专利名称：用复合固相酶制品生产d-氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及复合固相酶制品和使用该制品生产D-氨基酸的方法。尤其是本发明的复合固相酶制品对D-α-氨基酸的生产有用，D-α-氨基酸是抗生素生产的中间化合物，例如D-(对羟苯丙)甘氨酸用于抗生素、amoxyciuin和类似物的生产。
背景技术：
旋光性D-氨基酸作为药品的中间化合物时是重要的化合物，已知它们可经过用乙内酰脲酶(下文有时缩写成“Hale”)将5-取代的乙内酰脲水解成相应的D-N-氨甲酰基-α氨基酸的不对称水解反应(JP-B62-30785)与用D-N-氨甲酰基-α氨基酸酰胺水解酶(下文有时缩写成“脱氯甲酰酶”或“DCase”)将所得的D-N-氨甲酰基-α-氨基酸转变成相应的D-α-氨基酸的转化反应(PCT/JP91/01696WO92/10579)相结合有效地生产。
另外，JP-A63-185382，WO92/00739和类似文献公开了使用这些酶以所谓的固相酶形式可更高效地进行各个反应，其中固相酶在诸如离子交换树脂和类似物的支持物上被固定化。
然而，为了进行这些反应使用了两步反应，因为两种酶的最适和稳定的PH值互相之间有相当大的差异。因而两种固相酶应分别制备并需要复杂的反应操作。
发明目的本发明涉及使用固相酶树脂有效地生产D-α-氨基酸的技术，该树脂经过将乙内酰脲酶和脱氨甲酰基酶以酶的共存状态(下文称作“复合酶”)同时在一种固定化树脂支持物上固定获得。
在将5-取代的乙内酰脲转化成D-α-氨基酸的这两个酶促反应中，一般来说，乙内酰脲酶反应的最适PH是PH8到9，且随着PH值的增加，底物的可溶性增加。另外，乙内酰脲环的消旋反应在碱性范围内启动。因此，需要在PH范围从7到10，优选在碱性范围内进行乙内酰脲酶反应。另一方面，一般来说，脱氨甲酰基酶反应的最适PH是PH6.5至9.0，但随着PH的升高所形成的氨对反应的阻碍也显著增加，因此，需要在PH大约为中性的条件下进行脱氨甲酰基反应。
如果进行这些反应时可采用所谓的一步反应(即这两个酶促反应可同时在一个反应容器中进行)，与所谓的两步反应(其中，两种不同的酶分别与底物反应)相比，可使反应操作简单并能缩短总的反应时间。另外，经过将乙内酰脲酶反应(它是一种可逆反应)与脱氨甲酰基酶反应(它是一种不可逆反应)结合起来，可提高乙内酰脲的转化产率，以及使随后的D-氨基酸纯化简化。因此，可望显著降低生产成本。然而，当酶在不同的固定化支持物上分别固定并使用它们来混合时，由于最适PH的差异使反应性较差，而且固相酶的稳定性存在问题。
本发明人进行深入细致的研究以生产一种复合固相酶制品，其中，两种酶均在固定化支持物上同时固定。如果这两种酶同时固定，两个酶促反应在树脂的微空隙内连续进行。因而不需脱氨甲酰基酶的底物(D-N-氨甲酰基-α-氨基酸)经扩散从固相Hase移动到固相DCase，且在微空隙中PH的变化可达到最小。因此，预期酶各自的反应性进一步增加，而且相信会改善由于氨引起的产量障碍及重复使用的酶的稳定性。
本发明概述本发明提供了经一步反应从相应的DL-5-取代的乙内酰脲有效地生产D-氨基酸的方法，此方法包含在大约中性的PH值下使用复合固相酶，所说的复合固相酶经过将其最适PH在碱性范围内的乙内酰脲酶和其最适PH为大约中性的D-N-氨甲酰基-α-氨基酸酰胺水解酶以共存状态同时在阴离子交换树脂固定化支持物上固定获得(下文称为复合酶)。
本发明的详细说明至于本发明所用的乙内酰脲酶，可用来自动物、植物和微生物的酶。来自微生物的乙内酰脲酶适于工业生产。至于这类微生物，JP-B62-30758所公开的那些就是例子。细菌类包括无色杆菌属，气杆菌属，气单胞菌属，土壤杆菌属，产碱杆菌属，节细菌属，杆菌属，短杆菌属，棒状杆菌属，肠杆菌属，欧文氏菌属，埃希氏杆菌属，克雷白氏杆菌属，微杆菌属，微球菌属，精蛋白杆菌属，变形杆菌属，假单胞菌属，八迭球菌属，沙雷氏菌属，黄单胞菌属和类似物。放线菌类包括线菌属，分支杆菌属，奴卡氏菌属，链霉菌属，游动放线菌属和类似物。丝状真菌包括曲霉属，拟青霉菌属，青霉属和类似物。酵母包括假丝酵母属，毕赤酵母属，红酵母属，圆酵母属和类似物。
在上述微生物中，具有相当高的乙内酰脲酶活性并在实际应用中表现出色的菌株例子包括阴沟气杆菌IAM1221，发根病土壤杆菌IFO13259，不定形短杆菌IFO12145，腐烂棒状杆菌IFO3306，黄色微杆菌ATCC10340，玫瑰色微球菌IFO3764，沟槽假单胞菌IFO12996，耻垢分枝杆菌ATCC607，珊瑚奴卡氏菌IFO3338，浅黄链霉菌IFO3241，杆菌属SP，KNK108(FERMP-6056)，杆菌属sp.KNK245(FERM BP-4863)和类似物。
另外，可使用以人工微生物生产的酶，其中以基因重组技术赋予乙内酰脲酶生产力，例如，大肠杆菌HB101PTH104(FERM BP-4864)，或与JP-A53-136583所公开的相比增加的或具有相似活性的二氢嘧啶酶。
至于本发明所用的脱氨甲酰霉，其来源不作具体限定，可使用那些来自动物，植物和微生物的酶。然而，为了工业生产，来源于微生物的酶是合适的。这种微生物的例子包括天然存在的微生物，例如在JP-B57-18793，JP-B63-20520和JP-B1-48758中公开的土壤杆菌属，假单胞菌属，节细菌属，产碱杆菌属，无色杆菌属，莫拉克斯氏菌属，副球菌属，气杆菌属，气单胞菌属，短杆菌属，杆菌属，产黄菌属和沙雷氏菌属，或在WO91/01696中描述的人工微生物，其中以基因重组技术赋予或增强脱氨甲酰基酶生产力。这类微生物有代表性的例子包括土壤杆菌属SP.KNK712(FERM BP-1900)，假单胞菌属SP.KNK003A(FERM BP-3181)，假单胞菌属SP.KNK505(FERM BP-3182)，大肠杆菌JM109PAD108(FERM BP-3184)，大肠杆菌JM109pPD304(FERM BP-3183)和类似物。
当使用负责脱氨甲酰基酶热抗性的氨基酸被另一氨基酸取代的稳定脱氨甲酰基酶时，可使用WO94/03613中公开的下列转化子。例如，该转化子包括E.coli JM109pAD402(FERM BP-3912)，E.
coli JM109pAD404(FERM BP-3913)，E.coli JM109pAD406(FERM BP-3914)，E.coli JM109pAD416(FERM BP-3915)，E.coliJM109pAD428 E.coli JM109pAD429(FERM BP-4035)，E.coliJM109pAD431，E.coli JM109pAD434，E.coli JM109pAD435，E.coliJM109pAD439，E.coli JM109pAD441，E.coli JM109pAD445，E.coliJM109pAD447，E.coli JM109pAD448，E.coli JM109pAD450，E.coliJM109pAD421，E.coli JM109pAD422，E.coli JM109pAD423，E.coliJM109pAD424，(FERM BP-4034)，E.coliJM109pAD425，E.coliJM109pAD426，E.coli JM109pAD427，E.coli JM109pAD451，E.coliJM109pAD452，E.coli JM109pAD453，E.coli JM109pAD461，E.coliJM109pAD454，E.coli JM109pAD455，(FERM BP-4036)，E.coliJM109pAD456，E.coli JM109pAD468，E.coli JM109pAD469，E.coliJM109pAD470，E.coli HB101pNT4553，(FERM BP-4368)或类似物。
当使用这种稳定酶时，本发明的复合固相酶制品的重复使用可获得较好效果。
本发明中所用的酶可经过使用能产生两种酶的微生物同时生产。作为选择，可使用各自只能产生一种酶的微生物分别或同时生产两种酶。至于能产生两种酶的微生物，可使用从天然来源分离的微生物，例如在JP-B63-205200中公开的土壤杆菌属和类似物。另外，可使用经过从天然来源分离的微生物中分离出两种酶的基因并将它们导入宿主中制备的重组微生物，例如，在WO94/00577中公开的微生物。作为选择，可从相同或不同微生物中分离两种酶的基因并以两种基因的可表达形式插入相同的载体或插入具有不同复制方式的不同载体(例如pUC19和pACYC184)中。然后，可用上述相同载体或不同的载体转化受体宿主(如大肠杆菌)以便在单个微生物中能生产两种酶。在这些情况下，可根据特定的目的经过选择具有各种能力的启动子类型和具有不同拷贝数的质粒来改变各个酶生产的比率。然而，优选调节比率使获得几乎相等量的酶蛋白。在使用分别产生不同酶的微生物的情况下，也可使用从天然来源分离的菌株或使用基因重组技术制备的重组微生物。在这种情况下，可经过分别培养生产者微生物或培养以各种比率混合的培养物来进行酶的生产，优选的比率是使能产生几乎相等量的酶。
培养可以需氧方式进行，例如，经过使用锥瓶振动培养或经过通气旋转培养。至于在培养中所用的培养基，正常情况下可使用的培养基包含一般使用的天然营养物，例如肉汤提取物和多肽胨及类似物。当乙内酰脲酶与脱氨甲酰基酶分别或同时生产时，经过加入一定量的锰离子进行培养可获得好效果，例如加入1到100mg/升的氯化锰，优选大约20mg/升。
在本发明中，存在于固相酶制品中的酶可以纯化的，部分纯化的或粗制品的形式存在，或在某些情况下，可以微生物细胞本身的形式存在。至于酶在能表现出酶促活性的条件下，酶可以任何形式存在，且可与任何物质共存。
在本发明的复合固相酶制品的制备或应用中，为了重复使用可经过加入抗氧化剂获得较好的效果。至于这种抗氧化剂，可使用二硫苏糖醇，2-疏基乙醇，L-半胱氨酸盐酸，盐酸半胱胺，二硫赤藓糖醇，二硫苏糖醇和二硫赤藓糖醇的混合物，还原的谷胱甘肽和类似物。
根据固相酶的特定使用条件可改变所用的固相支持物。当用粗制酶溶液(如无细胞提取物)或以硫酸铵沉淀法处理的部分纯化的酶溶液或类似物进行固定时，可使用具有离子交换基团或共价结合基团的多聚体支持物。
至于具有离子交换基团的多聚体支持物，可使用诸如Duouite(注册商标)系列，或Amberlite IRA(注册商标)系列(其交换基团是一级，二级，三级和四级铵)；或具有二乙醇类型官能团的聚苯乙烯树脂，例如可用Diaion EX。
至于具有共价结合基团的支持物，可用具有醛作为结合基团的取代的聚异丁烯酸酯多聚体，用聚乙烯亚胺/戊二醛复合物覆盖的高密度矾土和类似物。
如固定完整的微生物细胞，例如活细胞或干细胞，可使用诸如聚丙烯酰胺，聚氨基甲酸乙酯或藻酸钙的多聚体，或诸如矾土的多孔物质。
本发明的复合固相酶制品按如下方法生产。将Hose和DCase活性被适当调整的粗制复合酶溶液与支持物接触以及吸附两种酶，并用交联剂处理使其稳定。为了制备粗制复合酶的溶液，首先经过培养微生物细胞生产各种酶。在这种情况下，当使用能同时生产两种酶的微生物时，经过收集细胞和用诸如声处理，机械破碎(例如，匀浆器)或酶处理破碎细胞来制备无细胞提取物。当使用不同微生物制备复合酶的溶液时，其制备可经过分别培养微生物，收集细胞制备各自的无细胞提取物并混合它们来完成。或者其制备可经过将各自的生产者微生物一起培养并同时破碎细胞以制备两种酶混合在一起的无细胞提取物来完成。当两种酶以不同的微生物生产时，根据微生物的种类和培养方法的差别生产力有较大程度的差别。然而，一般来说，对于乙内酰脲酶，正常生产者微生物以大约0.1到大约10单位/ml(本文所用的酶的一个单位定义为在PH8.7，40℃下，1分钟内转化底物5-(对羟苯丙基)乙内酰脲成为D-N-氨甲酰基-对羟苯丙甘氨酸所需的量)的水平生产乙内酰脲酶，重组的人工生产者微生物以大约5到大约150单位/ml生产该酶。对于脱氨甲酰基酶，正常生产者微生物以大约0.01到大约2单位/ml(本文所用的酶的一个单位定义为在PH7.0，40℃下，1分钟内转化底物D-N-氨甲酰基-对-羟苯丙甘氨酸成为D-对羟苯丙甘氨酸所需的量)生产脱氨甲酰基酶，重组的人工生产者微生物以大约0.1到大约20单位/ml生产该酶。在粗制复合酶溶液中调整Hase和DCase活性的比率以便从5-取代的乙内酰脲产生D-α-氨基酸的反应能最高效地进行。如下文所述，在中性pH下进行该反应，该pH接近DCase的最适pH，因而该条件与Hase表现出最大活性的条件不同。然后需要调整两种酶的活性以便在反应pH下表现出几乎相等的活性。例如，在pH7.5进行反应的情况下，所需的复合固相酶制品可经过使用酶溶液进行固定化反应来生产，在酶溶液中蛋白质的量和酶活性几乎相等以使乙内酰脲酶单位是DCase的大约5倍。固定后为了维持这一活性，需要在粗制复合酶的溶液中酶活性的比率(Hase∶DCase)应在1到10∶1的范围内。因此，在微生物细胞破碎后和吸附前，将粗制复合酶活性调成这一水平。
另外，为了在支持物上吸附合适量的酶，优选将粗制复合酶溶液中脱氨甲酰基酶浓度调成10到300单位/ml。吸附的活性是加入活性的大约20％到大约90％且在两种酶之间基本上看不到区别。
支持物在其交换基团用诸如氯化钠的水溶液活化和诸如在缓冲溶液中平衡后使用。优选调整粗制复合酶溶液和支持物的比率使粗制酶溶液中蛋白质的总量几乎与支持物的最大吸附能力相同。如果必要，可加入1到10mm的抗氧化剂和/或0.5到20mm的锰离子。在4到30℃下，混合物优选在15℃下搅拌混合物当吸附的酶量达到给定量(一般8到48小时，优选在惰性气体环境如氮气中进行)后，经过滤收集支持物。然后洗涤支持物并经过用交联剂处理使其固定化来稳定支持物。至于交联剂，可使用已知试剂，例如不超过1％，优选0.1到0.2％的戊二醛。用蒸馏水和缓冲溶液(优选上面所述的含0.1到20mm，一般为1到5mm的抗氧化剂)洗涤交联的复合酶固相制品并在低温(40℃)潮湿状态下贮存于密封的容器中。一般来说，对于脱氨甲酰基酶，由此获得的复合固相酶制品的活性为5到80单位/g支持物。对于乙内酰脲酶，根据吸附条件其活性是脱氨甲酰基酶活性的1到10倍。
使用本发明的复合固相酶制品从5-取代的乙内酰脲生产D-α-氨基酸的方法将在下文描述。
经过将底物5-取代的乙内酰脲与复合固相酶制品反应来进行该反应，如果必要的话，有抗氧化剂和/或锰离子存在。正常情况下，优选在0.1到20mm抗氧化剂和锰离子存在的条件下进行反应。根据下面反应式进行反应 其中R代表苯基，以羟基取代的苯基，烷基，取代的烷基，芳烷基或噻吩基。
所用的底物5-取代的乙内酰脲浓度是0.1到30％(W/V)，优选1到5％(W/V)。优选所用的复合固相酶制品的量是使脱氨甲酰基酶活性为大约10到大约20单位/g底物。反应温度根据特定的酶进行变化，但一般为30到60℃。具有热抗性的酶在较高温度下使用。
反应pH适当地选自6.5到8.0的范围，该pH范围对DCase而言几乎是最适的。然而，它相当远离Hase的最适pH，Hase的活性比在最适pH下的活性低几倍。尽管如此，最终D-α-氨基酸的产量由最后一步的酶(DCase)控制，因此优选根据DCase设定酶的量和反应条件(即DCase的最适条件)并结合Hase活性与DCase活性的比例。一般来说，调整将要吸附于支持物上的酶的比率使表现出几乎相等的活性，尽管这一比率根据特定的反应条件而变化。“几乎相等的活性”指在pH7.5下测定的乙内酰脲酶活性(以“单位(pH7.5)”表示)与上述脱氨甲酰基酶活性的比率为大约0.5到1.5∶1的情况。将反应pH调到由此选定的pH范围，一般调到pH7.5来进行反应。经过这些操作，克服了Hase的不适条件并使反应平衡向生产D-N-氨甲酰基氨基酸的方向倾斜。因此可比预期更有效地进行反应并能提高底物5-取代的乙内酰脲的转化。当在接近乙内酰脲酶最适pH的碱性pH范围内进行反应时，尽管D-N-氨甲酰基氨基酸的生产能成功地进行，但脱氨甲酰基酶活性降低到最适pH活性的一半以下。另外，观察到总产量减少且脱氨甲酰基酶本身的稳定性降低，因为反应产生的氨大幅度地抑制反应。由于这些原因，当复合固相酶制品具有的固定化比率使脱氨甲酰基酶反应轻微地决定速率并在接近脱氨甲酰基酶最适反应条件和底物浓度的条件下使用时，使用复合固相酶制品的反应能有效地进行。另外，其优势在于复合固相酶制品的总活性容易控制，因为Hase的生产力高且DCase催化不可逆的反应。
一般以过柱方法或通过将复合固相酶制品悬浮于反应容器中进行反应。在后一种情况下，通常进行批量反应且反应时间是每批大约6到大约48小时。经过使用本发明的复合固相酶制品，可在一步反应中以高产量从5-取代的乙内酰脲生产相应的D-氨基酸。下面实施例进一步详细地解释本发明，但不能当作是对其范围的限制。
实施例1首先，为了制备乙内酰脲酶的酶溶液，将杆菌属sp.KNK108(FERM p-6056)接种到250ml种子培养基(肉膏1.0％，多肽胨1.0％，酵母浸出汁0.5％(pH7.0))中并在33℃培养大约25小时，将该种子培养物接种到2.5升培养基(肉膏1.0％，多肽胨1.0％，酵母浸出汁0.5％，尿嘧啶0.1％，MnCl22O ppm(pH7.5))中并在33℃培养大约16小时。离心收集微生物细胞并悬浮于50ml20mmMnSO4水溶液中。调节pH至8.5后经声处理破碎细胞，去掉残余物以获得乙内酰脲酶的粗制酶溶液(107单位/ml)。
另外，为了制备脱氨甲酰基酶的酶溶液，将大肠杆菌HB101pNT4553(FERM BP-4368)在20ml含50μg/ml氨苄青霉素的2YT培养基(Bacto蛋白胨1.6％，Bacto酵母浸出汁1.0％，Nacl 0.5％)中37℃培养16小时。该培养物以1％的量接种到1.4升2YT培养基中，37℃培养大约28小时。离心收集细胞并悬浮于140ml 5mm二硫苏糖醇溶液中。将pH调到7.0后，经声处理破碎细胞，去掉残余物获得作为脱氨甲酰基酶粗制酶溶液的上清液(36单位/ml)。
实施例2使用实施例1获得的粗制酶溶液进行酶的固定化。首先用1MNacl和离子交换水洗涤作为固相支持物的Duolite A-568(Rohm和Haas)，接着放入离子交换水中，将pH调到7.5。向8.4g该树脂中加入20ml乙内酰脲酶的粗制酶溶液和11.5ml脱氨甲酰基酶的粗制酶溶液，两者的pH值已调到7.5，混合物在氮气环境中15℃下搅拌大约20小时。用0.5mM MnSO4溶液洗涤该树脂两次后，将树脂悬浮于5倍体积的离子交换水中。将悬液pH调到7.5后，逐步加入544μl 2.5％戊二醛并搅拌35分钟。悬液用50mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM DTT和1mM MnSO4处理过夜，然后经过滤收集复合固相酶制品(每1g树脂乙内酰脲酶活性为8.2个单位(pH7.5)，脱氨甲酰基酶活性为9.9个单位)。
然后，作为对照，制备分别固定两种酶的树脂。
将20ml乙内酰脲酶的粗制酶溶液和60ml的脱氨甲酰基酶粗制酶溶液分别与4.2g和22.0g上述固定化支持物混合，按上面所述相同的操作进行以获得各个固相酶，其中每种酶分别固定(乙内酰脲酶固相酶24个单位/g树脂，2.7个单位/g树脂(pH7.5)，脱氨甲酰基酶固相酶37个单位/g树脂)。
实施例3经过使用实施例2获得的复合固相酶制品和分别含单个酶的对照固相酶，进行从5-取代的乙内酰脲产生相应的D-α-氨基酸的反应。
经过向100ml 0.1M KPB(pH7.5)，1mM MnSO4和5mM DTT的溶液中加入1g作为底物的5-(对羟苯丙)乙内酰脲后，通入足够的氮气并将反应条件调到40℃和pH7.5。为了获得两种酶的相同酶活性，加入0.97g复合固相酶制品或3.0g乙内酰脲酶固相酶和0.26g脱氨甲酰基酶固相酶。通入氮气并以2N H2SO4或6N NaOH将反应pH控制在7.5进行反应。反应进行29小时并定期取样。以高效液相层析(Nippon Bunko，Finepack SIL C-18柱)测定每个取样点产生的对羟苯丙甘氨酸的量。
结果如
图1所示。
如图1所见，当两种酶同时固定在相同树脂中时可更高效地进行反应。
实施例4以复合固相酶制品重复进行反应以研究酶活性的稳定性。向100ml 1mM MnSO4和5mM DTT的溶液中加入2克5-(对羟苯丙)乙内酰脲，将pH调至7.5。向混合物中加入实施例2获得的8.9g复合固相酶制品，经通入氮气和将pH控制在7.5使反应在40℃下进行23小时。经抽吸过滤反应混合物后，根据上述相同的方式向复合固相酶中加入另一混合物并进行反应。重复操作五次，在每次反应终点测定两种酶的活性。
在第一次反应中的相对活性如图2所示。
在后五次反应中很少观察到活性下降。
实施例5为了制备乙内酰脲酶的酶溶液，含杆菌属SP.KNK245(FERMBP-4863)乙内酰脲酶基因的大肠杆菌HB101pTH104(FERM BP-4864)在20ml 2YT培养基中37℃培养大约16小时。将该培养物转移到1.2升含50μg/ml氨苄青霉素和400ppm MnCl2·4H2O的2YT培养基中并在37℃下培养26小时。离心收集细胞并悬浮于80ml1mM MnSO4水溶液中。用氨水将pH调到8.5后，经声处理破碎细胞，离心去掉残余物。将上清液pH调到8.5后，在60℃下进行热处理20分钟。离心去掉变性蛋白质以获得乙内酰脲酶的粗制酶溶液(1,100单位/ml)。
经过使用该粗制酶溶液和如实施例1所述根据相同方式制备的脱氨甲酰基酶的粗制酶溶液(240个单位/ml)，根据实施例2所述相同的方式制备复合固相酶制品。经过使用30ml脱氨甲酰基酶的粗制酶溶液和13ml乙内酰脲酶的粗制酶溶液，根据与实施例2所述相同的方式将酶固定于29g树脂上(在每1g树脂中，脱氨甲酰基酶45单位，乙内酰脲酶119单位，44单位(pH7.5))。
作为对照，使用分别固定有两种酶的树脂。按照实施例2所述制备脱氨甲酰基酶的固相酶(43单位/g树脂)。经过将21.8g用于固定的树脂与60ml粗制酶溶液混合(177单位/g树脂，51单位/g(pH7.5))根据实施例2所述的方法制备乙内酰脲酶的固相酶。
实施例6经过使用实施例5获得的5g复合固相酶制品，与在不同树脂上分别固定酶所制备的固相酶一样，5.6g乙内酰脲酶固相酶和5.2g脱氨甲酰基酶固相酶的混合物(脱氨甲酰基酶活性(pH7.5)等于复合固相酶制品的活性，乙内酰脲酶活性(pH8.7)是复合固相酶制品的2倍)在实施例5中获得。根据实施例3所述的方法用3％的底物进行反应。
结果如图3所示。
如图3所示，尽管乙内酰脲酶活性是单独的固相酶活性的一半，复合固相酶制品的反应活性与单独的固相酶反应活性相似。因此，发现以复合固相酶制品进行的反应更有效并且用于固定的昂贵树脂量可大量减少。
实施例7经过使用实施例5获得的复合固相酶各5g，研究了反应pH的效力。在7.0，7.25和7.5三个pH水平，用3％底物进行了反应。测量了转化99％的底物所需的时间。时间分别是5.5，5.4和6.75小时。因此，发现pH7.0和pH7.25对反应有优势。
如上文所述，根据本发明，经过使用在同一树脂上同时固定乙内酰脲酶和脱氨甲酰基酶生产的复合固相酶制品，在从5-取代的乙内酰脲生产相应的D-α-氨基酸的反应中，可能进行一步反应比2步反应操作更简单，且比用两种酶分别在不同树脂中固定获得的2种固相酶的混合物进行的反应效率更高。
附图的简要说明图1描绘了使用本发明的复合固相酶制品和分别将乙内酰脲酶和脱氨甲酰基酶固定于不同树脂中制备的混合物在实施例3中从5-(对羟苯丙基)乙内酰脲生产相应的D-对羟苯丙基甘氨酸的反应的时间过程。
图2描绘了在实施例4中使用复合固相酶制品在重复的反应中酶的稳定性。
图3描绘了实施例6中复合固相酶制品的活性与分别制备的固相酶制品混合物的活性(乙内酰脲酶活性是复合固相酶制品的2倍)的比较。
权利要求
1.一种经过一步反应从相应DL-5-取代的乙内酰脲生产D-氨基酸的方法，它包含在大约中性的pH下使用一种复合固相酶，所说的复合固相酶经过将最适pH在碱性范围的乙内酰脲酶(下文缩写成Hase)和最适pH大约为中性的D-N-氨甲酰基-α-氨基酸酰胺水解酶(下文缩写成DCase)在共存状态下同时固定于固相支持物上来获得。
2.根据权利要求1生产D-氨基酸的方法，其中用于固定的复合酶是经过分别生产Hase和DCase，然后将它们混合来制备的。
3.根据权利要求1或2生产D-氨基酸的方法，其中所用的Hase是来自属于杆菌属的微生物。
4.根据权利要求1或2生产D-氨基酸的方法，其中所用的Hase是来自杆菌属SP.KNK108(FERM P-6056)或杆菌属SP.KNK245(FERM BP-4863)。
5.根据权利要求1或2生产D-氨基酸的方法，其中所用的Hase是来自重组大肠杆菌，特别是大肠杆菌HB101pTH104(FERMBP-4864)。
6.根据权利要求1或2的生产D-氨基酸的方法，其中所用的DCase来自土壤杆菌属SP.KNK712(FERM BP-1900)，假单孢菌属SP.KNK003A(FERM BP-3181)，假单孢菌属SP.KNK505(FERM BP-3182)，大肠杆菌JM109pAD108(FERM BP-3184)，大肠杆菌JM109pPD304(FERM BP-3183)。
7.根据权利要求1至4任一项的D-氨基酸的生产方法，其中所用的DCase来自重组微生物E.coli JM109pAD402(FERM BP-3912)，E.coli JM109pAD404(FERM BP-3913)，E.coli JM109pAD406(FERM BP-3914)，E.coli JM109pAD416(FERM BP-3915)，E.coli JM109pAD428 E.coli JM109pAD429(FERM BP-4035)，E.coli JM109pAD431，E.coli JM109pAD434 E.coli JM109pAD435，E.col-iJM109pAD439，E.coli JM109pAD441，E.coli JM109pAD445，E.coliJM109pAD447，E.coli JM109pAD448，E.coli JM109pAD450，E.coli JM109pAD421，E.coli JM109pAD422，E.coliJM109pAD423，E.coliJM109pAD424，(FERM BP-4034)，E.coliJM109pAD425，E.coli JM109pAD426，E.coli JM109pAD427，E.coli JM109pAD451，E.coliJM109pAD452，E.coli JM109pAD453，E.coli JM109pAD461，E.coliJM109pAD454，E.coliJM109pAD455，(FERM BP-4036)，E.coliJM109pAD456，E.coli JM109pAD468，E.coli JM109pAD469，E.coli JM109pAD470，或E.coli HB101pNT4553(FERM BP-4368)，其稳定性经过对来自土壤杆菌属SP.KNK712(FERM BP-1900)的DCase进行氨基酸取代来提高。
8.根据权利要求1生产D-氨基酸的方法，其中用于固定化的复合酶经过同时生产Hase和DCase制备。
9.根据权利要求8生产D-氨基酸的方法，其中同时生产Hase和DCase的微生物是土壤杆菌SP.KNK712(FERM BP-1900)，根瘤菌属SP.KNK1415(FERM BP-4419)或假单孢菌属SP.KNK003A(FERM BP-3181)。
10.根据权利要求8生产D-氨基酸的方法，其中复合酶经过培养含有将Hase基因和DCase基因连接于相同载体上而制备之质粒的宿主而产生。
11.根据权利要求10生产D-氨基酸的方法，其中含有经过将Hase基因和DCase基因连结于相同载体制备之质粒的宿主是大肠杆菌HB101pPHD301(FERM BP-4866)或大肠杆菌JM109-pAHD101。
12.根据权利要求8生产D-氨基酸的方法，其中的复合酶经过将Hase基因和DCase基因连结于具有不同复制方式的不同载体上，将这些载体导入相同的宿主并培养该宿主来生产。
13.根据权利要求8生产D-氨基酸的方法，其中复合酶经过将产Hase的微生物和产DCase的微生物一起培养来生产。
14.一种复合固相酶制品，包含来自相同或不同微生物的乙内酰脲酶和脱氨甲酰基酶、一种抗氧化剂，锰离子和带有所说酶的支持物，支持物携带的乙内酰脲酶和脱氨甲酰基酶的酶活性在反应pH在6.5至8.0之间时几乎相等。
全文摘要
本发明公开了一种经过一步反应从相应DL-5-取代的乙内酰脲有效生产D-氨基酸的方法，它包含使用pH大约为中性的复合固相酶，所说的复合固相酶经过将具有最适pH在碱性范围内的乙内酰脲酶和具有最适pH大约为中性的D-N-氨甲酰基-α-氨基酸酰胺水解酶以共存状态同时固定于一种固相支持物上来获得。
文档编号C12N1/15GK1129957SQ95190569
公开日1996年8月28日 申请日期1995年6月23日 优先权日1994年6月24日
发明者难波弘宪, 山田勇喜雄, 矢岛丽嘉, 高野昌行, 池中康裕, 高桥里美, 大桥武久 申请人:钟渊化学工业株式会社