古生物体的制作方法

专利名称：古生物体的制作方法
技术领域：
本发明涉及从如琥珀中重获古微生物，以及分离和培养这些古微生物的方法。该发明首次揭示变成化石的微生物可以被重获并培养显示出生存能力。本发明的古微生物及其副产品的多种用途进行了展望，包括它们在农业、工业加工、生物补救、诊断及疾病治疗中的应用。
背景技术：
琥珀是一种天然、非晶的聚合玻璃，是植物变成化石的树脂，具有与其它合成的聚合玻璃共同的机械、绝缘及热特点，Poinar，G.O.，Lifein Amber，Stanford University Press，Stanford，CA(1992)。产生出琥珀的植物树脂包含萜类化合物、酸、醇及香料油的复合混合物。随树脂的年代增加，树脂变得更硬并形成一种叫硬树脂的半化石产物。近代变成化石的树脂认为是硬树脂(少于400万年)，而更长时间的通常称为琥珀。琥珀和硬树脂可通过研究其物理特征得以较好区分，如熔点、硬度、溶解度等。
已知最古老的琥珀是从古生代的石炭纪(360～286百万年)重新获得的。多数研究较多的琥珀来自中生代的白垩纪(65～144百万年前)和新生代的第三纪(2～65百万年前)。关于琥珀的广泛讨论及其特性，见Poinar(前述)。
琥珀好像具有非凡的保存生物材料，包括细胞器的能力。例如，本世纪初科学家们已观察到琥珀包涵体中的保存组织，见Poinar，前述266～271。特别地，在波罗地海琥珀中变成化石的四千万年的苍蝇中还观察到保存完好的细胞和细胞成分，包括线粒体和染色质，Poinar andHess，Science 2151241-1242(1982)。
最近，科学家们开始评价琥珀能不能保存完整的古代遗传物质。如80年代中期，科学家们试图重获能生存的古生物材料，特别是广泛的古资源中的古代DNA。早期提取古代DNA的实验是用下述材料进行的古董的外皮，Higuchi et al.，Nature 312282-284(1984)，Thoms et al.，J.Mol.Evol.31101-112(1990)成为木乃伊的组织，Paabo，Nature 314644-645(1985)and Lawlor et al.，Nature 349785-788(1991)，骨骼，Hagelberg et al.，Nature342485(1989)；Hagelberg et al.，Nature Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.333399-407(1991)；Hanni et al.，Acad.Sci.Paris Ser.ii.310365-370(1990)；Hagelberg and Clegg，Proc.R.Soc.Lond.B.24445-50(1991)；Horai et al.，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.333409-417(1991)；Hummel and Herrman，Naturwissenschaften 78266-267(1991)，植物化石，Golenberg，Nature 344656-658(1990)，冷冻的毛茸茸的猛犸，Higuchi and Wilson，FederationProc.431557(1984)；Cherfas，Science 2531354-1356(1991)，以及古代种子，Rogers and Bendich，Plant Mol.Biol.569-76(1985)，Rollo et al.，Nature 335774(1988)。然而，这些重复的从埋葬在琥珀中的化石材料中分离能存活的古代DNA尝试遭到失败。
首例从琥珀化石中成功分离古代DNA的报道产生于1992年，该DNA片段是从灭绝的蜜蜂Proplebeia dominicana中分离的，它保存于25-40百万年的多米尼加琥珀中，Cano et al.，Med.Sci.Res.20249-251 and 619-622(1992)。保存在古代黎巴嫩琥珀中的120-135百万年象鼻虫的DNA最近被PCR扩增和测序，Cano et al.，Nature363536-538(1993)。这些报道表明琥珀能够在一定程度上保存古代遗传信息。
然而，尽管从琥珀及其它古代材料中成功回收古代DNA的报道，在科学界中存在大量的怀疑态度，即这些研究中测序的遗传物质是真正古代的还是归于现代的污染。(见Aneiewt DNA，Springer-Verlag at10，62-64，158-160，221-222)。其它科学家辨论指出由于DNA分子的遗传不稳定性，琥珀不可能完整地保持存活DNA上百万年。Lindhal，Nature362709-715(1993)。
尽管从不同来源，包括琥珀，提取古代DNA进行了大量工作，但重获保存在琥珀或相似的天然存在的树脂材料中的古代细菌及其它古生物材料的工作则进行得极少。这项工作的意义又被无说服力的结果而妨碍。例如，虽然细菌杆状体、真菌孢子体(Micrococcus electroni，Bacilluselectroni，Longibacillus electroni及Spirillum electroni)以及花粉在溶解早至1929年的琥珀于松节油中时观察到，Blunck，G.，Bacterienn-eischlusse imm Berstein，Centraalblatt fur Mineralogie，Geologieand Palaontoligie(ABt，B，nomII 554-5)(1929)，引自Poiner，G.O.，Life in Amber at 350，Stanford University Press，Stanford，CA(1992)，这些生物体归于现代的实验室污染。同前。
相似地，从古生代盐中分离存活的细菌的报道(Dombrosky.H.J.，Zentr.Bakteriol.Parasitenk.Abt.I.17883-90(1960)；Dombrosky.H.J.，Zentr.Bakteriol.Parasitenk.Abt.1，183173-179(1961))也是归于现代的细菌污染，因为圈闭在这种土壤沉积的古微生物群很可能通过地面水的渗入被年代较近的微生物污染。1983年在墨西哥琥珀中发现保存的完整细菌细胞，Poinar，同上。然而，无论是细胞的年龄还是真实性均未证实，并怀疑被现代细菌污染。因而每次从琥珀中回收存活细菌的尝试结果都无说服力。
在最近80年中，已经出现了对微生物及其副产品的集中商业开发，用于医学、工业、农业及生物补救。在此引入Harvey，ed.，Drugs FromNatural Products；Pharmaceuticals and Agrochemicals，EllisHorwood Ltd.，England(1993)作为参考。例如在1928年的通过从点青霉生产青霉素的工作，触发了对抗生素的大规模科学开发。同样，在二十世纪四十年代随着使用厌氧菌醋酪酸梭状芽胞杆菌产生丙酮，微生物处理的工业应用的强烈增加了，Demain and Solomon，“Industrialmicrobiology and the advent of genetic engineering”，ScientificAmerican at pp.3-11，W.H.Freeman and Co.San.Francisco(1981)。目前相对少的微生物种类被开发用于抗菌化合物的生产及其它用于医疗或工业处理的微生物副产品。例如，只有三组微生物(丝状真菌，非丝状细菌和丝状细菌，或放线菌)用于生产大部分抗菌化合物和工业微生物副产品。
微生物除能产生抗菌化合物外，还产生多种代谢已用于其它的药学用途，包括(但不限于)心血管及抗炎药，免疫调节剂，抗肿瘤化合物，中枢神经系统调节剂及酶抑制剂。见如Harwood，C.R.，BiotechnologyHandbooksBacillus at 294 et seq.，Plenum Press，New York(1989)。微生物代谢物还可用作合成化学和合理药物设计的台架分子，并广泛用作疫苗生产的基础。见Horrey，ed.，Drugs，Fron NaturalProducts；Pharmaceuticals and Agrochemicals，Ellis Horwood Ltd.，England(1993)。
微生物及微生物副产品中也用于多种工业加工，如酶和维生素的生产和发酵。例如枯草杆菌产生多种热稳定丝氨酸蛋白酶，被广泛用于洗涤剂，同前。不同种真菌，包括酵母菌属、曲霉菌属和念珠菌属被用于生产啤酒、果酒、米酒及其它食物，还有多种维生素。微生物副产品还用于化妆品、生物聚合物、表面活性剂、嘌呤核苷和酚杀菌剂。同前。
最近，由于对环境污染的关注增加，微生物及其副产品用于生物杀虫剂和生物补救。例如球果杆菌和苏云金杆菌商业用作生物杀虫剂以抵御多种植物及昆虫害虫。见Harwood at 309，同上。类似地，多种芽孢杆菌常规用于对有毒污染物的环境清除，同上，at 313；Debabov，“The Industrial Use of Bacilci”in the Molecular Biologyof The Bacilli，Vol.1(D.A.Dubnau，ed.)，Academic Press，NewYork(1982)at 331-370，在此引入作为参考。
此外，微生物及其副产品越来越多地用于诊断化验。如枯草杆菌用于检测链霉素、青霉素和新生霉素的化验。见ATCC Catalog at 34(1994)引用J.Bact.45408-409(1943)，J.Bact.49411(1945)，Appl.Microbiol.4307-310(1956)。
动物和人类健康、农业、工业及环境变化过程的形式改变需要寻找医药、诊断和工业应用的微生物副产品的新来源。例如，许多病原微生物对来自现代微生物的抗生素产生抗性Cooksey，R.C.，“Mechanismsof resistance to antimicrobial agents”，Manual of ClinicalMicrobiology at 1099，5th.Ed.，Am.Soc.for Microbilolgy(1991)。相似地，许多广泛使用的农业化肥已显示对植物群和动物群有毒并引起水资源污染。对传统抗菌化合物的不断增长的抗性、现代工业加工产生的新需求、开发化学杀虫剂和除草剂替代品的需要以及消除环境污染的需要为使用新微生物及其副产品创造了机会。对目前已知微生物副产品鉴定及存在的用途，理解性地归纳于Biotechnology，vol 1-8，H.J.Rehm and G.Reed，editors，Verlag Chemie(1986)，在此引入作为参考。
发明概述本发明涉及从能保存生物材料和生物体数百万年的原始材料中，重新获得古生物体和生物材料。本发明特别涉及从琥珀和类似的天然存在树脂中分离古微生物。这些古微生物包括但不限于细菌、真菌、原生动物、病毒和小藻类。此外，本发明指从琥珀和类似天然存在树脂中重新获得古微生物及生物物质，包括花粉、植物、不同种节肢动物和线虫。
本发明是基于特别令人惊奇的发现，即古微生物株在琥珀中变成化石大约25,000,000年后，能被重新获得并复活到生存状态。在本发明的一个特殊实例中(下面将全面描述)，在大约25-40百万年前的多米尼加琥珀中变成化石的四种古无刺蜜蜂Proplebeia dominicana的腹腔组织中，分离到十几株存活的古芽胞杆细菌。本发明用于重新获得古芽胞杆菌的琥珀样品经严格设计鉴定，提取及无菌培养条件消除现代微生物污染的可能性，进行多种对照及模拟提取以证实提取物中得到的存活微生物的古年代。
为了证明琥珀即得到的生物体的古年代，从无刺琥珀蜜蜂的现代后裔的腹腔中分离的现代芽孢杆菌，通过分类学、生物化学和遗传学分析与古芽胞杆菌分离物进行比较。古代和现代细菌分离物的16S rDNA部分用PCR扩增并测序。古代和现代芽胞杆菌的序列比较发现具有约93-95％的同源性。使用下面详述的“分子钟”分析，计算了几种古分离物的核苷酸替代率。基于这些计算，古生物体被确定大约5千万年，与从之分离的多米尼加琥珀(25-40百万年)的大至年龄一致。
结果由申请者分离并在此描述的芽胞杆菌无疑确实是重新获得的古生物体，它们已保持休眠25-40百万年了。
在本发明的另一特殊实例中，从年龄在250年至120百万年的多种硬树胶和琥珀中的许多种生物包涵体中分离到十多种不同的非芽胞杆菌古微生物。这些生物体包括(但不限于)放线菌、链霉链、青霉菌、酵母菌和假单胞菌。
这些古微生物依据其形态、生化和酶学分布类型描述，并期望具有一些农业、工业、环境和医药用途，包括但不限于各种商业上有用的药品、酶(如蛋白酶、淀粉酶等)及防腐剂，像生物杀虫剂的生产和在工业加工上的应用。此外，某些古微生物分泌抗菌物质，能抑制某些现代动物病原体如链球菌和葡萄球菌，以及某些农业病原体如carotovara欧文氏菌，因此用于抗生素的生产。古微生物，尤其是古芽胞杆菌还能用作重组DNA载体的宿主。古微生物及其分泌的物质也可用于环境清洁领域、开矿、诊断及食品生产。
相似地，古微生物及其副产品还具有工业上有用的应用。例如，现代微生物目前是工业上的重要制造者酵母菌株如酿酒酵母菌用于酒精饮料的酿造。这种酵母菌也能在土壤和沉积样品中发现。总见Demainand Solomon，Biology of Industrial Microorganisms，Benjamin/CummingsPublishing Company，(1985)。现在微生物还能用作生物杀虫剂，如园形芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌经常发现与昆虫有关。Mitscherlichand Martin，Microbial Survival in the Environment，Springer-Verlag(1984)。这些信息对鉴定琥珀或树脂中生物材料的来源是有用的，从琥珀或树脂中可能得到的具有潜在商业应用的古微生物。然而，由于这些古微生物在遗传学上不同于它们的现代相似物，因此人们期望古微生物能产生具有潜在新化学结构的不同副产品。
附图简述

图1，从具有25-40百万年的琥珀中变成化石的古代无刺蜜蜂腹部组织中提取的样品照片。
发明详述古代微生物保藏多样性可以从琥珀及相关的天然存在树脂重新获得的生物体包括但不限于细菌、真菌、原生动物、病毒、小藻类、花粉、植物(苔藓和地衣，蕨和较高等植物)、不同种节肢动物和线虫。本发明一方面涉及分离古微生物如细菌，特别是内生孢子形成细菌，包括但不限于芽胞杆菌属。
本发明的其它方面涉及分离古微生物，如细菌和真菌，包括但不限于放线菌属、链霉菌属、酵母菌属、曲霉菌属、青霉菌属、细球菌属、分节孢子杆菌属、棒状杆菌属和假单胞菌属。本发明其它方面涉及分离古微生物，包括但不限于生物体如细菌和真菌，它们能在极端条件下生长，包括但不限于pH和温度的极端范围。古微生物来源古生物体和生物材料可从不同地理位置、年龄从大约50年到120百万年的琥珀和相关的天然存在树脂中重新获得。生物体不仅可以从树脂基质本身重新获得，还可从多种埋在树脂中的包涵体，包括植物孢子、微生物孢子、土壤样品、水和气泡、微生物、真菌、原生动物、昆虫巢、昆虫排泄物、昆虫、植物材料如叶、枝条、树皮、根、花、草、蕨、豆、种子荚、花粉、线虫、节肢动物和贝壳。
真正的琥珀或类似的天然存在树脂可在世界的多个区域发现，包括缅甸、多米尼加共和国、波罗地海区域、加拿大、中国、哥伦比亚、苏门答腊、Chiapas、吕宋岛、罗马尼亚、西西里岛、阿拉斯加的北极海岸、美国东北部、Manitoba的雪松湖区、法国北部、黎巴嫩、以色列、约旦和东泰米儿(苏联的北极)。证实重获的古生物或生物材料的来源确实可靠是重要的。除了认真追踪和证实一种树脂样品的来源，样品的年代假如可能的话可通过检测发现化石所在地层来间接确定。变成化石的树脂保存地周围的化石年代，为变成化石的树脂年代提供建议。如在一个特殊的地质时期，某些形成壳的原生动物丰富，如果这种原生动物的化石与琥珀一同发现，则可以假定该琥珀在那个地质时期形成。其它鉴定、描绘和直接确定样品年代的方法包括X-射线衍射、核磁共振光谱、高温裂解气相色谱和红外光谱(总见Poinar，同前)。
涉及现代生物体已知产地的信息可用来鉴定直接应用古生物体的可能来源。
例如，不同微生物和昆虫之间当今关系的知识可以为鉴定重获古微生物的来源作指导。例如，蜜蜂和不同生物体好像利用共生微生物来保护它们自己免受病原体侵袭以及加工和保存食物。因而，基于目前对这些蜜蜂的共生微生物的知识，人们可以推断蜜蜂的祖先也用微生物共生来抵抗古蜜蜂病原体，并加工和保存食物。更特别地，热带无刺蜜蜂Melipnoa fasciata好像用孢子形成细菌在它们的巢中保存食物。从M.fasciate巢中贮存的食物里已分离出各种芽胞杆菌生物体，包括巨大芽胞杆菌、环状芽胞杆菌和蜂房芽孢杆菌，Gilliam et al.，Apidologie 2189-97(1990)。基于这些细菌的生化性质，作者认为那些细菌被蜜蜂用来保存和加工食物。已经报道了细菌和蜜蜂之间联系的其它实例。如短杆菌、巨大芽胞杆菌、凝固芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和枯草杆菌已经从蜜蜂Apis mellifera的不同器官分离到，Gilliam et al.，J.Invert.Pathol.31389-391(1978)。枯草杆菌和蜡样芽胞杆菌也已从唯一的蜜蜂Crawfordapsis Luctuosa中分离到，Gilliam et al.，Apideologie2199-105(1990)。
除了细菌，酵母似乎在加工蜜蜂收集的花粉中起作用，Gilliam etal.，Apidiologie 1053-53(1979)。一些从蜜蜂或蜂巢分离的细菌(如枯草杆菌)产生抗生素如枯草霉菌素，Besson et al.，J.Sntibiotics 291043-1049(1976)。因此，推测这种共生菌帮助蜜蜂保护自己不受病原体的侵袭，Gilliam et al.，Apidiologie 2199-105(1990)。在古蜜蜂里的古共生微生物可能扮演物相似的角色，好像这种微生物祖先产生某些物质，即使给予十分不同的古代存在的环境条件如温度、气体浓度和病原体群，也无准确的现代等同物存在。
相似地，产生抗生素的微生物如放线菌、链霉菌、青霉菌和头孢霉菌通常在土壤聚集处发现或与植物材料有关。同样，作为工业酶已知的生产者-微生物，如枯草杆菌，也在土壤聚集处发现。酵母菌株如用于酒精饮料酿造的酿酒酵母菌也在土壤和沉积样品中发现。总见Demainand Solomon，Biology of Industrial Microorganisms，Benjamin/CummingsPublishing Company，(1985)。目前用作生物杀虫剂的微生物如园形芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌常常发现与昆虫有关。Mitscherlich andMartin，Microbial Survival in the Environment，Springer-Verlag(1984)。再者，因为古微生物与它们现代的相似物遗传学上不同，人们期望古微生物能产生具有潜在新化学结构的不同副产品。分离和培养古微生物的方法直接从琥珀、一种相似的天然存在树脂或在这种琥珀或树脂中形成化石的有机体中分离微生物、生物体及其它生物材料的各种方法可用于实践本发明的一个方面，只要有适当的控制和污染保护措施。这种保护措施必须包括含有变成化石的生物材料或生物体的树脂样品的外表面进行消毒。
在本发明的优选实例中，一种琥珀样品的外表面如下消毒琥珀样品被(1)在一个确定皮重的称量船形皿中称重；(2)真空下浸于2％戊二醛缓冲液中，35℃ 12小时；(3)用无菌双蒸水(SDDW)洗3次，然后将润洗水在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)(BBL，Cockeysville，MD)上培养以判断消毒过程的有效程度；(4)再浸入10％漂白剂中37℃6小时；(5)用SDDW洗3次，然后将润洗水培养于TSA上以判断消毒过程的有效程度；(6)浸入70％乙醇，35℃2小时，及(7)暴露于火焰以蒸发乙醇。这种表面消毒的琥珀，取样培养在胰蛋白酶大豆培养基(TSB)中，以评价消毒过程。
其它消毒和/或去污染琥珀和/或其它天然存在树脂样品的方法，包括原生质浸蚀，超声、固定、溶剂、气体熏蒸，应用杀孢子剂和从样品中去掉树脂的外层。
化石材料样品然后用无菌装置，无菌技术并在无菌条件下提取。例如，琥珀可在液氮冷冻后粉碎，以暴露埋葬化石的特有组织。此外，有或没有可见生物材料、矿石或生物体化石的样品表面去污染后可在无菌条件下碾和/或研磨成粉末或半粉末材料。样品可用任一种方法研成粉末或半粉末，包括使用无菌砂、研钵或碾槌。较少破坏和较有针对性的分离方法可以提供样品保存和部分化石或其它包涵物移去以获得古微生物后的对照物的双重优点。这些方法可以包括，如使用能从化石或其它包涵物提取非常少的样品且不损坏整个样本的空洞微钻器。这些方法还可包括使用冷冻树脂样品的技术，导向激光，用无菌砂子将样品研成粉末，加热，用无菌粉碎压缩及化学处理。干燥化石的水合作用可能便于样品提取。
提取的样品然后可在不同条件下置于目前用于繁殖微生物的各种类型培养基中，以便在密封的无污染环境中获得存活的古微生物培养物。
借助于改变使古微生物产生存活培养物的条件，来针对分离一种特殊类型的微生物。例如，人们可以通过调节生长温度至极限值，来培养能在非常条件下生长的微生物，而淘汰其它不能在这种条件下存活的微生物。也出于选择的目的调节培养基成分。除了在此描述的方法，其它在此没有详细描述的消毒方法和生长条件对那些本领域的技术人员是显易的，也可周来维持适当的污染防护，以及分离和繁殖古微生物。
在本发明的一个实施方案中，通过粉碎这些树脂样品(“粉碎提取方法”)从消毒琥珀或相似的天然存在树脂样品中提取古微生物，然后培养提取的微生物。特别地，可遵循下列方法1.如上所述消毒树脂样品。
2.在安全柜中，将表面消毒的样品放入无菌研钵并用液氮淹没。
3.用无菌研槌压碎和研磨过分冷冻的琥珀，或通过将过分冷冻的琥珀经无菌粉碎压榨机粉碎。
4.将琥珀粉末等分到四个250ml含25ml下列无菌培养基的erlenneger三角瓶中(a)放线菌培养基(Difco)；(b)1％蛋白胨(2瓶)和(c)西红柿汁琼脂(Difco)。
5.将含1％蛋白胨的一个三角瓶于55℃，剩余三瓶于30℃在200RPM定轨摇床中保温。
6.第一周每天，后四周每星期，从每瓶中取500μl样品涂布下述培养基上(a)TSA；(b)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)；(c)Czapek琼脂(Difco)和0.4％酵母提取物；(d)平板计数琼脂(Difco)和2％无菌脱脂牛奶(SMA)；(e)SMA pH8.1；及(f)淀粉琼脂(Difco)。每个平皿置合适的温度保温(在55℃保温的平皿要放入内有湿润无菌纸中或海绵的无菌密封口袋中)。
7.每天检查平皿中存在的菌落。
8.挑出分开的菌落再分别在合适培养基上培养。冷冻(-80℃)平皿上每个克隆。进行革兰氏染色以评价每个分离菌落的形态和革兰氏染色特点。真菌和酵母菌在乳酚棉兰制片培养基湿中检查。
9.每平皿冷冻和冷冻干燥至少10个分离物。在这点上，应对每个分离物进行FAME(脂肪酸甲酯)分析以建立每个群体中遗传差异的等级。
在此方法中，样品可不用液氮研磨。
在第二种方法中，琥珀或类似的天然存在树脂消毒后“爆裂”提取古微生物(“爆裂提取方法”)然后培养这些微生物。特别地，可用下列方法1、如上所述消毒琥珀或相似的天然存在树脂。
2、在安全柜中，将带有目的包涵物的消毒样品放在无菌培养皿底部，并用液氮浸没。使液氮完全蒸发。将几滴热无菌生理盐水涂到超冷样品的外部。
3、用无菌27号针，弄裂样品碎片以暴露目的组织。
4、用无菌针头收集组织并转入二支含无菌1％胰蛋白胨培养基的1.5ml无菌微离心管中。
5、在80℃水浴热休克一支管15分钟，然后在一合适保温箱或干浴锅中将二管于30℃保温。
6、第一周每天，后四周每星期从每管取一环于下列培养基上(a)TSA；(b)PDA；(c)Czapek琼脂(Difco)含0.4％酵母提取物；(d)SMA；(e)SMA pH 8.1；及(f)淀粉琼脂(Difco)。每皿于30℃保温，每天检查各皿的克隆存在。
7、取分开的菌落，在合适培养基上培养。冷冻(-80℃)平皿上的每个菌落。进行革兰氏染色以评价每个分离菌落的形态和革兰氏染色特点。真菌和酵母菌在乳酚棉花兰铺底的培养基湿座中检查。
8、每皿冷冻和冷冻干燥至少10个分离菌落。在这点上，应对每个分离物进行FAME(脂肪酸甲酯)分析以建立每个群体中遗传差异的等级。
在第三种实施方案中，通过钻孔(“钻孔提取法”)从消毒的琥珀或其它天然存在树脂样品中提取古微生物或生物材料，然后按下述方法培养1、如上所述消毒琥珀。
2、在安全柜中，将带有目的的气体、水或液体包涵物的琥珀片置无菌培养皿中一滴快速凝结胶上。等到胶变硬再进行(约5分钟)。
3、用连在无菌钻压机的无菌0.5mm-1.0mm钛钻头，在小心刺穿气体、水或液泡的琥珀中钻一个孔。
4、用一个连在Drummond微型移液管的无菌微型移液管吸头从琥珀包涵物中收集气体、水或液体。再将气体、水或液体转入盛有无菌1％胰蛋白胨培养基的1.5ml无菌微离心管中。
5、在合适保温器或干燥浴锅中将管在25-30℃保温。
6、第一周每天，后四周每星期，从每管中取一环于下面的培养基上(a)TSA；(b)PDA；(c)Czapek琼脂(Difco)含0.4％酵母提取物；(d)SMA；(e)SMA pH 8.1；和(f)淀粉琼脂(Difco)。每皿在25-30℃保温，并每天检查皿中菌落的存在。
7、取分开的克隆并在合适培养基上培养。冷冻(-80℃)皿上每个克隆。进行革兰氏染色以评价每个分离菌落的形态和革兰氏染色特点。真菌和酵母菌在乳酚棉兰制片培养基湿中检查。
8、冷冻和冷冻干燥每皿至少10个分离菌落。在这一点上，应对每个分离物进行FAME(脂肪酸甲酯)分析以建立每个群体中遗传差异的等级。
在第四种实施方案中，通过钻孔(对生物体组织或昆虫化石，并在蛋白胨培养基中水合干燥的组织)(“钻孔提取法”)从消毒的变成化石的树脂中提取古微生物或生物材料，然后根据下列方法培养1、如上所述消毒琥珀。
2、在安全柜中，将带有目的包涵物的琥珀碎片置于无菌培养皿中一滴快速凝结胶上。等到胶变硬再进行(约5分钟)。
3、用连在无菌钻压机上0.5mm-1.0mm的无菌钛钻头，在小心刺穿包涵物的琥珀上打一孔。
4、用连在Drummond微型移液管上的无菌吸头，用50μl无菌1％胰蛋白胨培养基的1.5ml微离心管中。
5、将管在合适的保温器或干燥浴锅中于25-30℃保温。
6、第一周每天，后四周每星期从管中取一环于下面的培养基上(a)TSA；(b)PDA；(c)Czapek琼脂(Difco)含0.4％酵母提取物；(d)SMA；(e)SMA pH 8.1；和(f)淀粉琼脂(Difco)。每皿在25-30℃保温。
7、取分开的菌落在合适的培养基上培养。冷冻(-80℃)平皿上每个菌落。进行革兰氏染色以评价每个分离克隆的形态和革兰氏染色特点。真菌和酵母菌在乳酚棉兰制片培养基湿中培养。
8、每平皿冷冻或冷冻干燥每皿至少10个分离菌落。在这点上，应对每个分离物进行FAME(脂肪酸甲酯)分析以建立每个群体中遗传差异的等级。
在这些方法中的任何一个，TSA的三个平皿可加盖以检查环境污染物。这些平皿在整个提取过程中敞开。在操作步骤的最后再盖上培养皿盖，平皿在35℃保温二周。鉴定和表征古微生物鉴定和表征当今微生物的各种一般的和特殊的方法可用来鉴定和表征本发明的古微生物。在这点上，古微生物可进行形态学、生化、遗传学和生物学的评价。例如，一种古细菌可以经或不经放大进行肉眼检查，来评估各种形态特点。通常还评估染色亲合性、内生孢子特点，以及生长条件。生化特征，如那些典型地用于当今微生物分类，也可用来表征古微生物的特点。此外，还可测定古微生物广范围的各种当今微生物的特征酶的生产，以获得现代及古代微生物之间的关系或区别。再者，可使用本领域熟知的技术检测抗生素和/或其它生物活性物质的生产，不仅做为鉴定和表征该生物体的手段，而且为了鉴定该生物体产生的有用生物活性分子。
古生物体可进一步通过评价其遗传信息来表征其特征。一种遗传分析方法包含使用任何合适的DNA或RNA扩增技术来扩增古代核酸，如聚合酶链反应或连接酶链反应方法，使用从当今生物体基因序列设计的引物。可能与当今微生物的基因相关的古微生物基因进行克隆及测序以评价基因相关性及进化趋异，并测定其编码蛋白质的结构。或者，用本领域已知的随机引物扩增技术或序列独立引物扩增技术分离古微生物的遗传信息。此外，可用古微生物的培养物从序列分析中分离大量的基因组DNA。
在本发明的一个实施方案中，DNA从推断的古微生物分离物提取到，并用合适的引物扩增一个16S rDNA基因片段。PCR扩增在50μl总体积中进行，使用1部位低DNA Taq聚合酶(AmpliTaq-LD DNAploymerase，Perkin Elmer，Nornalk，CT)，2μg/ml牛血清白蛋白组份V(Sigma，St.Louis，MO)，每种引物0.5μm，2.0mM MgCl2和0.2μm三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)。所有反应混合物及样品稀释液置冰浴中，当加热器到80℃后，各管放入热循环中。聚合酶链反应使用热循环干浴，以适当的步骤进行(最好用合适的模板DNA和引物)。PCR产物克隆到合适的克隆载体中，然后用标准方法测序。确定古微生物的年代用上述PCR扩增技术可确定古微生物的年代。测序后，序列可人工或借助排列软件包进行排列，以评估序列。基于先前报道，16S rRNA基因的核苷酸替代速率r呈现出每年每个位置0.3-0.4×10-9替代，Ochman，H.& Wilson，A.C.J.Mol.Evol.2674-86(1987)；Moran，N.A.，Munson，M.A.，Baumann，P.，& Ishikawa，H.Proc.R.Soc.Lond.B.253167-171(1993)。两个分类群之间的趋异时间(从中分离假定古微生物的琥珀的年代)通过将假定古生物体和其最近的尚存亲属之间替代的数目除以2r乘分析的核苷酸数目而确定。两分类群间趋异时间应该大致与从中获得分离物的琥珀的年代相同。用古微生物生产有用的蛋白质古微生物可以产生酶生物和其它蛋白质，它们虽然与现代微生物生产的蛋白质相关，但在较高温度、不同大气条件和/或相对不同底物等情况下具有生物活性。例如，古蜜蜂用来加工和保存食物的古细菌在不同环境条件下旺盛生长，可能显示使产生或许工业上有用的新代时物的生化途径。因而，古微生物产生的祖先的酶可能具有独特的及工业有用的生化特征，如在较高温度或极端pH条件下最理想地发挥作用。
因而，本发明的一个实施方案涉及培养生产不同物质的古微生物，包括但不限于具有工业、农业、医药和诊断用途的蛋白质和酶。这些物质可从培养物中直接分离，并优选用目前用于分离纯化当今微生物中相似物质的各种技术进行纯化。或者，这些蛋白质和酶可以进行化学合成或用重组DNA技术生产。
在本发明的一个特殊实施方案中，从琥珀中25-40百万年的昆虫化石分离的古芽胞杆菌细菌可用于生产各种有用的蛋白质和酶，包括但不限于淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶和蛋白酶。此外，本发明的某种古芽胞杆菌可用来生产相对于其现代的后代具有可变、增强或宿主范围明显扩大特征的抗生素。一种古芽胞杆菌或其它微生物产生这种蛋白质的能力可用下面物描述的或其它已知并广泛使用的生化和酶学试验来测量，如Gordon et al.，The genus Bacillus USDA Handbook 427(1973)；API ZYM酶学特征试验，下述。芽胞杆菌属细菌产生的各种酶及其它产物的全面讨论，其鉴定试验、生产方法和各种工业和其它应用，见Harwood，C.R.，Biotechnology HandbooksBacillus，PlenumPress，New York(1989)，在此整个插入作为参考。
在本发明的一个实施方案中，一种命名为“BCA 5”的古芽胞杆菌，在其它化合物之间生产酸性磷酸酶，见表III。在本发明不同的实施方案中，古枯草杆菌样生物体生产碱性磷酸酶，丁酸酯酶，辛酸酯酶和/或β-半乳糖苷酶(见实施例3)，一种古园形芽胞杆菌样生物体生产辛酸酯酶和糜蛋白酶(见实施例3)，古蜡样芽胞杆菌样生物作生产碱性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶、亮氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、酸性磷酸酶和β-glucoronidase，以及古短小芽胞杆菌样生物体生产辛酸酯酶。
这些古代酶的当今相似物已广泛商品化应用，包括用于确定蛋白酶和淀粉酶活性试验，皮革软化，防止啤酒中形成蛋白混浊，减少面粉的谷朊含量，以及作为家庭洗涤剂的内容物。见如Harwood，C.R.，Biotechnology HandbooksBcaillus at 294 et seq.，Plnum Press，NewYork(1989)，在此插入作为参考。也见上面的讨论。虽然古微生物生产的酶与它们当今相似物不等同，但现代微生物生产的酶的商业应用提示了在商业背景的大量用途中，古微生物生产的酶的应用。例如，下面物讨论的一种枯草杆菌样微生物形式生产一种有活性而且稳定的碱生物性蛋白酶，见实施例3。来自古微生物的抗生素和抗菌剂古微生物可能已生产出有效抵抗各种古生物体的抗生素，这些古生物体再也不存在或在当今生物世界里较少流行或有效。现代微生物的进化好像伴随着某种特性的丢失，该特性使它们的祖先抵抗其古代微生物邻居的抗菌作用。最终，一些微生物可能已进化到不能防御其祖先能够容易抵抗的相同病原体，可能只因为很长一段时间内这种古病原体流行减少。在这点上，抗菌物质在古代一度对存活的是必需的，可能最后变得完全不必要或多余，因此时间和进化也许已致使现代微生物再也不产生这些活性物质。因而，古微生物的抗生素可能对治疗现代微生物感染非常有效，特别是那些由新出现和很快进化了抗生素抗性的病原株感染引起的。因此本发明给医学提供了一个及时回顾并检测那些千百万年前生长在早已灭绝的各种生命形式之中微生物的抗菌性质，这些微生物生活在一种与今天根本上和实质不同的环境中。
因而，本发明的另一实施方案涉及用古微生物生产抗生素。更特别地，证明了某些申请者分离的并在下面物更全面描述的某些古芽胞杆菌和放线菌对人的微生物病原体有效的抗菌活性。虽然证明许多古芽胞杆菌和放线菌对不同菌株的抗菌活性，总体上枯草杆菌样和地衣形芽胞杆菌样古芽胞杆菌似乎产生最强的抗菌活性。命名为“BCA1”的一种古芽胞杆菌被鉴定为一种枯草杆菌样细菌，能够完全抑制金黄色酿脓葡萄球菌和酿脓链球菌的生长。另外，BCA1还能抑制鸡瘟沙门氏菌、大肠杆菌、肿胀植物肥大病菌，Acinetobacter calcoaceticus，caratovora欧文氏菌、大丽紫轮枝孢菌和点青霉的生长。因而，BCA1产生一种非常有效的抗生素，它可望在治疗由各种病原微生物引起的感染有用。古芽胞杆菌BCA12、BCA13和BCA15，所有鉴定为地衣形芽胞杆菌样菌株的可能对产生来源于地衣形芽胞杆菌的当今的杆菌肽的分子祖先有用。
测定微生物的抗菌活性的方法已在本领域已知，并可很好地适用于本发明的古微生物。这些方法包括，如常规使用的交叉划线方法，Colome et al.，Laboratory Exercises In Microbiology，WestEducational Publ.，St.Paul，MN(1986)，以及Chatterjee等，J.Antibiotics 45(6)832-838。Colome et al.，和Chatterjee et al.，的文献在此一并插入作为参考。
其它有用的试剂，包括抗微生物、抗癌、抗炎、CNS、心血管和化疗药物也可由古微生物生产。Harvey，ed.，Drugs From NaturalProductsPharmaceuticals and Agrochemicals，Ellis Horwood Ltd.，England(1993)。古微生物的其它用途在本发明中的另一实施方案中，古微生物可用于昆虫的生物防治。例如，某些芽胞杆菌目前用于防治昆虫种群，如苏云金芽胞杆菌和日本甲虫芽胞杆菌，它们是今天使用的所有微生物控制剂中最成功的。此外，一些园形芽胞杆菌菌株好像对蚊幼虫是致病的，最近田间试验提示园形芽胞杆菌可能是一种有价值的化学杀虫剂替代物。在此描述的两种由申请者分离的古芽胞杆菌生物体，命名为“BCA Ex2”和“BCA16”，在各种形态学和生化特性的基础上，确定为园形芽胞杆菌样菌株。这些古代菌株对当今昆虫可能是致病的，因此可能是有用的生物杀虫剂。
古微生物特别是古芽胞杆菌，也可用做生产各种蛋白质的克隆和表达宿主。例如，枯草杆菌现在广泛用于重组DNA技术，而且具有能很快分泌高水平重组产物的优势。相似地，古微生物特别是古芽胞杆菌，也可用做诊断试验的试剂。例如，枯草杆菌广泛用于检测链霉素的诊断试验。
本发明的古微生物也具有工业应用。如从多米尼加琥珀分离的一种酵母菌发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖，产生CO2(气体)和乙醇(酒精)，并可用于发酵过程的任何一步。Demain and Solomor，Giology ofIndustrial Microorganisms，Benjamin/Cummings Publishing Company，1985)。古微生物还可用做生物杀虫剂。园形芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌目前被用作生物杀虫剂，推测它们的古代相似物具有相似的用途。Mitscherlich and Martin，Microbial Survival in the Environment，Springet-Verlag(1984)。
现代微生物代谢物也用作抗真菌化合物。例如，灰黄霉素，用于治疗各种真菌疾病，是由青霉菌产生。硝吡咯霉素，是一种由假单胞菌不同种产生的局部抗真菌试剂，也显示一些抗原生动物活性。拟素霉素也是一种局部抗真菌疗法，是真菌Paecilomyces variottii的产物。Siccanin，用于治疗皮肤的真菌疾病，来自一种裸麦草的寄生霉菌Helminthosporium siccans。见Biotechnology同上，Vol 4，248-486。
同样，微生物产生的现代抗菌化合物也用作动物饲料添加剂，治疗动物某些疾病，保护培养的植物免受细菌、真菌和病毒感染、寄生虫病以及竞争的草，治疗某些代谢失调物如糖尿病，子宫张力缺乏、偏头痛、直立循环障碍、衰老、高血压、血促性腺激素过高、肢端肥大症和，帕金森氏病、癌症、心血管疾病、血胆固醇过高、动脉硬化和冠状疾病。见Biotechnology，Vol 4 at 510-620，同前。已知微生物也产生多种维生素和辅酶(见Biotechnology，vol 4，at 115-159，同前)，还能从外界环境积累重金属和放射性核素(见Biotechnology，volume 66，at 402-403，同前)。相似地，微生物滤取金属的能力用于采矿和冶金工业。这些当今生物体副产品的已知用途提供了其相应古代祖先的副产品可相似使用的证据。
已经描述了本发明，下列实施例用以说明而非限制来解释有关本题的发明。
实施例实施例1古芽胞杆菌生物体的分离和表征样品来源用于提取化石组织的是结构完整的多米尼亚琥珀标本，它含有变成化石的无刺蜜蜂Problebeia dominicana，年代为25-40百万年。这些样品被严格鉴定，打开琥珀标本和提取化石组织的所有条件均为无菌，以消除被现代微生物污染的可能性。提取过程的所有步骤在一种IIa型层流罩中进行。此外，进行各种对照和模拟提取以证实从提取物中得到的存活微生物的古代状态。
琥珀消毒和研磨程序 琥珀标本经浸泡于2％戊二醛溶液并用无菌去离子水(SDW)洗3遍进行表面消毒。洗过的碎片然后泡在2％漂白溶液中5分钟，用SDW洗2次。琥珀泡在70％乙醇中30分钟并用火焰烧以完成消毒过程。灭菌的标本然后如下用液氮研磨。将琥珀标本置于无菌玻璃培养皿中并用液氮覆盖，然后让液氮蒸发。热的无菌生理盐水滴在琥珀碎片上，使琥珀沿平面裂开，暴露所述的变成化石的蜜蜂组织，Cano et al.，Med.Sci.Res.20249-251(1992)。
化石提取 使用一个带有无菌27号针头的无菌结核菌素注射器，从琥珀中吸出变成化石的蜜蜂组织(胸部和腹部)的少量样品。每个样品悬于每个含TSB的容器中，35℃保温2周使存在的所有细菌增殖。这个阶段后，从显示微生物生长的容器中再等分培养在固体培养基Trypticase大豆琼脂(TSA)上，使之可见并进一步分离特定的细菌菌落。
分离的古细菌的鉴定和描绘特征古细菌分离物的鉴定基本上通过形态学和生化特征的评价而进行，如Gordon et al.，The genusBacillus，Department of Agriculture Handbook 427 Washington，D.C.(1973)所述。所有的形态学和生化评价在一个层流罩中进行。古芽胞杆菌培养物的酶活性用能检测19种(API ZYM Methodology，API Analytab Products)的半定量系统来确定。BCA分离物的酶活特点与从ATCC获得的现存枯草杆菌的酶活相比。
所有古细菌贮存培养液贮存于安全物且封闭的地方，所有分离物样品被冷冻并贮存在-70℃的关紧的冷藏箱中。
抗菌活性分析使用交叉划线方法(Colome et al.，1986)测试古细菌抗各种对人和植物致病的细菌和真菌的抗菌活性。古细菌划线在Mueller Hinton琼脂上，35℃保温24-48小时。病原体以90°角交叉划线，细菌病原体的平皿在35℃保温，真菌病原体的平皿在室温保温。交叉划线后48小时最长2星期，检测交叉划线平皿的生长抑制。
对照和模拟提取 为了进一步确认分离的古细菌不是分离过程中偶然获得的现代污染物，进行几个对照实验和模拟提取。在所有提取过程中，“放哨”培养皿置于罩中检测罩里存在的细菌污染物，但没有发现。
消毒、研磨和化石提取过程使用的溶液及琥珀标本的外部及内部碎片样品，通过接种TSB并检查微生物生长来分析微生物污染。在任何溶液或琥珀碎片中没有检测到细菌和真菌。通过接种100μl溶液样品和琥珀标本内部的碎片于Chelex溶液中，并提取和用现存的芽胞杆菌特异的引物PCR扩增芽胞杆菌DNA以检验芽胞杆菌DNA存在。虽然溶液中和消毒的琥珀标品的表面检测到一些芽胞杆菌DNA，但琥珀内部采取的样品中没检到芽胞杆菌DNA。
另一个实验对先用活枯草杆菌预处理的琥珀标本进行去污染，来检验消毒方法是否有效。简要地说，无化石包涵体的琥珀标本浸于含内生孢子的枯草杆菌培养物中过夜。然后将琥珀标本如上所述及下面物举例说明的消毒，在许可条件下培养于TSB中，使任何污染菌生长。这个对照实验进行了十一次，每次都没检测到污染。因而，消毒方法对消除琥珀标本表面现代细菌污染物的可能是有效的。
进行模拟提取以评估提取过程中对样品可能的环境污染。一个无化石包体的琥珀标本如上所述进行表面消毒，并模拟以后描述的提取步骤。此外，溶液样品及琥珀的外部和内部被测试芽胞杆菌内生孢子的存在。进行两次模拟提取，无导致任何细菌生长。
结果通过将变成化石的Problebeia dominicana胸部和腹部组织样品接种到细菌生长培养基，产生几种古细菌培养物，这些组织是从以后描述的25-40百万年的消毒琥珀标本中提取的。已评估了这些分离物的形态和生化特性，表明所有古细菌是芽胞杆菌或芽胞杆菌样生物体。另外，还测定了酶活性质。而且平行估价了几种现代芽胞杆菌形态、生化特性以及酶活分布类型。然后比较了现代和古代芽胞杆菌的特点，以更特别地定义这些回收古芽胞杆菌的分类。
形态学和生化评价的结果分别见表I和表II。古细菌的酶学特点见表III，古代和现代/后代细菌的比较见表IV。
虽然古代细菌的酶特征在几个方面与现代芽胞杆菌的有关，但也观察到几点不同。例如，古代细菌似乎与现代芽胞杆菌相比，产生较多的碱性磷酸酶和亮氨酸氨基肽酶。现代枯草杆菌和蜡样芽胞杆菌产生α-葡糖苷酶，而在古代细菌中没有发现此活性。相比之下，古代地衣形芽胞杆菌样细菌产生α-葡糖苷酶，而现代地衣形芽胞杆菌则不能。再者，古地衣形芽胞杆菌样细菌似乎与现代该菌株相比产生更多的β-半乳糖苷酶。
基于这些观察，申请者通过参考表观最近物的现存芽胞杆菌后代，鉴定了不同种古细菌分离物。因此，下面的古细菌确定如表5所示。
表I

C＝中央的S＝接近末端的T＝末端的表II

表III

表III(续)

表IV

表IV(续I)

表IV(续II)

表VBCA 1枯草杆菌样BCA 2巨大芽胞杆菌样BCA 3枯草杆菌样BCA 5蜡样芽胞杆菌样BCA 7蜡样芽胞杆菌样BCA 8蜡样芽胞杆菌样BCA 12 地衣形芽胞杆菌样BCA 13 地衣形芽胞杆菌样BCA 15 地衣形芽胞杆菌样BCA Ex2 园形芽胞杆菌样BCA 16 园形芽胞杆菌样有趣地是，已知枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌，地衣形芽胞杆菌和园形芽胞杆菌都栖居于某些尚存的Hymenoptera蜜蜂的消化道。
用前述交叉划线法，古芽胞杆菌丝株还被确定产生抗菌化合物。任何明显的抑制量(即从古细菌划线至少2mm内没有生长)被记为“部分抑制”。试验进行2次，只有那些能重复抑制被试病原体生长的古细菌被评价为能完全或部分抑制。结果见表VI。表VI

实施例2琥珀种的去污染根据上述方法，十一片琥珀(无内涵物)表面消毒后分别放在枯草杆菌的内生孢子培养物Trypticase大豆琼脂(BBL，Cockeysville，MD)中。特别地，琥珀被(1)在预称重的船型称量皿中称重；(2)真空下浸于2％戊二醛缓冲液，35℃至少12小时；(3)用约250ml无菌双蒸水(SDDW)洗三遍，然后在TSB上培养润洗水，以评价消毒过程的有效性；(4)再浸泡在10％漂白剂中37℃6小时；(5)用SDDW洗3遍，并在TSB上培养润洗水，以评价消毒过程的有效性；(6)浸于35℃、70％乙醇两小时并(7)暴露于火焰以蒸发乙醇。
测定的内生孢子数(直接计数)为大约每ml TBS中1.6×107个内生孢子。进行消毒步骤前，琥珀浸于培养基中过夜。用表面消毒的琥珀接种到含10ml TSB试管中，35℃温育14天。二周的温育过程后，11个TSB试管中均未检测到细菌生长。实施例3从不同来源的琥珀中提取古微生物(研磨法)从德国琥珀中分离枯草杆菌样微生物。一种含有混土和昆虫碎片的德国琥珀(bitterfelder)标本(15-25百万年)表面消毒后，用上述消毒和研磨提取方法获得组织。在30℃培养四天后，TSA琼脂在表面上可见奶油色、粘液状菌落。该分离物编码为AG-14-BF-2。显微镜检呈革兰氏阳性杆菌，直径＜1.0μm，具有椭园形孢子。无膨胀的孢子囊。sp.芽胞杆菌是严格需氧的，过氧化氢酶阳性，伏-普二氏反应阳性，V-P肉汤的pH值＜6，水解酪蛋白、明胶和淀粉。该分离物被推定为类枯草杆菌。
API-ZYM分布类型如下碱性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(+/-)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、缬氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(-)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-岩藻糖苷酶(-)。
从华盛顿州Calmount琥珀中分离放线菌样微生物。一种含泥土颗粒的华盛顿州Calnount琥珀标本(38-54百万年)表面消毒后，用上述消毒及研磨提取法获得组织。30℃培养8天后，在含4％酵母提取液的Czapek琼脂平板表面可见带白色的粉末状菌落。该分离物编码为AG-16-WA-3。显微镜检显示为革兰氏阳性、分枝细丝和短杆状。该分离物为兼性厌氧微生物，并在淀粉-酪蛋白琼脂中生长良好，生长7天后产生直径1.0-2.5mm的干燥、粉状菌落。通过在pH调至8.1的SMA琼脂平板中对酪蛋白的消化确定该分离物产生碱性蛋白酶。该分离物推定为放线菌。
从中国琥珀中分离园形芽胞杆菌样微生物。一种含泥土颗粒的中国琥珀标本(40-53百万年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法获得组织。30℃培养5天后在TSA琼脂表面可见带白色的糊状菌落。该分离物编码为AG-17-CH-1。显微镜检显示为革兰氏阳性杆菌，直径＜1.0μm，具有圆形孢子和膨胀的孢子囊。sp.芽胞杆菌为兼性厌氧、过氧化氢酶阳性、伏-普二氏反应阴性，V-P肉汤的pH＞7，水解酪蛋白、明胶和淀粉。该分离物推测为类圆形芽胞杆菌。
API-ZYM分布类型如下碱性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(-)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、缬氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(+)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-岩藻糖苷酶(-)。
从多米尼加琥珀中分离aurescens分节孢子杆菌样微生物。含有绝种的Hymenaea protera豆的叶子和花的多米尼加琥珀标本(25-40百万年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法获得组织。30℃培养7天后在TSA琼脂表面可见黄色糊状菌落。该分离物编码为AMG7。显微镜下显示为革兰氏阳性、能动的多形杆菌，具有向杆菌-球菌循环的一定趋向。无菌丝产生，是严格的需氧微生物。该分离物推定为类aurescens分节孢子杆菌，这基于存在黄色色素及水解淀粉的能力。该微生物在交叉划线试验中抑制金生物黄色酿脓葡萄球菌和大肠杆菌的生长。
从黎巴嫩琥珀中分离枯草杆菌样微生物。含有泥土颗粒的黎巴嫩琥珀标本(120-135百万年)表面消毒后，用上述消毒和研磨提取法获得组织。30℃培养5天后，在TSA琼脂表面可见奶油色、粘液状菌落。该分离物编码为AG-14-LA-1。显微镜检显示为革兰氏阳性杆菌，直径＜1.0μm，具有椭园形孢子；无膨胀的孢子囊。sp.芽胞杆菌严格需氧，过氧化氢酶阳性，伏-普二氏反应阳性，V-P肉汤的pH＜6，水解酪蛋白、明胶和淀粉。该分离物推测为类枯草杆菌。此外，该微生物显示产生碱性蛋白酶，该酶在65℃稳定并在pH8.1具有活性。
API-ZYM分布类型如下碱性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(+)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、缬氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(-)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(+)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-岩藻糖苷酶(-)。
从波罗的海琥珀中分离链霉菌样微生物。含泥土颗粒和植物碎片的波罗的海琥珀标本(40百万年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法获得组织。30℃七天后，在含4％酵母提取物的Czapek琼脂平板表面可见带有气生菌丝的灰色、粉状菌落。该分离物编码为AG-11-BA-11。显微镜检显示存在革兰氏阳性、分枝细丝、具有产生成串孢子的孢子囊以及短杆菌。该分离物通过消化SMA琼脂平板中酪蛋白确定其产生一种蛋白酶。该分离物被推定为链霉菌。
从多米尼加琥珀中分离酵母菌样微生物。含有泥土颗粒和昆虫粪便的多米尼加琥珀标本(40百万年)表面消毒，并用相述消毒和研磨法收获组织。30℃培养7天后，在PDA琼脂表面可见白色、奶油状克隆。该分离物编码为AG-11-DM-6。显微镜检显示园形至椭园形、正在出芽的酵母细胞，直径在5.0～7.5μm。该生物体没有包入胶囊内，在Levine’s EMB琼脂(Difco)上没形成假菌丝，并发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖产生CO2(气体)和乙醇(酒精)。该分离物推定为酵母菌。
哥伦比亚硬树胶中的玫瑰色细球菌样微生物。含泥土颗粒和昆虫粪便的哥伦比亚硬树胶标本(大约2百万年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法获得组织。在30℃培养5天后，TSA琼脂表面可见红色、糊状克隆。该分离物编码为AG-11-CC-5。显微镜检显示革兰氏阳性，以成对、四个一组和不规则束排列的球菌。该分离物产生葡萄糖酸，但不是从甘油和水解淀粉而来。该分离物推定为类玫瑰色细球菌。
从波罗的海琥珀分离青霉样生物体。含泥土颗粒的波罗的海琥珀(Lithuanian)标本(40百万年)表面消毒，用上述消毒和研磨提取法收获组织。在30℃培养7天后，在PDA和Czapek琼脂表面可见具有黄色、膜反转、无弥散性色素的粉状、灰绿色菌落。该分离物编码为AG-11-BA-5。显微镜检乳酚棉兰(LPB)湿制片显示为hyline、有隔的菌丝，具有瓶梗分生孢子细胞的青霉。Phialoconidia成串，并具有光滑的或有刺毛的外壁。该分离物被推定为青霉。交叉划线试验显示存在金黄色酿脓葡萄球菌、酿脓链球菌和大肠杆菌的生长抑制物质。当生长在SMA上时菌落消化酪蛋白。
从非洲硬树脂中分离sp.放线菌样微生物。含有泥土颗粒和昆虫碎片的非洲硬树脂标本(大约5000年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法获得组织。30℃培养7天后，在含4％酵母提取物的Czapek琼脂平板上可见白色、粉状克隆。该分离编码为AG-11-AC-14。显微镜检显示存在革兰氏阳性、分枝细丝和短杆状。该分离物兼性厌氧，并在淀粉-酪蛋白琼脂中生长良好，培养7天后产生直径在1.5-2.5mm的白色、干燥粉状克隆。该分离物通过在SMA琼脂平板消化酪蛋白，确定产生蛋白酶。该分离物被推定为放线菌。
从缅甸琥珀分离嗜热棒状杆菌样微生物。含有泥土颗粒的缅甸琥珀标本(38-54百万年)如上表面消毒，并用上述研磨提取法获得组织。55℃培养7天后，在TSA平板表面可见黄色、糊状菌落。该分离物编码为AG-12-BM-2。显微镜检显示存在革兰氏阳性杆菌，成串、栅栏和围篱样形式排列。该分离物兼性厌氧，在淀粉-酪蛋白琼脂中生长良好。该分离物通过消化SMA琼脂平板的酪蛋白确定为产生蛋白酶。该分离物暂时确定为嗜热棒状杆菌。
从哥伦比亚硬树脂分离芽胞杆菌样微生物。含有泥土颗粒的哥伦比亚硬树胶标本(大约2百万年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法获得组织。55℃培养5天后，TSA琼脂表面可见奶油色、片状菌落。该分离物编码为AG-13-CC-33。显微镜检显示为革兰氏阳性杆菌，直径＞1.0μm，膨胀的孢子囊内具有椭园形孢子。sp.芽胞杆菌严格需氧，过氧化氢酶阳性，优-普二氏反应阳性，V-P肉汤的pH＜6，水解酪蛋白、明胶和淀粉。该分离物推定为芽胞杆菌。此外，此生物体显示产生一种碱性蛋白酶，它在65℃时稳定，并在pH8.1时有活性。
API-ZYM分布类型如下碱性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(+)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、缬氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(+)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(+)、β-岩藻糖苷酶(-)。
从日本琥珀中分离蛋白分解球菌样微生物。含有泥土颗粒的日本琥珀标本(大约80百万年)表面消毒，然后用上述消毒和研磨提取法获得组织。30℃培养5天后，在TSA琼脂表面可见白色粘液状菌落。该分离物编码为AG-19-JA-2。显微镜检显示为革兰氏阳性球菌，直径＞1.0μm，膨胀的孢子囊内有椭园形孢子。该芽胞杆菌兼性需氧，过氧化氢酶阳性，氧化酶及水解酪蛋白、明胶，但不能水解淀粉。该分离物暂时确定为革兰氏阳性蛋白水解球菌。
从华盛顿州琥珀分离链霉菌样微生物。含有泥土颗粒和植物碎片的华盛顿州琥珀标本(38-54百万年)如上述表面消毒，并用研磨提取法获得组织。30℃培养7天后，在含5％酵母提取物的Czapek琼脂平板表面可见具有气生菌丝的灰色粉状菌落。培养物具有链霉菌的特征霉味。该分离物编码为AG-15-WA-18。显微镜检可见存在革兰氏阳性、带有产生成串孢子的孢子囊的分枝细丝，及短杆。该分离物显示产生抗菌剂，抑制革兰氏阳性和阴性细菌，包括金黄色酿脓葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌。该分离物被推定为类链霉菌。
从黎巴嫩琥珀中分离分枝孢子菌样微生物。一种含泥土颗粒的黎巴嫩琥珀标本(120-135百万年)如上表面消毒后，也如上述研磨提取法获得组织。25℃培养10天后，Czapek琼脂表面可见粉状、橄榄黄褐色菌落，具有黑色膜反转，但无弥散色素。该分离物编码为AG-13-LA-5。乳酚棉兰(LPB)湿制片显微镜检可见从霉的，具有椭园、从霉的、连接的贫乏的分生孢子胚的有隔菌丝。从罩细胞见分枝是明显的。该分离物被推定为类分枝孢子菌。生长在SMA上时，菌落消化壳多糖，并吸收多种碳水化合物，包括葡萄糖和蔗糖。实施例4从不同来源的琥珀中提取古微生物(破裂法)从缅甸琥珀中分离芽胞杆菌样微生物。含有昆虫和花粉粒的缅甸琥珀标本(38-54百万年)表面消毒，用上述消毒和破裂提取法获得组织。30℃培养6天后在TSA琼脂表面可见奶油色、粘液状菌落。该分离物编码为AG-15-BM-1。显微镜检显示为革兰氏阳性杆菌，直径＞1.0μm，具有椭园形孢子，无膨胀的孢子囊。该sp.芽胞杆菌为兼性厌氧，耐酸，过氧化氢酶阳性，伏-普反应阳性，V-P肉汤的pH＜6，水解酪蛋白、明胶和淀粉，用柠檬酸作为唯一碳源。该分离物推定为灰蜡样芽胞杆菌。
API-ZYM分布类型如下碱性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(+)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(+)、缬氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(+)、酸性磷酸酶(+)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(+)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-岩藻糖苷酶(-)。
从加拿大琥珀中分离芽胞杆菌样微生物，含有昆虫部分的加拿大琥珀标本(68-75百万年)表面消毒，并用上述消毒和破裂提取法获得组织。30℃培养5天后，TSA琼脂表面可见奶油色、糊状菌落。该分离物编码为AG-18-CA-2。显微镜检显示为革兰氏阳性杆菌，直径大于1.0μm，膨胀的孢子囊中有椭园形孢子。该芽胞杆菌为兼性需氧，过氧化氢酶阳性，伏-普反应阴性，V-P肉汤的pH＜7，水解酪蛋白和明胶但不水解淀粉。该分离物被推定为芽胞杆菌。实施例5从不同来源的琥珀中提取古微生物(冲洗法)从多米尼加琥珀分离假单胞菌样微生物。含有小水滴(有些其中有泥土颗粒)的多米尼加琥珀标本(25-40百万年)表面消毒，并用上述消毒和冲洗提取法获得组织。30℃培养5天后，TSA琼脂表面可见黄色、潮湿、闪光的菌落。该分离物编码为AG-10-DA-1。显微镜检可见革兰氏阴性、能动的杆菌。该分离物为需氧、还原硝酸盐、过氧化氢酶阳性、氧化酶阳性、水解酪蛋白和明胶，但不水解淀粉。该分离物推定为假单胞菌。实施例6从不同来源琥珀中提取古微生物(钻孔法)从墨西哥琥珀中分离短小芽胞杆菌样生物体。含Plebeia silaceae包涵物的墨西哥琥珀标本(20-35百万年)表面消毒，用上述消毒和钻孔提取法获得组织。25℃培养4天后，在TSA琼脂表面可见浅黄色、奶油样菌落。该分离物编码为AG-12-MX-2。显微镜检显示革兰氏阳性杆菌，直径＜1.0μm，具有椭园形孢子，无膨胀孢子囊。该sp.芽胞杆菌严格需氧，过氧化氢酶阳性，伏-普反应阳性，V-P肉汤的pH＜6，水解酪蛋白和明胶但不水解淀粉。该分离物推定为类短小芽胞杆菌。
API-ZYM分布类型如下碱性磷酸酶(-)、丁酸酯酶(-)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、缬氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(-)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-岩藻糖苷酶(-)。实施例7通过核酸测序分析证实从被称作古分离物BCA16(确定为园形芽胞杆菌)提取的DNA用作模板，用一对引物BCF以(CGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT)(SEQID NO1)和BCR2(CTCCCCAGGCGGAGTGCTTAAT)(SEQ IDNO2)。这些引物是从环状芽胞杆菌(EenBank Accession NumberX60613)的16S rDNA序列中得到的，并扩增此基因的一个530碱基对区域。DNA通过硅胶悬浮抽提，见Gano and Poinar，Cano，R.J.&Poinar，H.N.，Biotechniques 158-11(1993)。PCR扩增中，5μl抽提的DNA用作PCR酶扩增的DNA来源。对称PCR扩增用2单位低DNAAmpliTaq DNA聚合酶(Perkim-Elmer，Norwalk，CT)，2μg/ml牛血清白蛋白，BCA341F和BCA871R引物各0.5μm，2.0mM MgCl2及0.2mM三磷酸脱氧核苷酸在50μl总体积中完成。所有反应混合物和样品稀释液在冰水浴中进行，当加热器达80℃后，将试管置于热循环器中。聚合酶链反应使用Temp-Tronic热循环干燥浴(Thermolyne，Dubuque，IA)完成。在第一轮循环中，DNA模板在95℃变性2分钟，然后引物退火步骤在58℃1分钟，然后延伸步骤为72℃1分钟。下面的30个循环由94℃1分钟变性步骤、58℃1分钟，1分钟引物退火步骤、72℃1分钟引物延伸步骤组成。最后一个循环由1分钟变性步骤、1分钟引物退火步骤和10分钟引物延伸步骤组成。每以扩增产物通过1.2％琼脂糖在Tris-醋酸-EDTA缓冲液中鉴定。扩增产物依制造商指导用TA克隆试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)进行克隆。克隆的质粒DNA用Sequenase II DNA Sequencing试剂盒(USB，Cleveland，OH)及α-指导进行测序。每个样品用SP6和T7测序引物，测序3个克隆。测序产物的电泳在6％测序胶(GEL-MIX 6Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中进行。用XAR X-光胶片(Kodak，Rochester，MN)将空气干燥的测序胶进行放射自显影。序列扫描入Sparc10工作站(Sun Microsystems，Mountain Uiew，CA)使用BioImageDNA分析软件(Millipore，Bedford，MA)进行分析。人工鉴定放射自显影以证实物计算机分析的序列。使用Genetic Date Environment(GDE 2.1)文本编辑将序列进行人工排序。
BCA16的16S DNA核苷酸序列，核苷酸替代速率r通过以下方式计算，即假定的古圆形芽胞杆菌和现存圆形芽胞杆菌间的替代数目除以分析的核苷酸位点数目。这个数，K，然后除以2T，其中T是两个序列的趋异次数，Li，Wen-Hsiung，& Dan Grauer，Fundanentals ofMolecular Evolution.Sinaner Asseciates，Inc.，Sunderland，Massachusetts(1991)。趋异次数(T)及琥珀碎片的年代可通过K/n2R算得，其中n是分析的核苷酸的数目(487)，r是每年每个位置0.3-0.4×10-9替代。BCA 16和现存园形芽胞杆菌间核苷酸替代数目为13。基于此K值，T为33.3×106-44.4×106年。由于多米尼加琥珀矿石的年代为25-40百万年，假定的古园形芽胞杆菌和现存的之间的核苷酸替代速率与琥珀的年代一致，因此结果证实BCA 16是多米尼加琥珀中园形芽胞杆菌的古分离物的主张。实施例8通过核苷酸序列分析证实分离物的古年代从被称作古分离物提取的DNA和16S rRNA基因或rbcL基因(光合生物)的一个片段用适当的引物进行扩增。用1单位低DNA Taq聚合酶(AmpliTaq-LD)DNA polynerase，Perkin Elmer，Norwalk，CT)，2.5g/ml牛血清白蛋白组分V(Sigma，St.Louio，MO)，每种引物0.5μm，2.0mM MgCl2和0.2mM三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)。在总体积50μl下进行PCR扩增。所有反应混合物和样品稀释液在冰水浴中制得，加热器达80℃后将试管置热循环器上。以适当的操作方法(最好用合适的模板DNA和引物)用热循环器干燥浴完成聚合酶链反应。PCR产物被克隆入合适的克隆载体然后用标准方法测序。人工或借助一套排序软件进行排序，及评估序列。16S rRNA基因的核苷酸替代速率r基于不同报道假定的为每年每位置0.3-0.4×10-9替代，Ochmen andWilson，J.Mol.Evol.2674-86(1987)；Moran，et al.，Proc.R.Soc.Lond.B.253167-171(1993)，各种植物的rbcL基因的r为1.9×10-9，Zurarski and Clegg，Zurawski and Clegg，Anuual ReviewPlant Physiology 38391-418(1987)。两分类群间的时间差异(假定的古微生物从中分离的琥珀的年代)用以下方法确定，即假定的古生物与其尚存的年代最近的亲缘关系之间的替代数目除以2r与分析的核苷酸数目的乘积。两分类群间差异的时间大致与从中获得分离物的琥珀的年代相同。
微生物保藏下列古细菌的培养物在1994年1月28日(“BCA培养物”)和1994年11月1日(“AG”培养物)于NRRL，Peoria，Illinois保藏，并排列如下登记号培养物类型 登记号BCA1 类枯草杆菌 B-21177BCA3 类枯草杆菌 B-21178BCA5 类蜡样芽胞杆菌 B-21179BCA7 类蜡样芽胞杆菌 B-21180BCA13 类地衣形芽胞杆菌B-21181BCA15 类地衣形芽胞杆菌B-21182BCA Ex2 类园形芽胞杆菌 B-21184BCA 16类园形芽胞杆菌 B-21183AG-10-DA-1类假单胞菌 B-21357AG-11-DM-6类酵母菌Y-21355AG-13-LA-5类枝孢菌21356AG-15-WA-19 类链霉菌21354AG-11-AC-14 类放线菌21353AG-11-BA-5类青霉菌21352本发明不限于已保藏的细菌培养物或已公开的实施方案的范围，它们只作为本发明一个方面的说明，并且任何作用上的等同物均在本发明范围内。实际上，本发明的各种改进，除了那些在此描述和所示的之外，对本领域的技术人员从前面所述是显而易见的。这些改进表达在后附权利要求范围之内。文中提及的所有专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。
序列表(1)一般数据(i)申请人Ambergene Corporation5214-F Diamond Heights BoulevardSan Francisco，Califorrnia 94131United States of America(ii)发明题目古生物体(iii)序列数目2(iv)联系地址(A)收信人Pennie & Edmonds(B)街道 1155 Avenue of the Americas(C)城市 New York(D)州New York(E)国家 United States of America(F)邮政编码10036(v)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC compatible(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Nersion #1.25(vi)当今申请数据(A)申请号PCT/US95/01073(B)注册号25,227(C)参考/摘要号8070-005(ix)电信资料(A)电话415-854-3660(B)电传415-854-3694(C)电报66141 PENNIE(2)SEQ ID NO1的数据(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸
(C)链型未知(D)拓扑学未知(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列说明SEQ ID NO1CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA T21(2)SEQ ID NO2的数据(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型未知(D)拓扑学未知(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列说明SEQ ID NO2CTCCCCAGGC GGAGTGCTTA AT 2权利要求
1.一种包含从天然存在树脂中得到的生物体的生物体培养物，该生物体培养物是通过消毒这种树脂，从所述树脂中提取生物体并培养所述提取的生物体而获得。
2.权利要求1的培养物，其中天然存在树脂选自琥珀和/或硬树脂。
3.权利要求2的培养物，其中天然存在树脂选自黎巴嫩琥珀、华盛顿州琥珀、墨西哥琥珀、加拿大琥珀、日本琥珀、波罗的海琥珀、德国琥珀、哥伦比亚硬树脂、缅甸琥珀、多米尼加琥珀、中国琥珀和/或非洲硬树脂。
4.权利要求1的培养物，其中天然存在的树脂经表面消毒。
5.权利要求1的培养物，其中用粉碎提取法从天然存在树脂中提取该生物体。
6.权利要求1的培养物，其中树脂在粉碎前用液氮处理。
7.权利要求1的培养物，其中树脂在粉碎前冷冻至约-20℃～-140℃。
8.权利要求7的培养物，其中该树脂冷冻至约-80℃。
9.权利要求1的培养物，其中通过破裂提取法从天然存在树脂中提取生物体。
10.权利要求1的培养物，其中通过钻孔提取法从天然存在树脂中提取生物体。
11.权利要求1的培养物，其中通过冲洗提取法从天然存在树脂中提取生物体。
12.权利要求1的培养物，其中该生物体包含在树脂中变成化石的昆虫材料中。
13.权利要求12的培养物，其中昆虫材料选自昆虫组织、昆虫排泄物和昆虫巢。
14.权利要求1的培养物，其中该生物体包含在树脂中变成化石的植物材料中。
15.权利要求14的培养物，其中植物材料选自根、叶、种子、桠枝、树皮、植物组织、孢子、花粉、花、草、蕨类植物和豆科植物。
16.权利要求1的培养物，其中该生物体包含在树脂中变成化石的泥土中。
17.权利要求1的培养物，其中该生物体包含在树脂中变成化石的水中。
18.权利要求1的培养物，其中产生培养物的生物体的年代通过核酸分析确定。
19.权利要求1的培养物，其中该生物体是一种微生物。
20.权利要求1的培养物，其中该生物体选自细菌、真菌、病毒、原生动物、小藻类(microalgae)、节肢动物和/或线虫。
21.一种从天然存在树脂中获得一种生物体培养物的方法，它包括下列步骤(a)消毒天然存在树脂；(b)从该天然存在树脂中提取所述生物体；及(c)培养所述提取生物体。
22.权利要求21的方法，其中天然存在的树脂选自琥珀和/或硬树脂。
23.权利要求21的方法，其中天然存在的树脂选自黎巴嫩琥珀、华盛顿州琥珀、墨西哥琥珀、加拿大琥珀、日本琥珀、波罗的海琥珀、德国琥珀、哥伦比亚硬树脂、缅甸琥珀、多米尼加琥珀、中国琥珀和/或非洲硬树脂。
24.权利要求21的方法，其中天然存在的树脂经表面消毒。
25.权利要求21的方法，其中通过粉碎提取法从天然存在树脂提取生物体。
26.权利要求25的方法，其中粉碎前树脂用液氮处理。
27.权利要求25的方法，其中粉碎前树脂冷冻至约-20℃～-140℃。
28.权利要求27的培养物，其中树脂冷冻至约-80℃。
29.权利要求21的方法，其中通过破裂提取法从天然存在树脂中提取生物体。
30.权利要求21的方法，其中通过钻孔提取法从天然存在树脂中提取生物体。
31.权利要求21的方法，其中通过冲洗提取法从天然存在树脂中提取生物体。
32.权利要求21的方法，其中该生物体包含在树脂中变成化石的昆虫材料中。
33.权利要求32的方法，其中昆虫材料选自昆虫组织、昆虫排泄物和昆虫巢。
34.权利要求21的方法，其中该生物体包含在树脂中变成化石的植物材料中。
35.权利要求34的方法，其中植物材料选自根、叶、种子、桠枝、树皮、植物组织、孢子、花粉、花、草、蕨类植物和豆科植物。
36.权利要求21的方法，其中该生物体包含在树脂中变成化石的泥土中。
37.权利要求21的方法，其中该生物体包含在树脂中变成化石的水中。
38.权利要求21的方法，其中通过核酸分析确定产生培养物的生物体的年代。
39.权利要求21的方法，其中该生物体选自细菌、真菌、病毒、原生动物、小藻类、节肢动物和/或线虫。
40.权利要求21的方法，其中该生物体是微生物。
41.一种包含从天然存在树脂中得到的植物细胞和孢子的植物细胞培养物，该培养物是通过将这种树脂消毒、从树脂中提取植物细胞及培养所提取的植物细胞而得到。
42.权利要求41的培养物，其中该植物细胞从天然存在树脂中变成化石的真菌菌丝体得到。
43.权利要求41的培养物，其中该植物细胞从天然存在树脂中变成化石的细菌或真菌孢子得到。
44.权利要求41的培养物，其中该植物细胞从天然存在树脂中变成化石的植物孢子得到。
45.权利要求41的培养物，其中该植物细胞从天然存在树脂中变成化石的原生动物孢囊或孢子中得到。
46.一种通过将树脂消毒、从树脂中提取植物细胞和培养所述提取的植物细胞获得包含来自天然存在树脂的植物细胞或孢子的植物细胞培养物的方法。
47.确定古代生物体年代的一种方法，包括下列步骤(a)从古微生物中提取核酸；(b)扩增编码核糖体核糖核酸的核酸序列；(c)克隆扩增的序列；(d)将克隆的核酸测序；(e)将克隆的核酸序列同最接近的现存微生物的核糖体核糖核酸序列进行排列；(f)确定古微生物核酸序列和现存生物体核糖体核糖核酸序列之间的核苷酸替代数目；(g)替代数目除以2(0.3-0.4×109)×比较的核苷酸数目。
48.权利要求47的方法，其中古生物体是一种微生物。
49.一种从天然存在树脂中分离的生物体的培养物。
50.权利要求49的培养物，其中该生物体选自细菌、真菌、病毒、植物、原生动物、小藻类、节肢动物和/或线虫。
51.权利要求49的培养物，其中该天然存在树脂是琥珀或硬树脂。
52.权利要求49的生物体的培养物，其中该生物体从树脂中变成化石的昆虫材料中分离到。
53.权利要求49的生物体的培养物，其中该生物体从树脂中变成化石的泥土中分离到。
54.根据权利要求49的一种生物体的培养物，其中该生物体从树脂中变成化石的植物材料中分离到。
55.根据权利要求49的一种生物体的培养物，其中该生物体从树脂中变成化石的水中分离到
56.权利要求47、48、49、50、51、52、53、54或55的培养物，其中该生物体是一种微生物。
57.由权利要求1、41或49的微生物产生的化疗剂。
58.权利要求57的化疗剂，其中该化疗剂具有抗菌活性。
59.权利要求57的化疗剂，其中该化疗剂具有抗微生物活性。
60.权利要求57的化疗剂，其中该化疗剂具有抗真菌活性。
61.权利要求57的化疗剂，其中该化疗剂具有抗癌活性。
62.权利要求57的化疗剂，其中该化疗剂具有抗原生动物活性。
63.权利要求57的化疗剂，其中该化疗剂具有抗炎活性。
64.权利要求57的化疗剂，其中该化疗剂是一种酶抑制剂。
65.权利要求57的化疗剂，其中该化疗剂是一种免疫调节剂。
66.一种由权利要求1、41或49的生物体产生的酶。
67.权利要求66的酶，其中该酶选自蛋白酶、淀粉酶、酯酶和磷酸酶。
68.由权利要求1、41或49的生物体产生的生物杀虫剂。
69.由权利要求1、41或49的生物体产生的生物除草剂。
70.由权利要求1、41或49的生物体产生的维生素。
71.权利要求1、41或49的生物体，其中该生物体可用于发酵过程。
72.一种将权利要求1、41或49的生物体用作重组载体的方法。
73.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21177的古芽胞杆菌BCA1菌株。
74.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21178的古芽胞杆菌BCA3菌株。
75.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21179的古芽胞杆菌BCA5菌株。
76.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21180的古芽胞杆菌BCA7菌株。
77.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21181的古芽胞杆菌BCA13菌株。
78.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21182的古芽胞杆菌BCA15菌株。
79.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21184的古芽胞杆菌BCAEx2菌株。
80.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21183的古芽胞杆菌BCA16菌株。
81.保藏于NRRL，且指定的登记号为B-21357的古假单胞菌AG-10-DA-1菌株。
82.保藏于NRRL，且指定的登记号为Y-21355的古酵母菌AG-AC-14菌株。
83.保藏于NRRL，且指定的登记号为21356的古放线菌AG-11-AC-14菌株。
84.保藏于NRRL，且指定的登记号为21354的古青霉菌AG-11-BA-5菌株。
85.保藏于NRRL，且指定的登记号为21353的古分枝孢菌AG-13-LA-5菌株。
86.保藏于NRRL，且指定的登记号为21352的古链霉菌AG-15-WA-19菌株。
87.权利要求73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或86的生物体的副产物。
全文摘要
在此描述存活的古代细菌，真菌和其它生物材料的重新获得，它们来自琥珀或相关树脂中变成化石的各种来源。几种古代菌株基于其形态学与生物化学特征和酶活性分布类型，已被分类例如与现代芽胞杆菌属的不同种相关。虽然古生物体的一些特征与其现代类似物密切相关，但是已观察到几点差别。此外，在此描述的几种古代生物体显示抵抗侵袭动物和植物的现代细菌及真菌病原体的有效抗微生物活性。展望了这些古代生物体多种用途，包括其在农业、工业加工、生物补救、诊断和疾病治疗方面的应用。
文档编号C12N1/00GK1145020SQ95192328
公开日1997年3月12日 申请日期1995年1月27日 优先权日1994年1月28日
发明者R·J·卡诺, M·K·波卢基 申请人:安伯基因公司