专利名称：人细胞色素p450系列转基因细胞株的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物学、细胞学范畴。
适用于药品、化妆品、食品添加剂、农药、化工产品、毒素等环境致癌物的代谢和遗传毒理学检测及研究。
目前国内外主要应用遗传毒理短期试验技术检测化学物质的致突变性、致癌性，由于大多数化学致突变物/致癌物需经体内细胞色素P450(简称CYP)代谢活化才能产生遗传毒理作用，而传统所用的建株细胞绝大多数不能表达CYP，因此必需在细胞外添加啮齿动物或其它来源的肝微粒体酶系或辅助细胞以达到理想的活化。这种设计与体内前致癌物在细胞内进行活化的过程正好相反，由于终致癌物在进入细胞时遭遇胞浆膜屏障且终致癌物半寿期一般都很短，此外，由于所用的啮齿动物的CYP与人类CYP有着较大的不同，因而影响了研究结果的可信度。
当前国外主要采用DNA重组技术，建立cDNA文库，在获得人CYP基因的表达克隆后，导入建株细胞中表达，应用于药理学、遗传毒理学的检测和研究，但存在着实验周期长，工作量大，细胞表达状态不稳定、所用的靶细胞不适合于我国的药理学、毒理学检测规定等缺点，且国外已商品化的产品价格也较高，难于在国内推广应用。
本发明建立的一系列稳定表达人CYP的转基因细胞株，应用于遗传毒理短期试验，可使有关致癌物的代谢活化和毒理终点测定在同一细胞内进行，进一步提高了实验的灵敏度和可信度；而且使选用较低剂量、较长时间暴露、检测化学致癌物的遗传毒性成为可能；建立一系列人CYP转基因细胞系，可为不同CYP同功酶的代谢功能研究提供非常有用的工具。
本发明采用下述技术方案(1)人CYP cDNA的克隆和鉴定以手术切除的人肝细胞标本及人羊膜FL细胞为起始材料，抽提总RNA，经设计的特定引物RT-PCR获得cDNA后，SouthernBlot杂交，初步对该cDNA片段进行分析和鉴定，将该cDNA片段克隆至质粒pGEM-3Z中进行序列分析和酶切图谱分析，以证实获得的基因无误。
(2)真核细胞表达重组体的构建和鉴定将克隆入重组质粒中的CYP cDNA片段用限制性内切酶切下，在电泳胶上分离回收，亚克隆入真核细胞表达载体pREP-9中，必要时酶切鉴定重组表达体上克隆片段的取向。
(3)真核细胞表达重组体导入培养细胞中表达和建株利用电穿孔转移技术将重组真核细胞表达载体导入合适的培养细胞中，用G418筛选出抗性细胞后，采用Northern Blot和CYP同功酶的活性测定技术鉴定，以获得长期稳定表达的细胞株。
(4)将该细胞系与遗传毒理学短期试验技术结合，建立新的检测前致突变物/致癌物的方法，用于遗传毒理学研究。
克隆表达的人CYP基因选择存在于肝脏且在药物和前致突变物/致癌物代谢中发挥重要作用的三大家族中的个体基因CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2E1和CYP3A4。基因表达的哺乳类靶细胞选用国家有关法规规定的细胞如中国仓鼠CHL、V79细胞，人羊膜FL细胞以及适合于该基因系列表达的其他一切细胞。
与现有技术相比，本发明进一步提高了研究结果的可信度和灵敏度，为人CYP个体同功酶的代谢功能研究提供非常有用的工具，促进和提高我国环境致癌物的监测及研究水平。本系列人CYP转基因细胞株，可应用于环境保护，监测、医药、化妆品、食品添加剂，日用化工产品和农药等方面的生产监测和管理，因而具有一定的经济效益。
在技术上，本发明首先采用RT-PCR技术克隆人CYP基因，克服了构建cDNA文库过程中的困难，大大减轻了工作量，节约了成本，缩短了实验周期，且应用国家有关法规规定的几株细胞作为转基因的靶细胞。实验结果表明导入的基因能稳定表达半年以上。
本发明结合实施例作进一步说明实施例1人CYP cDNA的克隆和鉴定根据已发表的CYP cDNA序列，选择其5′端和编码区序列的3′端分别为两侧引物的起始端，两个PCR引物的5′末端分别含有限制性内切酶识别位点。
人肝组织取自手术切除的癌旁组织，总RNA按AGPC方法提取，经紫外分光光度计测定和甲醛变性胶电泳确定所获得的RNA纯度，浓度和完整性。
RT-PCR扩增CYP cDNAlug总RNA经65℃变性5min，置冰上依次加入4ul 5×逆转录酶缓冲液，2ul 10mM dNTP，0.5ulRNA酶抑制物(RNAsin，40u/ul)，lul 100mM随机引物，2ul逆转录酶(AMV，7.5u/ul)，加双蒸水至终体积20ul，室温10min，42℃温青1.5h，然后加入两侧引物各30pmoles，lul Taq酶(2u/ul)，加双蒸水至终体积100ul，循环参数94℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 1min共35个循环后72℃ 7min。PCR扩增完毕后，取10ul反应物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测。
用原设计的相应内切酶分别酶切PCR扩增产物和pGEM-3Z质粒(2.74kb)。1％琼脂糖凝胶电泳分离，在透析袋中电泳回收，按文献描述的方法进行连接，转化受体菌JM 109和阳性克隆的筛选。
克隆片段的限制性内切酶酶切图谱和部分序列分析鉴定，通过计算机上Gen Bank软件分析比较，选择一合适的限制性内切酶，作限制性酶切图谱分析，区别基因的多态性及假基因，应用于此目的序列分析按试剂盒操作说明书进行。
实施例2 真核细胞表达重组体的构建和鉴定自扩增的重组质粒经酶切、电泳胶上分离回收CYP cDNA片段，与经酶切、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理的真核细胞表达载体pREP-9直接连接，转化感受态大肠杆菌Top10，提取质粒，进行长度分析和酶切图谱分析，筛选出阳性克隆。对单酶切位点克隆的片段，尚需进行插入片段方向的鉴定。
实施例3 真核细胞表达重组体导入培养细胞中表达和建株扩增正向真核细胞表达体，利用电穿孔技术将重组表达体导入合适的培养细胞中，电穿孔的方法和程序按Bio-Rad说明书进行，电穿孔后，将细胞重悬于20ml DMEM培养液中，移入2只10cm培养平皿，置37℃ 5％CO2培养48h，然后加入G418至终浓度500mg/ml，每隔3天换液一次，共筛选二周，10天出现细胞克隆生长，将克隆细胞扩大培养，及时冻存。按文献所述的方法，从培养的转基因细胞及其母系细胞中提取总RNA，以32P-CYP cDNA相应片段为探针，作Northern Blot分析，并以β-actin作为内对照，检测转基因细胞的CYP RNA表达水平。转基因细胞的CYP同功酶活性测定，在培养细胞中提取S9或微粒体后，取各自的特异性酶反应底物进行反应，反应结果以荧光分光光度计测定经计算酶的比活性表示。
实施例4 遗传毒理学短期试验上的应用采用双核微核法试验。5×105细胞接种于25cm2细胞培养瓶中过夜(每种受试浓度接种2瓶)，换用5ml加有受试致突变物的无血清MEM培养基，4h后，用PBS洗涤贴壁细胞2次，加入含10％小牛血清及3ug/ml CYB(细胞松驰素)的MEM 5ml，经36.5℃培养16h，胰酶消化收集细胞，悬浮于2ml PBS中，缓慢加入1/5Vol的固定液(1∶3的冰乙酸∶甲醇)，预固定30min，1000rpm×10min离心，沉淀的细胞再用4ml固定液固定2次，每次30min，固定后的细胞用气干法滴片，10％Giemsa染色15min，在高倍显微镜下计算1000个双核细胞的微核细胞频率，微核细胞的判断按Ciaravino的修订标准进行，实验结果用Kastenbaum-Bowman法进行统计分析。
本研究应用我们建立的稳定表达CYP的转基因细胞株对一组前致突变物/致癌物进行双核微核试验，同时以母细胞系为对照。
图1.重组质粒和真核细胞重组表达体的构建2.Northern Blot结果上图Lane 1，3，5为转基因细胞总RNA与32P-CYP cDNA杂交结果Lane 2，4，6为相应母细胞系总RNA与32P-CYP cDNA杂交结果下图洗脱后膜与32P-β-actin杂交的结果图3.转基因细胞(CHL-1A1)及对照细胞EROD酶活性图4.、图5.所示应用我们建立的分别稳定表达CYP2B6与CYP 1A1的转基因细胞株CHL-2B6、CHL-1A1对一组前致突物/致癌物进行双核微核试验，同时以母细胞系CHL为对照，结果表明，五种前致突变物NNK、DEN、NM、AFBl和CP均能诱导CHL-2B6细胞的微核率显著增加，其中NNK，CP和AFBl具有剂量反应关系，在最高受试浓度微核率约增加3～8倍。五种前致突变物，苯并[α]芘、3-甲基胆蒽、苯并蒽、二甲苯蒽和蒽均能诱导CHL-1A1细胞的微核率显著增高，并具有剂量反应关系。上述结果显示，转基因细胞株在化学致癌物的遗传毒理学研究方面具有重要的应用价值。
权利要求
1.一种人细胞色素P450(简称CYP)系列转基因细胞株，包括人CYP cDNA的克隆和鉴定、真核细胞表达重组体的构建和鉴定、真核细胞表达重组体导入培养细胞中表达和建株等，其特征在于(1)人CYP cDNA的克隆和鉴定以手术切除的人肝细胞标本及人羊膜FL细胞为起始材料，抽提总RNA，经设计的特定引物RT-PCR获得cDNA后，SouthernBlot杂交，初步对该cDNA片段进行分析和鉴定，将该cDNA片段克隆至质粒pGEM-3Z中进行序列分析和酶切图谱分析，以证实获得的基因无误。(2)真核细胞表达重组体的构建和鉴定将克隆入重组质粒中的CYP cDNA片段用限制性内切酶切下，在电泳胶上分离回收，亚克隆入真核细胞表达载体pREP-9中，必要时酶切鉴定重组表达体上克隆片段的取向。(3)真核细胞表达重组体导入培养细胞中表达和建株利用电穿孔转移技术将重组真核细胞表达载体导入合适的培养细胞中，用G418筛选出抗性细胞后，采用Northern Blot和CYP同功酶的活性测定技术鉴定，以获得长期稳定表达的细胞株。
2.如权利要求1所述的人细胞色素P450系列转基因细胞株，其特征在于克隆表达的人CYP基因选择CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP 2B6、CYP2E1和CYP3A4等。
3.如权利要求1所述的人细胞色素P450系列转基因细胞株，其特征在于基因表达的哺乳类靶细胞选用，中国仓鼠CHL、V79细胞、人羊膜FL细胞及适合于该基因系列表达的其他一切细胞。
全文摘要
采用DNA重组技术，通过RT-PCR从人肝组织中扩增CYP1A1、1A2、2A6、2B6、2E1和3A4 cDNA，与真核表达载体pREP9重组，导入哺乳类细胞中稳定表达，建立CYP系列转基因细胞系，应用于遗传毒理学研究，使有关致癌物的代谢活化和毒理终点测定在同一细胞内进行，进一步提高了实验的灵敏度，而且为不同CYP同功酶的代谢功能研究提供非常有用的工具。
文档编号C12N5/10GK1152029SQ9512060
公开日1997年6月18日 申请日期1995年12月11日 优先权日1995年12月11日
发明者余应年, 董海涛, 吴健敏, 蔡朱男 申请人:浙江医科大学