专利名称：高密度脂蛋白中胆固醇的定量方法
技术领域：
本发明是关于临床诊断领域中，在脂质代谢方面起着重要作用的高密度脂蛋白中(HDL)含有的胆固醇(以下简称HDL胆固醇)的定量方法。
HDL是预防因子，是造成以冠状动脉硬化症为主的各种动脉硬化症的危险预防因子，与从含有动脉壁的各组织摄取胆固醇除去细胞内蓄积的胆固醇有关，HDL在血中的指标是予知动脉硬化症患者发病的有用指标。以前HDL胆固醇的定量方法，从宏观上可分为2个过程。一个是分离过程，一个是胆固醇的定量过程。分离方法有超速离心法、免疫化学法电泳法、沉淀法等等。超速离心法是用分离用的超速离心器，根据比重不同分离HDL，然后测定HDL中胆固醇的含量。但是超速离心法在定量方面、简便方面、经济方面等等都存在着缺点。免疫化学法中有免疫电泳法、一次免疫扩散法(SRID法)，オクタロニ-法等等。使用这些方法时，可识别酶蛋白，但常常存在不能正确识别脂蛋白的问题。用电泳法时要以醋酸纤维素膜、琼脂糖凝胶等做载体分离，然后根据酶法定量胆固醇。这种方法在简便性、经济性等方面都存在着问题。用沉淀法时，要使聚乙二醇、肝素、磷钨酸、葡聚糖硫酸等多阴离子和二价阳离子结合在酶蛋白B上，酶蛋白B存在于低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)表面上。使产生不溶性沉淀物，用离心分离法除去不溶性沉淀物，测定上清液中HDL胆固醇含量(临床检验法提要、第29版，金井泉著、金原出版、471页、1983年)。这个方法是最简便的，但是，用离心分离器进行离心分离这个过程，在大量检体处理，迅速测定和临床检验领域上常用的自动分析装置上不适用。而且，在以前的分离方法中，用定量吸量管量取分离完的HDL时，很容易产生人为误差。正如以上所提及那样，在这些分离方法中存在着HDL胆固醇测定的烦杂性。但如果不分离HDL，简单地把血清检体直接添加在有胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂中，和测定总胆固醇的含量没有变化，不能专一地测定HDL胆固醇含量。特开昭63-126498中记载添加胆酸类以后，能提高它的专一性，但在这个方法中，不仅仅HDL起反应，LDL、VLDL等也缓慢地起反应，所以要想得到完全的反应终点很难，并且专一性也不一定充分。
本发明者们发现用含有糖化合物和/或蛋白可溶化剂的胆固醇测定试剂，测定用超速离心法分离出的HDL、LDL、VLDL及CM各脂蛋白时，因糖化合物和/或蛋白可溶化剂的组合不同而各脂蛋白的反应性也不同，结果导致HDL胆固醇、LDL胆固醇、VLDL胆固醇、CM胆固醇的反应性不同，从而完成了本发明。
本发明是关于HDL胆固醇的定量方法。这个定量方法的特征在于在糖化合物和/或蛋白可溶化剂存在下，测定样品中的LDL、VLDL和CM中的胆固醇的量，再求出与样品中总胆固醇量的差值。
另外，本发明提供HDL胆固醇的定量方法，这个定量方法的特征在于在糖化合物和/或蛋白可溶化剂存在下，测定样品中的HDL中的胆固醇量。
糖化合物优选使用以通式(I) 表示的化合物〔式中R1、R2和R3可以相同也可以不同，表示氢原子、取代的或者没取代的烷基、取代的或者没取代的烷醇基、磺基、-(葡萄糖基)p-H(式中，P是1或者2)或者(麦芽糖基)q-H(式中，q是1或者2)，m是6-8的整数〕，或以通式(II)表示的化合物，(C6H10O5)nSO3R4(II)(式中，R4是氢原子或者Na，n是5-2000的整数)。
另外，测定样品中LDL、VLDL和CM中胆固醇量时，使用的蛋白可溶化剂是以通式(III)表示的化合物，R5(CH2CH2O)aH(C2H4OOR6)b(III)〔式中，a是1-200的整数，b是0或者1，R5是R14-X-O-(式中，R14是烷基或者链烯基，X是单键或者CO)或者H-(CH2CH2O)c-N(R15)-(式中，C是1-200的整数，R15是烷基或者链烯基)，R6是烷基或者链烯基〕、以通式(IV)表示的化合物， (式中，R7、R8、R9、R10、R11和R12可以相同也可以不同，表示烷醇基)、以通式(V)表示的化合物，R13-Y-SO3Na (V)〔式中，R13是烷基或者是链烯基，Y是 -O-，-CH(R16)-(式中，R16是烷基或者链烯基)、-CH2CH(OH)(CH2)d-(式中，d是1-22的整数)、-CH＝CH(CH2)e-(式中，e是1-22的整数)、-OCOCH(CH2COOR17)-(式中，R17是烷基或者链烯基)或者是这些的混合物〕。在测定样品中HDL中的胆固醇含量时，蛋白可溶化剂优选使用以通式(VI)表示的化合物R18NHCH2CH2OH (VI)(式中，R18是烷基或者链烯基)、以通式(VII)表示的化合物R19CON(CH3)CH2CH2SO3Na(VII)(式中，R19是烷基或者链烯基)、以通式(VIII)表示的化合物R20O(CH2CH2O)fH (VIII)(式中，f是1-100的整数，R20是烷基)。以下，将通式(I)～通式(VIII)表示的化合物分别称为化合物(I)～化合物(VIII)。
通式(I)～通式(VIII)中各基团的定义作为烷基及烷醇基中的烷基部分，可以是直锭的或者支链的碳数1-22的，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、癸基、十五烷基、イコサニル、二十二烷基等等。作为链烯基，可以是碳数2-22的，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、癸烯基、十五烯基、ィフセニル、廿二烯基等等。
作为取代烷基及取代烷醇基的取代基，如羟基、羧基、磺基等等。
作为胆汁酸类，如用通式(IX)表示的化合物 〔式中，R21及R22可以相同或者不同，代表-OR25(式中，R25是氢原子、磺基或者SO3Na)或者羰基，R23代表氢原子或者-OR25(式中，R25和上述同义)，R24代表氢原子、烷基、链烯基或者金属〕。金属，如钠、钾等碱金属，镁、钙等碱土类金属等。烷基和链烯基和上述同义。
作为糖化合物，在化合物(I)或者化合物(II)中也最好是环糊精衍生物，特别优选甲基化环糊精等。如α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-β-环糊精、三甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、2-羟丙基-α-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、部分甲基-β-环糊精、α-环精糊硫酸酯、β-环糊精硫酸酯等等。
测定样品中LDL、VLDL和CM中胆固醇量时，使用的蛋白可溶化剂，即使在化合物(III)、化合物(IV)或者化合物(V)等表面活性剂中，特别优选非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂等。非离子型表面活性剂，如聚环氧乙烷月桂基醚、聚环氧乙烷十六烷基醚、聚环氧乙烷二十二烷基醚、聚环氧乙烷单月桂酸酯、聚环氧乙烷单硬脂酸酯、聚环氧乙烷单油酸酯、聚环氧乙烷月桂基胺、聚环氧乙烷硬脂酰胺、蔗糖脂肪酸酯等等。阴离子型表面活性剂，如十二烷基苯磺酸钠、正十二烷基苯磺酸钠、月桂基硫酸钠、高级醇硫酸酯苏打等等。
测定样品中HDL中胆固醇量时，所用的蛋白可溶化剂，即使在化合物(IV)、经合物(VII)、化合物(VIII)或者胆汁酸类等表面活性剂中，特别优选使用阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、胆汁酸盐等等。阳离子型表面活性剂，如环氧乙烷十二烷胺、聚环氧乙烷十二烷胺、聚环氧乙烷十八烷胺等等。阴离子型表面活性剂，如椰子基甲基牛磺酸钠、月桂酰甲基牛磺酸钠、肉豆蔻酰甲基牛磺酸钠、棕榈酰甲基牛磺酸钠。硬脂酰甲基牛磺酸钠等等。非离子型表面活性剂，如聚环氧乙烷月桂基醚、聚环氧乙烷十六烷基醚、聚环氧乙烷十八烷基醚、聚环氧乙烷油烯基醚、聚环氧乙烷二十二烷基醚等等。胆汁酸盐，如，胆酸钠、脱氧胆酸钠、鹅胆酸钠、熊去氧胆酸钠、石胆酸钠、异鹅异胆酸钠、7-氧代石胆酸钠、12-氧代石胆酸钠、12-氧代鹅胆酸钠、7-氧代脱氧胆酸钠，等等。
本发明具有这样的特点，即使糖化合物和/或蛋白可溶化剂和胆固醇测定试剂系共存。胆固醇测定系本身是依据下述反应原理得到的物质。但色原体和测定波长不只局限于这些。 EMSEN-乙基-N-(3-甲基苯基)-N′-琥珀酰乙撑二胺胆固醇酯水解酶或者胆固醇氧化酶通常是市售的、有水解胆固醇酯能力的、由微生物或者动物中得到的胆固醇酯酶或脂蛋白脂酶、由氧化胆固醇以后生成过氧化氢的微生物得到的胆固醇氧化酶等。但是为了更进一步地显示这些酶的专属性、稳定性也用用化学修饰过的上述酶，修改基有以聚乙二醇为主成分的基、水溶性低聚糖残基、磺丙基等。另外也使用通过遗传因子得到的酶。
本发明方法适用于含有血液、尿等HDL的体液。
以下，介绍本发明的定量法。
实施本发明时，要先调制糖化合物溶液和/或蛋白可溶化剂溶液。糖化合物溶液的调制把糖化合物溶解在适当的缓冲液中，如50mM三盐酸缓冲液(pH7.4)，反应时，如一般调制到100mM以下，最好调制到3-80mM浓度范围以内。糖化合物先共存在胆固醇测定试剂中也可以。使蛋白可溶化剂溶液与胆固醇测定试剂共存，反应时，如一般调制到50g/l以下，最好调制到0.1-20g/l的浓度范围以内。调制糖化合物溶液和/或有胆固醇测定试剂共存的蛋白可溶化剂溶液，一般在20-50℃，最好在30-40℃保温5分钟左右。然后，向上述试剂中加样品或根据需要加入用水或者生理食盐水稀释的样品，反应5-30分钟。反应完了，在500-600nm如555nm处测定反应液的吸光度，算出胆固醇的量。测定样品中LDL、VLDL和CM中胆固醇量时，要另求总胆固醇量，通过求这些的差值能定量HDL胆固醇。
通过上记方法测定HDL、LDL、VLDL和CM中胆固醇量时，各脂蛋白的反应性因与胆固醇测定试剂共存的糖化合物和/或蛋白可溶化剂的组合不同而不同，用以下试验例表示。试验例1使用HDL、LDL、VLDL和CM的各部分(fraction)，这些部分是由血清通过超速离心法分离出来的。在糖化合物以5mM和蛋白可溶化剂聚环氧乙烷月桂基醚以5g/l的组合共存于胆固醇测定试剂中时，各脂蛋白的反应性如表1所示。表1
表1
-，+，++，+++分别表示反应强度，-＜+＜++＜+++
糖化合物和蛋白可溶化剂聚环氧乙烷月桂基醚组合以后，共存在胆固醇测定试剂中时，由LDL、VLDL和CM中胆固醇的量能间接地测定HDL中胆固醇的量。试验例2使用HDL、LDL、VLDL和CM的各部分，这些部分是由血清通过超速离心法分离出来的。使糖化合物二甲基-β-环糊精以5mM和蛋白可溶化剂以5g/l组合共存于胆固醇测定试剂中时，各脂蛋白的反应性如表2所示。
表2
表2<
>-，+，++，+++分别表示反应强度，-＜+＜++＜+++
糖化合物二甲基-β-环糊精和蛋白可溶化剂组合共存于胆固醇测定试剂中时，从LDL、VLDL和CM中胆固醇量能间接地测定HDL中胆固醇的量。试验例3使用HDL、LDL、VLDL和CM的各部分，这些部分是由血清通过超速离心法分离出来的。使糖化合物以5mM和蛋白可溶化剂环氧乙烷十二烷胺以5g/l组合共存于胆固醇测定试剂中时，各脂蛋白的反应性如表3所示。
表3
表3
+，++，+++分别表示反应强度，+＜++＜+++
糖化合物和蛋白可溶化剂环氧乙烷十二烷胺5g/l组合共存于胆固醇测定试剂中时，能直接测定HDL中胆固醇的量。试验例4使用HDL、LDL、VLDL和CM的各部分，这些部分是由血清通过超速离心法分离出来的。使糖化合物二甲基-β-环糊精以5mM和蛋白可熔化剂以5g/l组合共存于胆固醇测定试剂中时，各脂蛋白的反应性如表4所示。
表4
表4
+-，+，++，+++分别表示反应强度，+-＜+＜++＜+++。
糖化合物二甲基-β-环糊精和蛋白可溶化剂组合共存于胆固醇测定试剂中时，能直接测定HDL中胆固醇的量。
附图的简单说明
图1显示了LDL+VLDL+CM胆固醇浓度和用本发明方法测定的吸光度之间的相关关系。
图2显示了HDL胆固醇浓度和用本发明方法测定的吸光度之间的相关关系。
实施例1油制试剂，该试剂由二甲基-β-环糊精(5mM)、聚环氧乙烷月桂基胺(5g/l)、胆固醇酯酶(1.0U/ml)、胆固醇氧化酶(5.0U/ml)、4-氨基安替比林(2.2mM)、EMSE(1.1mM)和30mM古德(グッド)缓冲液(pH6.75)组成。样品是由血清进行超速离心以后分离出的LDL、VLDL、CM的混合物。将50μl的样品混合在3ml的、预先加温至37℃的上述试剂中，在37℃反应15分钟，在555nm处测定所得溶液的吸光度。
如果如图1所示。图1显示了LDL+VLDL+CM胆固醇浓度和吸光度之间的相关关系，表明LDL+VLDL+CM胆固醇浓度和吸光度之间有很好的相关性。实施例2使用血清样品代替由血清进行超速离心分离出的LDL、VLDL、CM的混合物样品，除此之外，其它和实施例1相同，测定吸光度，以图1作为基准，求血清样品中LDL+VLDL+CM胆固醇浓度(A)。另外，用酶法胆固醇测定试剂测定血清样品中总胆固醇浓度(B)，求血清样品中总胆固醇的量。HDL胆固醇浓度为〔(B)-(A)〕。对照法用葡聚糖硫酸-磷钨酸-Mg沉淀法〔用メデミナ-HDL(协和メデックス社制)沉淀〕(临床化学、初版、荻三男著、医典社、110页、1987年)，求血清样品中HDL胆固醇浓度。
结果显示由本发明方法得到的结果和由沉淀法得到的结果有很好的相关性。〔相关系数r＝0.8320(n＝20)〕。实施例3使用由羟乙基-β-环糊精(10mM)、聚环氧乙烷单月桂酸酯(0.5g/l)、胆固醇酯酶(1.0U/ml)、胆固醇氧化酶(5.0U/ml)、4-氨基安替比林(2.2mM)、EMSE(1.1mM)、30mM古德缓冲液(pH6.75)组成的试剂代替由二甲基-β-环糊精(5mM)，聚环氧乙烷月桂基胺(5g/l)、胆固醇酯酶(1.0U/ml)、胆固醇氧化酶(5.0U/ml)、4-氨基安替比林(2.2mM)、EMSE(1.1mM)和30mM古德缓冲液(pH6.75)组成的试剂，除此之外，其它和实施例2相同，将所得结果和由沉淀法测定的结果相比较。结论如表5。表5
表5
如表5所示，由本发明得到的结果和由沉淀法得到的结果之间有很好的相关性。实施例4使用由二甲基-β-环糊精(5mM)、胆固醇酯酶(1.0U/ml)、胆固醇氧化酶(5.0U/ml)、4-氨基安替比林(2.2mM)、EMSE(1.1mM)和30mM古德缓冲液组成的试剂代替由二甲基-β-环糊精(5mM)、聚环氧乙烷月桂基氨(5g/l)，胆固醇酯酶(1.0U/ml)、胆固醇氧化酶(5.0U/ml)、4-氨基安替比林、EMSE(1.1mM)和30mM古德缓冲液(pH6.75)组成的试剂，除此之外，其它和实施例2相同，将所得到的结果和由沉淀法得到的结果相比较。
结果显示本发明的结果和沉淀法的结果有很好的相关性。〔相关系数r＝0.969(n＝20)〕。实施例5
调制由二甲基-β-环糊精(5mM)、环氧乙烷十二烷胺(0.25g/l)、胆固醇酯酶(1.0U/ml)、胆固醇氧化酶(5.0U/ml)、4-氨基安替比林(2.2mM)、EMSE(1.1mM)、30mM古德缓冲液(pH6.75)组成的试剂。样品使用从血清中用超速离心法分离出来的HDL样品。使50μl样品混合在3ml预先加温至在37℃的上述试剂中，在37℃反应15分钟，在555nm处测定所得溶液的吸光度。
结果如图2所示。图2表明HDL胆固醇浓度和吸光度间有相关关系，表明HDL胆固醇浓度和吸光度之间有很好的相关性。实施例6用血清样品代替由血清超速离心分离出来的HDL样品，除此之外，其它和实施例5相同，测定吸光度，以图2作为基准求血清样品中HDL胆固醇浓度。对照法用葡聚糖硫酸-磷钨酸-Mg沉淀法〔用デタミナ-HDL(协和メデックス社制)沉淀〕(临床化学、初叔、获三男著、医典社、110页、1987年)，求血清样品中HDL胆固醇浓度。
结果表明本发明的结果和沉淀法的结果之间有很好的相关性。〔相关系数r＝0.889(n＝20)〕实施例7使用由胆酸钠(5mg/ml)、用聚乙二醇修饰的胆固醇酯酶(1.0U/ml)、用聚乙二醇修饰的胆固醇氧化酶(5.0U/ml)、4-氨基安替比林(2、2mM)、EMSE(1.1mM)、30mM古德缓冲被(pH6.75)组成的试剂代替二甲基-β-环糊精(5mM)、环氧乙烷十二烷胺(0.25g/l)、胆固醇酯酶(1.0U)/ml)、胆固醇氧化酶(5.0U/ml)、4-氨基安替比林(2.2mM)、EMSE(1.1mM)、30mM古德缓冲液(pH6.75)组成的试剂，除此之外，其它和实施例6相同，所得结果和沉淀法结果相比较。
结果表明本发明结果和沉淀法结果之间有很好的相关性。〔相关系数r＝0.980(n＝40)〕本发明提供了简便的HDL胆固醇的定量方法，这个方法不需要烦杂的分离操作过程。
权利要求
1.高密度脂蛋白(HDL)中胆固醇的定量方法，该定量方法的特征在于在糖化合物和/或蛋白可溶化剂的存在下，测定样品中低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)中胆固醇的量，再求出与样品中总胆固醇量的差值。
2.HDL胆固醇的定量方法，该定量方法的特征在于在糖化合物和/或蛋白可溶化剂的存在下，测定样品中HDL中胆固醇的量。
3.权利要求1或2中记载的定量方法，其中糖化合物是用通式(I)表示的化合物 〔式中R1、R2和R3可以相同也可以不同，表示氢原子、取代的或者没取代的烷基、取代的或者没取代的烷醇基、磺基、-(葡萄糖基)p-H(式中，P是1或者2)或-麦芽糖基)q-H(式中，q是1或者2)，m是6-8的整数〕、或以式(II)表示的化合物，(C6H10O5)nSO3R4(II)(式中，R4代表氢原子或者Na，n是5-2000的整数)。
4.权利要求1中记载的定量方法，其中蛋白可溶化剂是以通式(III)表示的化合物R5(CH2CH2O)aH(C2H4OOR6)b(III)〔式中，a是1-200的整数，b是0或者1，R5是R14-X-O-(式中，R14代表烷基或链烯基，X是单键或者CO)或者H-(CH2CH2O)c-N(R15)-(式中，C是1-200的整数，R15代表烷基或者链烯基)，R6代表烷基或者链烯基〕、或以通式(IV)表示的化合物， (式中，R7、R8、R9、R10、R11和R12可以相同也可以不同，代表烷醇基)、或以式(V)表示的化合物，R13-Y-SO3Na (V)〔式中，R13是烷基或者是链烯基，Y代表 -O-，-CH(R16)-(式中，R16是烷基或者链烯基)、-CH2CH(OH)(CH2)d-(式中，d是1-22的整数)、-CH＝CH(CH2)e-(式中，e是1-22的整数)、-OCOCH(CH2COOR17)-(式中，R17是烷基或者链烯基)或这些的混合物〕。
5.权利要求2中记载的定量方法，其中蛋白可溶化剂是以通式(IV)表示的化合物R18NHCH2CH2OH (VI)(式中，R18是烷基或者链烯基)、以通式(VII)表示的化合物R19CON(CH3)CH2CH2SO3Na(VII)(式中，R19是烷基或者链烯基)、或以通式(VIII)表示的化合物R20O(CH2CH2O)fH (VIII)(式中，f是1-100的整数，R20是烷基或者链烯基)。
6.权利要求2中记载的定量方法，其中蛋白可溶化剂是胆汁酸类。
7.权利要求1-6中记载的定量方法，通过测定样品中胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶作用而生成的过氧化氢的量而测定胆固醇的量，在该方法中使用的胆固醇酯水解酶或胆固醇氧化酶是被化学修饰过的胆固醇酯酶或被化学修饰过的胆固醇氧化酶。
全文摘要
本发明是关于HDL中胆固醇的定量方法，该定量方法的特征在于在糖化合物和/或蛋白可溶化剂的存在下，测定样品中低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)中胆固醇的量，而求与样品中总胆固醇量的差值。另一个定量方法的特征在于在糖化合物和/或蛋白可溶化剂的存在下，测定样品中HDL中胆固醇的量。
文档编号C12Q1/44GK1127039SQ9519028
公开日1996年7月17日 申请日期1995年3月8日 优先权日1994年3月8日
发明者宫内一人, 柏原典彦, 多多纳俊雄, 首藤荣子, 杉内博幸, 入江徹美, 上釜兼人, 大泽进 申请人:协和梅迪克斯株式会社