专利名称：尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的基因序列的制作方法
技术领域：
本发明属于蛇毒蛋白领域，特别是关于尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的基因序列。
尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus，俗称五步蛇)蛇毒类凝血酶(Thrombin-like enzyme)具有和血浆凝血酶相类似的作用，它能直接使血液中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，并产生凝结，纤维蛋白原是分子量为340,000的蛋白质，是由三条分别称之为Aα、Bβ及γ的多肽链组成的，在纤维蛋白原分子中这三条多肽链又以二硫键相连接形成了二聚体的形式。纤维蛋白原在凝血酶的作用下，分别将两条Aα链上的纤维蛋白A肽及Bβ链上的纤维蛋白B肽切下来，切除了A肽及B肽之后剩下的α、β及γ链称之为纤维蛋白单体，它们会通过氢键自动地头尾相聚形成纤维蛋白聚合体。此外，由于凝血酶还能够激活凝血因子XIII，即血浆纤维蛋白联结酶，激活了的凝血因子XIII(XIIIa)可使纤维蛋白分子上的谷氨酰胺的酰胺和赖氨酸上的∈-氨基构成肽键，从而又使纤维蛋白分子侧向交联聚集，形成不溶性的交联纤维蛋白聚合体。
蛇毒类凝血酶同样能使纤维蛋白原分子上A肽及B肽切下来，所形成的纤维蛋白单体也能头尾相聚，但由于类凝血酶不能激活凝血因子XIII，因此不能使纤维蛋白分子侧向交联聚集，这样所形成的纤维蛋白聚合体不牢固，不仅容易被血流冲散，而且对血浆中的纤溶酶(Plasmin)非常敏感，很容易在纤溶酶的作用下被分解。人们正是利用蛇毒类凝血酶有别于血浆凝血酶的这一特性，将其应用于临床治疗血栓性疾病，其作用机理主要表现在两个方面首先是处于高凝状态下的病人血液中的纤维蛋白原在蛇毒类凝血酶作用下被降解，纤维蛋白原的含量大大降低，呈良性脱纤维蛋白原状态，而且由此所形成的纤维蛋白聚合体很容易被体内纤溶酶所降解，以及被血流冲散，使病人不容易再形成血栓，因而具有抗凝的作用。正由于血液中纤维蛋白原含量大大减少，受生物调控影响又反馈性地促使血管内皮细胞释放tPA，即组织纤溶酶原激活剂，tPA又去激活血浆中的纤溶酶原(Plasminogen)成纤溶酶，后者可以使纤维蛋白降解或使血栓溶解，从而起到溶栓的作用。所以，类凝血酶在临床上的直接作用是抗凝，它的续发作用是溶栓。
国外对蛇毒类凝血酶开展了系统深入的研究，并将类凝血酶应用于临床治疗血栓性疾病。Ancrod是红口蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒类凝血酶的商品名称，首先是由Ewart(Biochem.J.1970，118，585-593)等人纯化得到，Latallo(Thromb.Haemostasis 1985，50，604-609)则对其临床应用作了大量研究。Batroxobin是南美矛头蝮(Bothrops atrox)蛇毒中的类凝血酶，Hollemand等人对其酶学及生理特性开展了详尽研究(J.Biol.Chem.1976，251，1663-1669)，由日本及瑞典开发成临床用药并已广泛应用。它们的基因序列已经公开发表，但基因工程产品还没有开发研制出来。
目前国内临床上所使用的类凝血酶均为从尖吻蝮蛇、江浙蝮蛇及白眉蝮蛇的蛇毒中提取的，经过多年的临床实践，发现尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶有最好的疗效。然而蛇毒资源是非常有限的，如果通过基因工程来获得产品，则是一个很有前途的途径。为了今后基因工程产品的开发，对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶进行基因序列测定是一项有意义的研究课题。
为此，本发明目的是通过测定尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶N端的一段氨基酸序列，设计合成上下游引物，用PCR法扩增和克隆，对所克隆的类凝血酶基因进行测定得到基因序列。
本发明从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化得到类凝血酶，测定它的N端一段氨基酸序列，根据这段序列及其它蛇种类凝血酶在结构上的同源性，设计并合成上下游寡核苷酸引物。然后从尖吻蝮蛇毒腺中分离有关的mRNA作为模板，经反转录获得cDNA，用PCR法扩增和克隆了类凝血酶的全基因，分析测定基因的全序列。
1、总RNA提取切下蛇头，立即取出毒腺，于干冰中速冻，置于-70℃备用。采用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(参阅Chomczynski P.et al.AnalyticalBiochemistry.1987，162156)抽提毒腺总RNA。
2、引物设计依据，引物合成的方法根据测定的类凝血酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，结构为VIGGVECDINEHRFL，设计了简并的上游寡核苷酸引物，即5’CTTCTAGAATGGTCATTGGAGGTGA(T)TGAG(A)TG 3’，并在成熟蛋白的N端加上启始密码子---ATG和XbaI位点，以利于该基因的表达研究及操作；根据其它蛇种类凝血酶结构上的同源性(Itoh N.，et al 1987，The Journalof Biology Chemistry 2623132；Au L.C.，et al 1993，Biochem.J.，294387)，在3’非编码区的保守区段设计了简并的下游寡核苷酸引物，即5’TTTCTCCTCTTG(A)AG(C)TA(T)TTTCAAA3’。引物在Bechman公司生产的Bechman oligo 1000引物合成仪上合成，引物见图2。
3、反转录、PCR扩增和基因克隆以尖吻蝮蛇毒腺总RNA为模板，下游引物为引物作反转录。反转录试剂盒购自Gibco BRL公司，操作按其说明书进行。从前步所得cDNA为模板，以合成的上下游引物进行PCR扩增。PCR扩增出一条700bp的DNA片段，见图3琼脂糖凝胶电泳图谱。扩增出的DNA片段由XbaI充分酶解，插入噬菌粒载体pBlueScript-SK(质粒载体购自Stratagene公司)的XbaI和EcoRV酶切位点间，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得10个阳性克隆。
4、尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因鉴定本发明对两个阳性克隆T3基因和T2基因突变体进行全序列测定，其中的大部分序列为双向测序确定。T3和T2突变体的核苷酸和氨基酸全序列见图1。T3cDNA阅读框架编码699个核苷酸，即233个氨基酸，该蛋白与来源于铜头蝮(Agkistrodon contortrix)、巨蝮(Lahcesis mutus)等蛇种的类凝血酶同源性在70-80％之间，见图4。而且，与已测定的五步蛇蛇毒类凝血酶N端15个氨基酸相比，由cDNA推导出的相应氨基酸序列与之基本吻合，这说明了T3cDNA编码一个新的未见报道的类凝血酶基因。T2和T3显著的差别在于656位碱基在T2中变为A，形成一个终止密码子TAG，因而T2的阅读框架至此终止。故T2cDNA编码651个核苷酸，即217个氨基酸。T2和T3cDNA编码的蛋白质序列几乎完全相同，仅T2编码蛋白质的C端少了16个氨基酸，此外，T2编码的蛋白质第五位是Val、而T3为Asp，为类凝血酶的一个突变体。
利用上述合成的上下游引物，经PCR扩增和克隆，获得10个阳性克隆，对其中的两个阳性克隆进行基因测序，得到了一种编码为尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的基因序列和一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因突变体序列。对于那些未被测定序列的其它8个阳性克隆，其中也可能会出现新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因突变体，而对已测定序列的两个阳性克隆进行基因修饰，亦会得到尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶人工定点突变体及尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶可杂交的基因。
本发明优点尖吻蝮蛇是我国特有的蛇种，其类凝血酶的活力及疗效远优于江浙蝮蛇及白眉蝮蛇中的类凝血酶，然而蛇毒资源有限，本发明克隆得到类凝血酶基因并测定其基因序列，为今后开发研制基因工程产品创造了良好的条件。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述
图1尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的核苷酸和氨基酸序列。aT3类凝血酶的核苷酸序列；bT3类凝血酶的氨基酸序列；cT2类凝血酶基因突变体的核苷酸序列；dT2类凝血酶基因突变体的氨基酸序列。
图2合成的寡核苷酸上游引物和下游引物图3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳4几种蛇毒来源的类凝血酶氨基酸序列的比较实施例11、总RNA提取切下蛇头，立即取出毒腺，于干冰中速冻，置于-70℃备用。取出100mg毒腺组织，加1ml溶液D(含4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0；5％十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)，0.1Mβ-巯基乙醇)，在组织匀浆器中充分匀浆后，将匀浆液转入10ml离心管中，再加入0.1ml 2M的乙酸钠(pH4)，1ml的水饱和酚和0.2ml的氯仿∶异戊醇(49∶1)混合物，充分振荡混匀后，在冰上静置15min。样品在日立冷冻离心机(Hitach Centrifuge20PR-52D)以10000g于4℃离心20min，吸取上层水相，与等体积异丙醇混匀，置-20℃冷冻至少1小时。以10000g离心20min收集沉淀并溶于0.3ml溶液D，加入0.03ml 2M乙酸钠和0.3ml异丙醇，混匀，置于-20℃冷冻1小时。以10000g离心20min收集沉淀再溶于0.3ml焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过的H2O，加入0.03ml乙酸钠和0.75ml乙醇，混匀，置于-20℃冷冻1小时，以10000g离心20min收集沉淀，用75％洗涤RNA沉淀，自然干燥后将RNA溶于DEPC处理过的水中，分装，置于-70℃备用。
2、引物设计依据，引物合成的方法本发明根据测定的类凝血酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，结构为VIGGVECDINEHRFL，设计简并的上游寡核苷酸引物为5’CTTCTAGAATGGTCATTGGAGGTGA(T)TGAG(A)TG 3’，并在成熟蛋白的N端加上启始密码子---ATG和XbaI位点，以利于该基因的表达研究及操作。根据其它蛇种类凝血酶结构上的同源性(Itoh N.，et al 1987，The Journal ofBiology Chemistry 2623132；Au L.C.，et al 1993，Biochem.J.，294387)，在3’非编码区的保守区段设计简并的下游引物5’TTTCTCCTCTTG(A)AG(C)TA(T)TTTCAAA3’。引物在Bechman公司生产的Bechman Oligo 1000引物合成仪上合成，设计的上游及下游寡核苷酸引物见图2。
3、反转录、PCR扩增和基因克隆以尖吻蝮蛇毒腺总RNA为模板，上述的下游引物为引物作反转录。反转录试剂盒购自Gibco BRL公司，操作按其说明书进行。
从前步所得cDNA为模板，以上述的上下游引物进行PCR扩增。反应的总体积为50ul，其中MgCl2的终浓度为1.5mM，dNTP的终浓度为0.15mM，加入5ul 10×PCR缓冲液和1-2个单位的Taq DNA聚合酶(购自祥龙公司).。反应条件为93℃变性10min，48℃退火1min，72℃延伸2min，进行5个循环，然后93℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，再进行30个循环，最后72℃保温10min。取5ul反应产物经1％琼脂糖电泳检查。PCR扩增出一条700bp的DNA片段，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图见图3。产物用氯仿抽提，乙醇沉淀，溶解于15ul水中备用。
扩增出的DNA片段由XbaI充分酶解，插入噬菌粒载体pBlueScript-SK(购自Stratagene公司)的XbaI和EcoRV酶切位点间，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得10个阳性克隆。
实施例2尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因鉴定本发明对两个阳性克隆T3和T2进行全序列测定，其中的大部分序列为双向测定。[d-35S]dATP购自Amersham公司，测序试剂盒购自U.S.B.公司，具体操作参照说明书，T3基因和T2突变体的核苷酸和氨基酸全序列见图1。T3cDNA阅读框架编码699个核苷酸，即233个氨基酸，该蛋白与来源于铜头蝮(Agkistrodon contortrix)、巨蝮(Lahcesis mutus)等蛇种的类凝血酶同源性在70-80％之间，见图4，催化残基His41，Asp86和Ser179及Cys(第7，26，42，74，118，139，150，164，175，185，200和231位)的位置非常保守；而且，与已测定的五步蛇蛇毒类凝血酶N端15个氨基酸相比，由cDNA推导出的相应氨基酸序列与之基本吻合，这均说明了T3cDNA编码一个新的未见报道的类凝血酶基因。
T2和T3显著的差别在于656位碱基在T2中变为A，形成一个终止密码子TAG，因而T2的阅读框架至此终止。故T2cDNA编码651个核苷酸，即217个氨基酸。T2和T3cDNA编码的蛋白质序列几乎完全相同，仅T2编码蛋白质的C端少了16个氨基酸，此外，T2编码的蛋白质第五位是Val、而T3为Asp，为类凝血酶的一个突变体。
权利要求
1.一种编码为尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的核苷酸序列，其特征在于它具有如下的DNA核苷酸及相应的氨基酸序列ATGGTCATTGGAGGTGATGAGTGTGACATAAATGAACATCGTTTCCTTGTAGCCTTCTTT 60M V I G G D E C D I N E H R F L V A F FAACACTACTGGATTTTTCTGTGGTGGGACTTTGATCAACCCGGAATGGGTGGTCACTGCT120N T T G F F C G G T L I N P E W V V T AGCACACTGCGACAGTACAAATTTCCAGATGCAGCTTGGTGTGCATAGCAAAAAGGTACTA180A H C D S T N F Q M Q L G V H S K K V LAATGAGGATGAGCAGACAAGAAACCCAAAGGAGAAGTTCATTTGTCCCAATAAGAACAAC240N E D E Q T R N P K E K F I C P N K N NAATGAAGTACTGGACAAGGACATCATGTTGATCAAGCTGGACAAACCTATTAGCAACAGT300N E V L D K D I M L I K L D K P I S N SAAACACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAGCCCTCCCAGTGTGGGCTCAGTTTGCCGT360K H I A P L S L P S S P P S V G S V C RATTATGGGATGGGGATCAATCACACCTGTTAAAGAGACTTTTCCCGATGTCCCTTATTGT420I M G W G S I T P V K E T F P D V P Y CGCTAACATTAACCTACTTGATCATGCAGTGTGTCAAACAGGTTATCCAAGTTGCTGGCGG480A N I N L L D H A V C Q T G Y P S C W RAATACAACATTGTGTGCAGGTTTCCTGGAAGGAGGCAAAGATACATGTGGGGGTGACTCT540N T T L C A G F L E G G K D T C G G D SGGGGGGCCCCTCATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTGTATCTTATGGGGCGCATTCT600G G P L I C N G Q F Q G I V S Y G A H STGTGGCCAAGGTCCTAAGCCTGGTATCTACACCAATGTCTTCGATTATACTGACTGGATC660C G Q G P K P G I Y T N V F D Y T D W ICAGAGAAATATTGCAGGAAATACAGATGCAACTTGCCCCCCGTGA 705Q R N I A G N T D A T C P P ---
2.如权利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的核苷酸序列，其特征在于它的基因突变体的DNA核苷酸及相应的氨基酸序列如下ATGGTCATTGGAGGTGTTGAATGTGACATAAATGAACATCGTTTCCTTGTAGCCTTCTTT 60M V I G G V E C D I N E H R F L V A F FAACACTACTGGATTTTTCTGTGGTGGGACTTTGATCAACCCGGAATGGGTGGTCACTGCT 120N T T G F F C G G T L I N P E W V V T AGCACACTGCGACAGTACAAATTTCCAGATGCAGCTTGGTGTGCATAGCAAAAAGGTACTA 180A H C D S T N F Q M Q L G V H S K K V LAATGAGGATGAGCAGACAAGAAACCCAAAGGAGAAGTTCATTTGTCCCAATAAGAACAAC 240N E D E Q T R N P K E K F I C P N K N NAATGAAGTACTGGACAAGGACATCATGTTGATCAAGCTGGACAAACCTATTAGCAACAGT 300N E V L D K D I M L I K L D K P I S N SAAACACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAGCCCTCCCAGTGTGGGCTCAGTTTGCCGT 360K H I A P L S L P S S P P S V G S V C RATTATGGGATGGGGATCAATCACACCTGTTAAAGAGACTTTTCCCGATGTCCCTTATTGT 420I M G W G S I T P V K E T F P D V P Y CGCTAACATTAACCTACTTGATCATGCAGTGTGTCAAACAGGTTATCCAAGTTGCTGGCGG 480A N I N L L D H A V C Q T G Y P S C W RAATACAACATTGTGTGCAGGTTTCCTGGAAGGAGGCAAAGATACATGTGGGGGTGACTCT 540N T T L C A G F L E G G K D T C G G D SGGGGGGCCCCTCATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTGTATCTTATGGGGCGCATTCT 600G G P L I C N G Q F Q G I V S Y G A H STGTGGCCAAGGTCCTAAGCCTGGTATCTACACCAATGTCTTCGATTATACTGACTAGATC 660C G Q G P K P G I Y T N V F D Y T D ---CAGAGAAATATTGCAGGAAATACAGATGCAACTTGCCCCCCGTGA
3.如权利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的核苷酸序列，其特征在于它也可以具有其它天然基因突变体的DNA核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的核苷酸序列，其特征在于它也可以具有人工定点基因突变体的DNA核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的核苷酸序列，其特征在于它也可以具有可杂交的DNA核苷酸序列。
6.一种为克隆权利要求1、2、3所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因而设计的人工合成寡核苷酸引物，其特征在于该引物序列如下上游引物5’CTTCTAGAATGGTCATTGGAGGTGA(T)TGAG(A)TG 3’下游引物5’TTTCTCCTCTTG(A)AG(C)TA(T)TTTCAAA3’
全文摘要
从尖吻蝮蛇中分离纯化得到类凝血酶,测定该酶N端15个氨基酸的序列,据此设计简并的上游引物,其中含有翻译起始密码子ATG,以利于该基因的表达。然后根据与其它蝮属蛇毒类凝血酶3’非编码区同源性较高区域设计简并的下游引物。从毒腺中抽提总RNA,用PCR扩增出该基因,克隆后经全序列测定表明该成熟蛋白的cDNA编码699个核苷酸,即233个氨基酸。该基因的成功克隆及基因序列测定为开发基因工程产品创造良好条件。
文档编号C12N15/57GK1181421SQ9710670
公开日1998年5月13日 申请日期1997年11月12日 优先权日1997年11月12日
发明者周元聪, 吴祥甫, 潘华, 杜晓燕 申请人:中国科学院上海生物化学研究所