用于改性有毒性和/或有臭味化合物的方法

专利名称：用于改性有毒性和/或有臭味化合物的方法
技术领域：
本发明涉及用于改性尤其是在植物来源的材料中的不希望有的化合物的酶促方法。
背景技术：
种类繁多的植物含有被声称提供抵抗霉菌、细菌、昆虫和鸟类侵袭的天然保护的所谓抗营养因子(ANF)。熟知的抗营养因子包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂，凝集素、丹宁、皂苷和(配糖)生物碱。
在具有商业重要性的作物，如大豆、苜蓿和马铃薯中，由于这些化合物具有毒性且味苦，非蛋白抗营养因子如皂苷和配糖生物碱的存在产生了值得注意的问题。不幸的是，这些化合物还对热非常稳定，并且由于它们的疏水性而难于提取，例如，包括马铃薯和蕃茄的茄科已知含有几种类型的配糖生物碱。这些配糖生物碱通常以低水平存在于马铃薯中，但在发绿和受损伤的马铃薯中可积累至高水平。最高水平产生在块茎的皮中。
在淀粉中生产释放的马铃薯汁含有相当大量的水溶性有机化合物，其中25-30％为蛋白质。在相对富含赖氨酸的意义上来说，马铃薯的蛋白质具有非常好的氨基酸组成。因此，马铃薯蛋白可补偿在谷类中发现的相对低的赖氨酸水平。而且，由于它们的热胶凝和乳化性质，纯的未变性的马铃薯蛋白的功能性质令人感兴趣。不幸的是，由于存在大量可导致胃肠紊乱，甚至死亡的配糖生物碱的存在，严重局限了马铃薯蛋白的经济重要性。由配糖生物碱引起的苦味，较低水平的收敛剂意味着一个严重的缺陷。由于人类比动物看来对配糖生物碱的毒性更为敏感，因此，拥有一种选择性降低存在于马铃薯蛋白质制备物中的配糖生物碱水平的方法极为重要。
茄碱是用来描述存在于马铃薯中的配糖生物碱的常规术语。构成茄碱部分的主要化合物为α-茄碱的α-查茄碱。两种物质具有共同的甾族生物碱部分，所谓的糖苷配基，更具体地说，为茄啶，但它们在它们的糖部分不同。据报道，糖苷配基茄啶的毒性被认为小于糖苷(Nishie等(1971)，毒理学和实用药学1981-1992)。
为了从植物材料，例如马铃薯中除去配糖生物碱化合物，可设想一些提取步骤。这一方法中的严重的缺陷是配糖生物碱查茄碱和茄碱不溶于许多有机溶剂，并且实际上还不溶于水。已描述的酸提取法具有使蛋白质变性的缺点，以致使蛋白质的功能特性丧失。而且，酸提取法可能提高蛋白质制备物中的金属离子的水平，提取后配糖生物碱的残留量仍然可以是足够高的，足以产生臭味。
因此，需要开发一种用于从植物材料中除去或使毒性和/或有臭味的配糖生物碱化合物失活的方法，该方法产生足够低水平的所述配糖生物碱化合物。
在柑桔水果的加工中，已描述了用于使苦味糖苷失活的酶促方法。通过两种糖苷酶，α-鼠李糖苷酶和-β-葡糖苷酶的连续作用，可将柚皮苷这一苦味配糖类黄酮化合物转化为无味的柚苷配基(Askar和Bielig(1976)，食物15，155-159)。而且，在欧洲专利EPO332 281中指出从它们的糖苷前体(糖基化萜烯醇)产生香味化合物(在酒中)也需要几种酶的连续作用。因此，在上述酶促方法中，需要几种酶来用于顺序除去单体糖残基。
发明概述本发明公开了用于降解包含与配糖部分共价连接的糖苷配基部分的化合物的方法，该方法通过将所述化合物与能酶切所述糖苷配基与配糖部分之间的共价键的酶接触来完成。
优选地，该方法用于将毒性化合物除解为毒性较小的产物，或用于将有臭味化合物降解为臭味较小的产物。
优选地，该化合物为来源于植物的材料的一部分。来源于植物的材料优选来自于茄科，更优选来自于马铃薯。
化合物优选为配糖生物碱，更优选为α-查茄碱。本发明的方法适用于，例如在淀粉去除后，从马铃薯中回收蛋白质。
本发明还涉及可用于产生用来降解化合物的酶的核酸。发明详述因此，本发明首次提供了基本上纯的能酶切糖苷配基和糖苷之间的共价键的酶，即不特别需要其它的酶。迄今，仅发现两种或多种酶的混合物能酶切糖苷化合物。很显然这在生产和应用方面提供了很大的优点。例如，可在没有或基本上没有其它酶被诱导的条件下，通过能产生该酶的微生物来产生该酶。在生产过程的生产率以及所产生酶的比活方面，这都是有利的。根据本发明的一个具体实施方案，通过在用编码所述酶或其前体的DNA转化的宿主细胞中表达来产生本发明的酶，所述宿主细胞为例如动物细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌。可接着从细胞或从培养基中(如果被宿主细胞分泌)大量地并且基本上没有任何其它活性地回收本发明的酶。
本发明描述了一种改性存在于植物来源的材料中的有毒性和有臭味化合物的方法。该方法的特征在于它包括酶的使用。将植物来源的材料用酶处理，其中酶改性所述有毒性和/或有臭味的化合物，以这种方式降低了所述化合物的毒性和/或臭味。另外，酶改性的产物的性质被改变，这样方便了它们从植物来源的材料中的去除。
当经过本发明方法处理的植物来源的材料或包含植物来源的材料的产物不再具有通常的臭味并且进一步符合了相关产物中所述化合物的“最大耐受水平”的立法条例时，则达到了足够低水平的有毒性和/或有臭味化合物。
植物来源的材料包括来自植物或植物某部分的任何物质或产物，或植物或植物本身的某部分，其中所述植物或植物部分包含毒性和/或有臭味化合物。
包含毒性和/或有臭味化合物的植物来源的材料可来自任何植物，只要所述化合物存在于起始植物或植物某部分或所述化合物在植物或植物某部分的工业加工中形成。优选地，植物来源的材料来自于属于茄科的植物，更优选，它来自于马铃薯或蕃茄。
接受本发明方法的毒性和/或有臭味化合物的特征在于所述化合物在用酶处理时被改性，这样它们的有毒性和/或它们的臭味被降低。优选地，当酶促去糖基化时，所述毒性和/或有臭味化合物被改性。
同时，与糖苷相比，产生的去糖基化化合物的可溶性被降低，从而方便了完全除去所述去糖基化化合物。
糖基化的有毒性和/或有臭味化合物优选选自配糖生物碱、配糖类萜和配糖类固醇。更优选地，它们选自茄碱，最优选地，它们为α-茄碱和/或α-查茄碱。
优选地，本发明的方法用于来自马铃薯的包含配糖生物碱α-茄碱和α-查茄碱的植物材料。
可适用于本发明方法的酶为能水解存在于配糖生物碱、配糖类萜和/或配糖类固醇中的糖苷键的糖苷酶。
在本发明的方法中，配糖生物碱，配糖类萜和/或配糖类固醇的水解优选通过单一糖苷酶的作用来进行。糖苷酶通过除去全部糖的部分来而作用于糖苷前体。
这里定义的术语“酶”或“糖苷酶”指任何能获得相应酶活性的酶。用于本发明的方法中的酶可为任何来源的细菌、真菌、酵母、植物、动物或合成的。优选地，采用的酶来源于真菌，更优选它们来源于曲霉属，最优选来源于黑曲霉。
用于本发明方法中的酶可为复合酶制剂的一部分，所述复合酶制剂包含对于本发明的方法并非关键性的其它酶。
用于本发明方法中的酶可通过本领域技术人员熟知的分级分离技术，从所述复合酶制剂中纯化。由此纯化的酶可在随后面被详细表征。此外，纯化酶的获得能够使本领域技术人员得以分离相应的基因或cDNA。
本发明优选包括使用宿主微生物通过遗传工程产生的酶。可通过本领域技术人员已知的方法来改造微生物以产生可用于本发明方法的酶。由于优选单一种酶参与从芳香糖苷配基分离糖部分，需要制备(过量)表达仅仅一种所需酶的生产菌株。使用这些菌株导致费用降低和副反应减小。
本发明的方法可用于从植物获得产物的方法中，其中所述植物包含毒性和/或有臭味化合物，以降低所需产物中的所述毒性和/或有臭味化合物的水平。
由于糖苷配基显示较低的毒性和/或减少的臭味，和/或可被较容易地提取，因而本发明的方法用于处理例如马铃薯蛋白质的经济优势是显而易见的。
优选地，本发明的方法可用于从在淀粉颗粒分离后获得的马铃薯汁中回收富含蛋白质的产物。
实施例1α-查茄碱的糖苷配基-糖键的水解将α-查茄碱(从Sigma化学品公司获得)以1g/ml的浓度溶解在以100mmol/l乙酸钠pH5缓冲的D2O中。向该溶液中加入几种商业上可购得的酶制剂。
每毫升查茄碱溶液加入15μl液体酶制剂和2mg粉状酶制剂。37℃下，保温8小时。
通过600MHz1HNMR确定各种酶制剂对α-查茄碱的糖部分的影响。在以这种方法检测的多种酶制剂中，仅有两种制剂(即曲霉制剂AR2000TM和CytolasePCL5，两者可从Gist-brocades获得，Seclin-法国)显示出对糖-糖苷配基键非常有效的酶切。在与这两种酶制剂保温后，可检测到的仅有的还原糖共振来自末端葡萄糖部分。由于未能检测到鼠李糖的β-共振，推断全部以及完整的三糖已被这两种酶制剂切下。
为了证实这个实验的结果，将反应混合物的pH值调至pH10，接着用氘化氯仿萃取。萃取液的NMR谱显示出与纯的糖苷配基茄碱(从Sigma化学品公司获得)的图谱相同，这表明在酶促水解时，α-查茄碱已被酶切为茄碱和三糖。
这些数据说明酶制剂AR2000TM和CytolasePCL5含有能酶切葡萄糖和茄碱之间的β-1，3键的酶活性。这一发现进一步表明通过与所选酶保温可将存在于马铃著中的主要毒性配糖生物碱部分改性为相对毒性较小的糖苷配基。实施例2对α-查茄碱的乳化作用加入酶制剂AR 2000TM以及Emulsin进行进一步酶保温，其中Emulsin为来自杏核的已知的β-葡糖苷酶来源，可从Sigma化学品公司购得。实验条件与实施例1中描述的那些相同。
存在于杏核提取液Emulsin中的β-葡糖苷酶活性不能切下α-查茄碱的三糖部分。这一发现证实了AR 2000TM和Cyto lasePCL5中存在于参与α-查茄碱水解的特定种类的酶。实施例3从曲霉制剂AR 2000中纯化查茄碱酶将AR 2000(可从Gist-brocades购得，Seclin，法国)溶解在缓冲液A中(20％乙醇，25mM柠檬酸钠pH3.4)(800ml体积中40g)。离心除去不容物后，将上清上样至220×50mm阳离子交换柱(SSepharoseFast Flow，Pharmacia)；流速为5ml/分钟。将柱用缓冲液A洗涤，直至280nm处的吸收大约为零。将2400ml其中NaCl梯度为0-0.3M的缓冲液A上柱洗脱。收集不同大小的级分，测定280nm处的吸光度。
在80mM乙酸钠pH5.0中以80μgα-查茄碱(Sigma)作为底物用Kudou等(农业生物化学(1990)541341-1342)描述的方法的改进方法在37℃下100μg体积中分析不同级分中的查茄碱酶活性。30-90分钟后，用30μl氯仿萃取反应产物。在具有氯仿-甲醇-水(65∶35∶10，V/V底层)的溶剂系统和硅胶60F 254板(Merck)进行TLC分析。将20μl氯仿层上样至硅胶平板上。将纯的茄碱(Sigma)用作参照。
合并活性级分(700ml)。用缓冲液A将合并的级分的一半稀释5倍并上样至第二个S SepharoseFast Flow柱中(110×26mm，流速2ml/分)。将NaCl梯度为0-0.3M的300ml缓冲液A上柱洗脱，并收集级分。如上所述测定活性。
合并所有活性级分并浓缩至约8.5ml(Amicon YM10滤器)，上样至50mM乙酸钠pH5.0中的凝胶过滤柱上(SephacrylS300，Pharmacia)；550×50mm，流速为5ml/分。从2800nm处信号增强时收集级分。测定查茄碱酶活性，并将显示出最大活性的级分进一步浓缩至约1.5ml。将500μl这一溶液上样至50mM乙酸钠pH5.0中的阴离子交换柱中(Mono QHR Pharmacia；50×5mm，流速为1ml/分)。用NaCl梯度为0-0.3M的乙酸盐缓冲液上柱洗脱上并收集级分，每级分1ml。如上所述测定查茄碱酶活性。显示这种活性的级分在蛋白质主体之前被洗脱。实施例4存在于曲霉制剂AR 2000中的查茄碱酶的性质在SDS-PAGE中包含查茄碱酶活性的蛋白级分显示为单一条带。使用包含已知分子量蛋白质的蛋白质混合物，测得纯化的查茄碱酶的分子量为120kDa。
用EUROSEQUENCE(Groningen，荷兰)测定查茄碱酶的内部序列。
在与分析乙内酰苯硫脲(PTH)氨基酸的HPLC(型号120A ABI)相连的自动测序仪(型号477A，Applied Biosystems)上进行Edman降解。查茄碱酶具有下面的内部氨基酸序列(SEQ ID NO1)Gln-Leu-Gly-Ser-Leu-Tyr-Trp-Gln-Leu-Glu-Asp-Ile-(Trp)-Gln-Ala-Pro-Ser-Trp-Ala-Gly-(Ile)在存在茄碱和存在包含大豆皂苷的物质时，将查茄碱酶在如实施例1所述的条件下保温。未能检测到保温混合物的茄碱。这证明了纯化酶的底物特异性。
分别使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷和对硝基苯基-β--D-吡喃半乳糖苷作为底物，在纯化步骤中测定β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性。纯化的查茄碱酶未显示出β-葡糖苷酶活性或β-半乳糖苷酶活性。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Gist-Brocades B.V.
(B)街道Wateringseweg 1(C)城市Delft(D)州Zuid-Holland(E)国家荷兰(F)邮编NL-2611 XT(G)电话31.15.2799111(H)传真31.15.2793957(ii)发明题目用于改性有毒性和/或有臭味化合物的方法(iii)序列数目1(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(vi)优先申请数据(A)申请号EP 95201980.0(B)申请日1995年7月18日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(iv)反义无(v)片段类型内部(vi)初始来源(A)生物黑曲霉(ix)特点(A)名称/关键词肽(B)位置13(D)其它信息/注意＝“不确定”(ix)特点(A)名称/关键词肽(B)位置21(D)其它信息/注意＝“不确定”(xi)序列描述SEQ ID NO1Gln Leu Gly Ser Leu Tyr Trp Gln Leu Glu Asp Ile Trp Gln1 5 10Ala pro Ser Trp Ala Gly Ile15 20
权利要求
1.一种用于降解包含与配糖部分共价连接的糖苷配基部分的化合物的方法，该方法通过将所述化合物与能酶切所述糖苷配基和配糖部分之间的共价键的酶接触来进行。
2.根据权利要求1的方法，其中所述化合物为毒性化合物，并且所述糖苷配基毒性较小。
3.根据权利要求1的方法，其中所述化合物为有臭味化合物，并且所述糖苷配基部分臭味较小。
4.根据权利要求1-3的方法，其中所述化合物为植物来源的材料的一部分。
5.根据权利要求4的方法，其中所述植物来源的材料来自茄科。
6.根据权利要求5的方法，其中所述植物来源的材料来自马铃薯。
7.根据权利要求1-7的方法，其中所述化合物为配糖生物碱。
8.根据权利要求7的方法，其中所述化合物为α-查茄碱。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的降解为用于制备富含蛋白质产物的方法的一部分。
10.富含α-查茄碱酶活性的制剂。
11.具有α-查茄碱酶活性的基本上纯的多肽。
12.根据权利要求11的基本上纯的多肽，包含相当于SEQ ID NO1的内部氨基酸序列。
13.编码根据权利要求11或12的多肽的分离的核酸。
14.包含根据权利要求13的核酸的重组核酸。
15.包含根据权利要求14的重组核酸的宿主细胞。
16.能酶切化合物的糖苷配基和配糖部分之间的共价键的酶在降解配糖生物碱、配糖类萜或配糖类固醇中的应用。
17.根据权利要求16的酶的应用，其中所述酶能酶切α-查茄碱。
18.酶在降解配糖生物碱中的应用。
全文摘要
本发明描述了一种在用单一种酶水解时将有毒性和/或有臭味化合物改性的方法。改性导致所述化合物的毒性和/或臭味降低。毒性和/或有臭味化合物优选来自茄属,为糖苷。该酶在糖苷配基和配糖部分之间的共价键处酶切所述化合物。较优选该酶具有α－查茄碱酶活性,降解α－查茄碱,释放茄碱糖苷配基和三糖,并且来自黑曲霉。本发明的酶促水解可用于,例如在分离淀粉颗粒后,从马铃薯汁中回收蛋白质。
文档编号C12P17/18GK1191571SQ96195673
公开日1998年8月26日 申请日期1996年7月18日 优先权日1995年7月18日
发明者L·伊登司, J·苏彼, D·施比, H·M·楠 申请人:吉斯特·布罗卡迪斯股份有限公司