条件下培养如权利要求45的宿主细胞。
71.如权利要求70的方法，其中表达是通过在苯氧乙酸盐存在下培养而诱导的。
全文摘要
编码尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)青霉素V酰胺水解酶(PVA)的核酸、表达载体、宿主细胞以及生产PVA的方法。
文档编号C12N9/84GK1132251SQ9512145
公开日1996年10月2日 申请日期1995年12月22日 优先权日1994年12月23日
发明者S·J·蒋, 小·W·V·本内特, S·M·通齐 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司