培养有甲醇代谢途径的微生物的方法

专利名称：：培养有甲醇代谢途径的微生物的方法
背景技术：
：1发明领域本发明涉及培养含有已经导入到一表达单位中的甲醇代谢途径的微生物的方法，在所述表达单位中，靶基因连在能够由甲醇诱导的启动子下游，所述方法能够有效地生产靶基因产物。2相关领域由于重组DNA技术的发展，用微生物作为宿主生产多肽和其它基因产物显然已成为可能。多肽生产是通过导入表达单位来完成的，在所述的表达单位中，靶多肽的基因连在适宜启动子的下游。通常用微生物，如大肠杆菌，酵母和动物细胞作为宿主。用大肠杆菌作为宿主的基因表达系统是最常用的系统，而且这些系统通常可以提供高产率。但是，在许多情况下，表达的多肽形成产生不可溶形式的不可溶的包含体，所以使用所述系统的可能性取决于靶多肽的特性。另一方面，由于在许多情况下，表达的多肽保持了活性，所以用动物细胞作为宿主的基因表达系统对于确定基因产物的活性等目的是有用的。然而，靶多肽的量通常很低，而且在所述情况下，还需要进行纯化。另外，由于动物细胞的繁殖慢，而且所用的培养基很贵，培养既费时又费钱。此外，也很难提高培养规模。因此动物细胞不适宜作为宿主用于以大体积工业上得到靶多肽。酵母细胞是有内质网，高尔基体和其它与动物细胞相似的细胞组分的真核细胞。还已知在从真核细胞衍生的多肽中，它们能够形成并表达具有特定三维结构的多肽。另外，它们的繁殖比动物细胞快，而且容易大体积培养。已经对酿酒酵母进行了广泛的遗传分析，广泛地用其在实验室水平作为基因表达的宿主。然而，由于很难使酿酒酵母生长到较高的细胞密度，而且每培养基的产率不高，因此不足以用于工业化生产靶多肽。为了解决这一问题，使用巴斯德毕赤氏酵母，多形汉逊酵母和博伊丁氏假丝酵母。例如，Gellissen等人用其表达受甲醇诱导的甲酸脱氢酶启动子和多形汉逊酵母为宿主，以每升培养基100-130干细胞重的细胞密度生产了1.4g葡糖淀粉酶(Gellissen等人，生物/技术，9，291-295，1991)。另外，Barr等人用其表达受甲醇诱导的醇氧化酶启动子和巴斯德毕赤氏酵母为宿主，每升培养基生产了4g人血清白蛋白(Barr等人，药物学工程，12(2)，48-51，1992)。但是，甚至在使用甲基营养型酵母的情况下，上述问题仍可能得不到解决。在具有甲醇代谢途径的酵母的情况下，在使用以上述三种甲基营养型酵母为代表的酵母和能够由甲醇诱导的启动子的异源基因表达系统中，当在含甲醇的培养基中培养酵母时，培养基中的甲醇迅速减少。在这种培养中，必须用甲醇作为碳源以同时保持从启动子开始的转录和细胞生长。但是，如果在甲醇供应过程中，甲醇在培养基中的浓度突然增加，就会杀死酵母。另外，通常通过对上清液进行气相层析等来测量在有甲醇代谢途径的酵母培养物中的甲醇浓度。但用所述方法，除需要特定的装置外，由于需要很长的时间才能确定甲醇的浓度，所以不利于迅速判断是否需要再补充甲醇。作为用于在表达靶基因的培养基中保持甲醇浓度的方法的实例，一种方法是使用降低甲醇消耗速率的酵母，在所述酵母中，从其代谢途径中除去了醇氧化酶。所述方法包括用甘油等作为碳源，使酵母生长，然后通过将固定量的甲醇加到培养基中来诱导从启动子开始转录以表达所述靶基因。由于甲醇的消耗速率低，所以很容易保持甲醇浓度。尽管可以得到稳定的培养，但该方法的缺点是由于是针对细胞生长期和靶基因表达期分别进行培养，所以需要较长的培养时间。在WO95/21928中公开了一种方法，其中将培养基中的甲醇浓度控制在恒定的水平以便通过培养甲基营养型酵母来表达靶基因，在所述酵母中，通过部分改变代谢途径的酶而减慢了甲醇代谢，但未增加细胞数量。所述方法包括在一种状态下，测量培养罐内空气中的甲醇浓度，其中培养罐内空气中的甲醇浓度反映了培养基中的甲醇浓度，然后从那些结果得到甲醇增加的速率以便控制培养基中的甲醇浓度。通过该方法，可以将醇氧化酶基因缺陷型的甲基营养型酵母培养基中的甲醇浓度控制在恒定的水平。然而，为了从培养罐内空气中的甲醇浓度预测培养基中的甲醇浓度，需要两者是平衡的。为了达到这种平衡，包括通气速率，压力和温度的培养条件必须保持稳定，而且不能突然改变培养基中的甲醇浓度。由于这些限制，只能将用于控制甲醇浓度的上述方法用于事先使用酵母使细胞生长后的基因表达诱导期，所述酵母没有甲醇代谢途径。另一方面，在使用能够用甲醇诱导的启动子和有甲醇代谢途径的微生物作为宿主的异源基因表达系统中，如果适当控制甲醇的加入速率和培养基中的甲醇浓度，就不需将微生物生长期和基因表达诱导期分开。结果，就可缩短培养时间，由此可在短时间内得到靶蛋白质。因此，在有甲醇代谢途径的微生物的培养中，要建立一种方法以便保持适当的甲醇加入速率或甲醇浓度，使它们同时可满足靶基因产物的生产和微生物生长。本发明综述本发明提供了在异源基因表达系统中，用于调整培养基中的甲醇浓度以便能够通过甲醇来诱导启动子并同时使宿主生长的方法，所述表达系统使用甲醇可诱导的启动子并以有甲醇代谢途径的微生物作为宿主，以及用所述方法培养宿主的方法。作为仔细检测甲醇加入方法，培养基中甲醇浓度和具有甲醇代谢途径之酵母培养中溶解氧量之间关系的结果，本发明人发现，当在培养物中甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时，其中将培养基中的溶解氧量控制在恒定水平(例如2ppm)，如果定期加入甲醇，溶解氧的量随甲醇的加入循环而波动。另外，还发现，在观察到溶解氧量定期波动的状态时增加甲醇的加入速率，最终不会观察到溶解氧量的定期波动，而且当甲醇的加入速率进一步增加时，甲醇在培养基中积累，而且会杀死酵母。当观察到溶解氧量的这些定期波动时，酵母生长而且诱导用甲醇可诱导启动子的转录。即，此时加入到培养基中的甲醇加入速率正好是满足靶基因产物生产和酵母生长的加入速率。此外，在观察到定期波动时，可以确定甲醇加入速率越快，细胞生长越快，靶基因产物生产率越高，从而完成本发明。即以上述实验结果为基础，本发明提供了培养具有甲醇代谢途径的微生物的方法，在所述微生物中已经导入了表达单元，所述表达单元含有位于可以由甲醇诱导的启动子下游的靶基因；其中在培养过程中，包括连续或定期加入甲醇的期间，将加入速率调整到等于或小于所述微生物最大甲醇消耗速率的速率。附图描述图1图示说明Kex2蛋白酶基因的结构，用于合成NKEX2-660基因的引物的序列，以及引物退火的基因区。图2说明构建pCU660的过程。图3图示说明当培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时，观察到溶解氧值与甲醇的定期加入同时波动，以及当甘油浓度为0.1％(w/v)或更低时，溶解氧波动图的定期变化。上图说明培养基中溶解氧值的波动。下图用实线说明培养基中的甘油浓度，用虚线说明甲醇浓度。图上说明了当甲醇和甘油浓度降到0.1％(v/v)或更低时的时间，以及加入甘油的时间。图4图示说明甲醇加入速率和溶解氧值定期波动之间的关系。将甲醇的加入速率定义为每小时每升培养基加入的甲醇量，而且用加入时间说明(用箭头表示)。图5图示说明使用4.5ml/L·h的甲醇加入速率，在培养中Kex2-660生产的实例。用实方块表示OD600值，用实圆圈表示Kex2活性(荧光强度)，用实三角表示培养基中的甲醇浓度。图6是电泳图谱的相片，是在甲醇加入速率为4.5ml/L·h时，在培养中表明的培养时间取样的5μl培养上清液的10％SDS-PAGE。详细描述最大甲醇消耗速率指在那些微生物的特定培养期和特定条件，以及在其中甲醇浓度不决定甲醇消耗速率的条件下，微生物的甲醇消耗速率。由于如果不以等于或大于最大甲醇消耗速率的速率加入甲醇，甲醇浓度就保持在恒定水平或逐渐增大，等于或小于所述微生物最大甲醇消耗速率的甲醇加入速率指将培养基中的甲醇浓度基本上保持接近于零，而在实践中，是将甲醇浓度保持在0.1％(v/v)或更低水平时的甲醇加入速率。为了得到上述的甲醇加入速率，在本发明中最典型的方法是使用定期加入甲醇的方法。所述定期加入法指在培养过程中的特定时间内，以特定的时间间隔加入指定量的甲醇。所述循环，即时间间隔正常为1-20分钟，优选5-10分钟。正如下文将描述的，根据本发明人的新发现，当甲醇加入速率，即在特定的单位时间(在本发明中表示为每升培养基每小时甲醇的毫升数)内加入的甲醇量低时，培养基中溶解氧浓度的水平与甲醇的加入循环同时波动，在这种情况下，培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)并基本上接近0％。相反，在甲醇的加入速率等于或大于微生物的最大甲醇消耗速率的情况下，溶解氧浓度水平基本上不与甲醇加入循环同时波动。在这种情况下，观察到在培养基中积累一定浓度的甲醇。因此，通过调整甲醇加入速率以便使培养基中的溶解氧浓度与甲醇的加入循环同时波动，可以将甲醇的加入速率调整到等于或小于所述微生物的最大甲醇消耗速率。但是，上述方法不是唯一的将甲醇加入速率调整到等于或小于微生物的最大甲醇消耗速率的方法。例如，如果能够在有恒定组成的培养基中，在稳定的条件下培养特定的微生物，并且能够重复相似的培养过程，则可以将根据实验得到的甲醇加入速率或其随时间的变化应用于与培养基中的溶解氧波动无关的另一种培养。在所述方法中，可以定期或连续加入甲醇。另外，在所述溶解氧浓度的定期波动中，溶解氧浓度的提高是消耗掉加入的甲醇的结果。如果将溶解氧浓度的降低看作消耗新鲜加入的甲醇的结果，则通过重复检测溶解氧浓度的增加，加入定量的甲醇并在因消耗掉加入的甲醇而降低了溶解氧浓度以及因用尽甲醇而再增加后，加入下一个循环的甲醇可将甲醇加入速率调整到等于或小于微生物最大甲醇消耗速率的速率。在本发明中，可诱导启动子指基因启动子，它编码与微生物如酵母的甲醇代谢有关的酶，其实例包括醇氧化酶基因的启动子(日本未审查专利公开No.5-344895；Ellis，S.B.etal.，Mol.Cell.Biol.5，1111-1112，1985)，甲酸脱氢酶基因启动子(Hollenberg，C.P.etal.，EPANo.0299108，1988)和甲醇氧化酶基因启动子(Ledeboer，A.M.etal.，NucleicAcidsRes.13，3063-3082，1985)。在本发明中，表达单元指表达载体如表达质粒。在本发明中，靶基因指例如编码有用的蛋白质的基因。在本文中，有用的蛋白质指例如酶或其它生理学活性蛋白质。酶的各种实例包括Kex2蛋白酶，激素原转化酶1/3(PC1/3)，激素原转化酶2(PC2)，弗林蛋白酶，肽C末端α-酰胺酶，葡萄球菌蛋白酶V8，无色杆菌蛋白酶I(API)，胎盘亮氨酸氨肽酶，胞质血小板激活因子乙酰水化酶和其衍生物。另外，其它生理学活性物质包括生长激素，生长激素释放激素，促肾上腺皮质激素(ACTH)释放激素，胰高血糖素，胰高血糖素样肽I，胰高血糖素样肽II，干扰素α，干扰素β，干扰素γ，促红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(TPO)，G-CSF，HGF，组织血纤维蛋白溶酶原(tPA)，干细胞因子，TGF家族和其衍生物。在本发明的整个培养过程中不必连续或定期加入甲醇。根据本发明优选的实施方案，培养基在开始培养时含有1-2％(v/v)的甲醇，此后培养至少12小时，例如15-20小时，而不必加入甲醇。当甲醇浓度降到约0.5％(v/v)或更低，例如0.2％-0.5％(v/v)时，开始连续或定期加入甲醇。此时，由于微生物大规模生长而且有甲醇的活性消耗，所以如果甲醇加入速率适当，则培养基中的甲醇浓度将进一步降低，最终降到0％-0.1％.。然后在这些条件下，继续加入甲醇。在用此方法加入甲醇的过程中，通过甲醇诱导启动子而引起靶基因的表达。同时，用加入的甲醇至少作为导致微生物生长的一部分生长物质。即，根据本发明，因甲醇诱导启动子而导致的基因表达，特别是靶有用蛋白质的生成，与微生物的生长同时完成，而且至少同时在培养基过程中的特定时期。因此，在本发明的方法中，没有必要将培养过程分成甲醇诱导启动子的过程和微生物生长的过程。在本发明方法中所用的微生物优选是甲基营养型酵母，而且优选属于毕赤氏酵母属，汉逊酵母属或假丝酵母属的微生物。属于这些属的酵母包括巴斯德毕赤氏酵母，多形汉逊酵母和博伊丁氏假丝酵母。接着，下文提供更详细的本发明的说明。可以用本发明在基因表达系统中有效生产靶基因产物，所述基因表达系统使用甲醇可诱导的启动子并以具有甲醇代谢途径的微生物作为宿主。在本发明中，尽管已经表明博伊丁氏假丝酵母是具有甲醇代谢途径的微生物的具体实例，博伊丁氏假丝酵母的醇氧化酶基因的启动子是启动子的具体实例，分泌性Kex2衍生物是靶基因产物的具体实例，但并不限于所说明的具体实例。用博伊丁氏假丝酵母菌株TK62(pCU660)#10完成培养条件的研究。菌株TK62(pCU660)#10是分泌型Kex2衍生的高产菌株，是以在试管规模的培养中，以Kex2衍生物的生产和分泌为基础从含有分泌型Kex2衍生物表达载体pCU660的菌株TK62的20个克隆中筛选出来的。下面将说明Kex2衍生的表达载体pCU660和宿主菌株TK62的生产。质粒pCU660是能够通过AOD启动子表达分泌型Kex2衍生物的质粒，通过将含分泌型Kex2衍生物基因的DNA片段插入到pNOTelI的NotI位点来制备(日本未审查专利公开No.5-344895)。将从酿酒酵母Kex2蛋白酶(814个氨基酸残基)(称为Kex2-660)N末端到第660个氨基酸残基的多肽用于分泌型Kex2衍生物，所述多肽缺失了C末端的跨膜结构域。通过使用NKEX2和KM088为引物和编码KEX2基因的DNA为模板的PCR扩增来制备含有NKEX2-660基因的DNA片段(-132-1980核苷酸；以KEX2基因(Kex2蛋白酶的结构基因)起始甲硫氨酸密码子的A为1；Mizuno，etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.156，pp.246-254，1988)。引物NKEX2是含有DNA序列的DNA寡聚物，所述DNA序列对应于从KEX2基因的起始甲硫氨酸密码子开始的上游107-132核苷酸，而所述序列是因将NotI限制酶识别位点加到其5’侧区而得到的。KM088是含有与一核苷酸序列互补之序列的DNA寡聚物，所述核苷酸序列是因将翻译终止密码子TAA加到对应于Kex2蛋白酶第654-660个氨基酸而得到的。另外，pCU660是插入染色体的表达载体，含有一作为选择性标记的URA3基因(特有的BamHI限制酶位点位于该基因中)。如果用经URA突变得到的需要尿嘧啶的菌株作为宿主，则根据尿嘧啶需求的互补性可以筛选转化体。TK62菌株是通过URA3突变得到的，从博伊丁氏假丝酵母菌株S2AOU-1衍生的尿嘧啶需求型菌株，有一组用于甲醇代谢途径的酶，包括醇氧化酶，由此能够使其以甲醇作为其碳源。此外，在培养中，用甲醇为碳源以及使用以前公开的所述启动子(日本未审查专利公开No.5-344895)的异源基因表达系统，通过TK62菌株表达的醇氧化酶的细胞内蛋白质含量高达约40％。其次，用上述的TK62(pCU660)#10菌株完成了培养条件的研究。培养基中甲醇浓度是极重要的微生物生长和有效诱导从甲醇可诱导的启动子进行的转录的参数，所述微生物具有甲醇代谢途径。因此，用发酵罐培养TK62(pCU660)#10菌株以研究影响宿主生长的条件，例如将甲醇加到培养基中的条件。首先，用甲醇和甘油作为碳源完成培养。培养开始时，将细胞密度调到OD600＝0.2的培养基浊度，考虑到细胞毒性，将开始的碳源调到1.5％(v/v)的甲醇浓度，考虑到渗透压，甘油的浓度为3％(v/v)。每隔3小时测一次培养基的甲醇浓度，参考前2-3小时的浓度确定加到培养基中的甲醇时间和数量。用蠕动泵定期加入甲醇和甘油，所述泵有一每单位时间恒定的传递体积，每隔7.5分钟一次。加入速率以每小时每1升培养基加入的甲醇(ml/L·h)或甘油(ml/L·h)量表示。由于在培养开始后15小时，培养基的甲醇浓度降到0.42％(v/v)，所以在培养开始后18小时以0.75ml/L·h的速率加入甲醇。此外，在培养开始后18小时，但开始加入之前，培养基的甲醇浓度降到0.26％(v/v)。由于在培养开始后21小时，培养基的甲醇浓度降到0.1％(v/v)或更低，在培养开始后23小时甲醇的加入速率增加到7.5ml/L·h。在此加入之后，观察到搅拌速率迅速降低，酵母的氧消耗速率突然降低，即细胞活性降低。在这些降低后，预期细胞密度降低，酵母溶解。在甲醇加入速率增加后1小时(培养开始后24小时)，培养基的甲醇浓度为0.76％(v/v)，而且发现甲醇正在积累。以上述结果为基础，发现1)在培养开始后的第18小时(OD600＝约50)，是开始将甲醇加到培养基中的好时间，2)由于在以7.5ml/L·h的甲醇加入速率的3小时内，培养基中的甲醇浓度降到0.1％(v/v)或更低，有可能使作为碳源的甲醇短缺，和3)由于7.5ml/L·h的甲醇加入速率过高而造成培养基中甲醇积累，从而有可能发生细胞毒性。另外，在培养有甲醇代谢途径的TK62(pCU660)#10菌株时，发现在培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低的状态持续后，迅速加入甲醇会杀死TK62(pCU660)#10菌株。此外，从培养开始后的第20-23小时，观察到溶解氧值与甲醇加入循环(由重复的突然加入，保持高值和突然降低组成)同时变化。由于该期间与从培养基中的甲醇浓度降到0.1％(v/v)或更低到因向培养基中迅速加入甲醇而造成甲醇开始积累的时间同步(即在培养基中甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时的时间)，表明培养基中的溶解氧值的定期波动与培养基中的甲醇浓度之间有关系。溶解氧量是用于正常培养控制监测的参数，并用溶解氧电极测量。如果以具有甲醇代谢途径之微生物培养中的溶解氧量变化为基础，可以预测需要的甲醇量，就可以很容易地确定稳定而有效的培养条件。因此，为了详细研究与培养基的甲醇加入循环同时发生的溶解氧值波动和甲醇浓度之间的关系，以介于培养基中甲醇浓度迅速降低的0.75ml/L·h和上述培养中培养基中甲醇积累的7.5ml/L·h速率之间的2.25ml/L·h的甲醇加入速率完成培养。在培养开始后第18小时，将甲醇与甘油(0.15ml/L·h)同时加入。从培养开始后的第23小时到完成培养(培养开始后49小时)观察到溶解氧值与碳源加入循环同时变化。在此期间，培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低。即在观察到溶解氧值的波动与甲醇加入循环同时发生的期间，甲醇未在培养基中积累，而且可以肯定浓度为0.1％(v/v)或更低。另外，显然，在甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时(培养开始后23-49小时)，细胞数量增加了2倍以上。换句话说，甚至培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时，细胞也能够生长。此外，当培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低，而且甘油浓度也为0.1％(v/v)或更低时，与碳源溶液加入循环同时发生的溶解氧值的定期波动的变化量也增加。当加入甘油以便此时培养基中的最终浓度为1.25％(w/v)时，尽管变化量恢复到正常，但与碳源溶液加入循环同时发生的溶解氧值的定期波动本身仍然继续。即，显然，溶解氧值的定期波动表明培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低，而变化量的增加表明了培养基中甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低以及甘油浓度为0.1％(v/v)或更低的状态。通过使用这些指标，可以监测培养基中甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低以及甘油浓度为0.1％(v/v)或更低的状态，由此确定补充这些碳源的适宜加入量。本发明的发明人澄清了在具有甲醇代谢途径的甲基营养型酵母的培养中，使酵母可以生长但不会死亡的甲醇加入速率可以用甲醇的定期加入和与所述加入同时波动的溶解氧值来监测。此外，还清楚地表明，在与定期甲醇加入同时观察到的溶解氧值定期波动的过程中，培养是在甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低而且培养基中无甲醇积累的状态，即其中加入的甲醇量等于酵母消耗的甲醇量的状态。因此，尝试了以与甲醇加入同时发生的溶解氧值的定期波动为指标测量高细胞密度状态下甲醇消耗的速率。相似地，在将TK62(pCU660)#10菌株培养到65gDCW/L(OD600＝270)的细胞密度的过程中，以1.5，2.2，4.7和6.4ml/L·h(等于每1g酵母干重每小时加入0.023-0.098ml(ml/gDCW·h))的加入速率加入甲醇，然后检测溶解氧值的定期波动图和培养基中的甲醇浓度。结果，发现当甲醇加入速率为1.5-4.7ml/L·h时，溶解氧值与甲醇加入同时波动，而且在那些时间，培养基中的甲醇浓度均为0.1％(v/v)或更低。另外，波动图随甲醇加入速率的增加而变化，发现在加入甲醇后，每单位时间溶解氧值的增加更平缓。当甲醇的加入速率为6.4ml/L·h时，就不再观察到溶解氧值与甲醇加入循环同时发生的定期波动。尽管在此时培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低，当甲醇加入速率进一步增加时，发现培养基中甲醇积累。如上所述，本发明的发明人确定在甲醇加入速率变化的培养中，至少当溶解氧值与甲醇的定期加入同时变化时，加入到培养基中的甲醇被立即消耗而且不在培养基中积累。换句话说，达到了加入的甲醇量等于酵母消耗的甲醇量的状态。此外，还清楚地表明，溶解氧值的波动图随加入的甲醇量变化，或换句话说，根据直到甲醇完全被消耗掉的时间，不用取样就可以检测在各时间由酵母消耗的最大甲醇量(积累前加入的甲醇量)。以这些发现为基础，确定了在细胞密度为65gDCW/L(OD600＝270)的状态下，消耗甲醇的最大速率为0.098ml/gDCW·h。当TK62(pCU660)#10菌株的细胞密度为OD600＝270(65g干细胞重/L培养基)时消耗甲醇的最大速率为0.098ml/gDCW·h时，而且在甲醇加入速率等于或低于该值的情况下，甲醇不在培养基中积累。然而，尽管可以很容易预测适宜于TK62(pCU660)#10菌株生长和Kex2-660分泌生产的甲醇加入速率等于或低于最大的甲醇消耗速率，但不知哪一个加入速率最适宜。为了研究适宜于TK62(pCU660)#10菌株生长和Kex2-660分泌生产的甲醇加入速率，用2.25ml/L·h或4.5ml/L·h的甲醇加入速率完成培养，确定此时的细胞生长率和Kex2-660的分泌生产。结果，清楚地表明，在培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时(此时观察到溶解氧值与甲醇加入循环同时波动)，细胞增加，Kex2-660被表达并分泌到培养基中。即，发现在培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低和溶解氧值与定期甲醇加入同时波动时的甲醇加入速率是使细胞生长和靶产物表达的适宜速率。另外，作为使用2.25ml/L·h和4.5ml/L·h的甲醇加入速率比较培养的结果，在培养开始后48小时的细胞数量从培养开始分别增加1400倍和1800倍，而生产和分泌的Kex2-660量分别是每升培养上清液1260MU和2850MU(分别等于约150mg和340mg)(表1)。清楚地表明，只要保持甲醇加入条件使得溶解氧值的定期波动持续，细胞生长增加，Kex2-660的生产随甲醇加入量而增加。另外，在培养开始后第18小时，以2.25ml/L·h和4.5ml/L·h的速率加入甲醇的TK62(pCU660)#10菌株培养中，清楚地表明当干酵母重为0.5g/L(OD600＝2)或更高时，甲醇消耗的速率为0.03-0.16ml/gDCW·h(表2)。表1★甘油的加入速率为5g/L·h。在培养开始后第48小时测量OD600Kex2活性。表2</tables>DCW每升培养基酵母干细胞重。甲醇消耗速率在6小时的培养时间中，0-6小时的平均值，相似地用于其它培养时间。另外，生产上述Kex2的48小时的培养时间只是WO95/21928所说明的通过将得到靶基因产物所需的100-160小时分成甲基营养型酵母生长期(约40小时)和生产期(60-120小时)的1/3-1/2，因此清楚地表明了本发明以工业水平生产物质的有用性。此外，未列出通过计算机自动控制培养而评估经定期加入甲醇而产生的溶解氧值的定期波动的实施例。然而，在用发酵罐培养中，溶解氧量，pH和温度均是控制培养的基本参数的值，而且用DO敏感仪，pH敏感仪和温度敏感仪分别测量不同时间的这些值，以便通过计算机和自动控制培养来评估这些值。当控制这些参数时，不仅用每个参数，而且用每单位时间各参数的变化量来控制培养。即本领域专业人员通过确定被加入的适宜的甲醇量，可以自动控制加入的甲醇量，所述适宜量是以相关于与定期加入甲醇同时波动的溶解氧值以及根据本发明的发明人说明的甲醇加入速率的波动图谱变化为基础确定的。实施例尽管下文以具有甲醇代谢途径的博伊丁氏假丝酵母为实施例详细说明了本发明，但本发明并不限于该实施例。另外，尽管以醇氧化酶启动子作为用于甲醇诱导表达的实施例，并用Kex2-660作为详细说明中的待生产基因产物的实施例，但本发明并不限于这些实施例。实施例1制备NKEX2-660基因和表达载体pCU660用下述方法制备编码分泌性Kex2衍生物Kex2-660(由从内蛋白酶的N-末端氨基酸到第660个氨基酸组成的蛋白质)的基因(NKEX2-660)和NKEX2-660表达载体pCU660。1)制备NKEX2-660基因(见附图1)用质粒pYE-KEX2(5.0)b，所述质粒用限制酶EcoRI切割，然后形成直链(Mizunoetal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.156，246-254，1988)作为模板，用NKEX2(SEQIDNO1)和KM088(SEQIDNO2)为引物经PCR制备含NKEX2-660的DNA片段。NKEX2和KM088相当于附图1(a)中所示的KEX2基因区，NKEX2含有对应于KEX2基因起始甲硫氨酸密码子开始的上游107-132核苷酸的序列，而KM088含有与核苷酸序列互补的核苷酸序列，前者是通过将翻译终止密码子TAA加到对应于Kex2蛋白酶氨基酸654-氨基酸660的DNA中而得到的核苷酸序列(Mizunoetal，Biochem.Biophys.Res.Commun.156，p246-254，1988)。另外，NKEX2在其5’末端有限制酶NotI位点的核苷酸序列(划线的)，而KM088有限制酶SalI位点的核苷酸序列(划线的)(见附图1(b))。根据phosphoamidide方法，用自动合成仪(AppliedBiosystemsModel380A)合成这些引物。2)制备表达载体pCU660(见附图2)用博伊丁氏假丝酵母作为宿主，通过将含NKEX2-660基因的NotIDNA片段插入到表达载体pNOTelI(日本未审查专利公开No.5-344895)中而制备表达载体pCU660以便在醇氧化酶基因(AOD)启动子的控制下可以表达KEX2-660基因(附图2)。对于载体，用限制酶NotI切割pNOTelI，然后纯化约7.4kb片段。通过将含1)的NKEX2-660基因的DNA片段克隆到pCRII(Invitrogen)中，然后用限制酶切割存在于NKEX2和pCRII上的NotI位点来制备含NKEX2-660基因的NotIDNA片段。此外，pNOTelI是能够使靶基因通过AOD启动子表达并且在用酵母为宿主的情况下，含有URA3基因作为选择性标记，而在用大肠杆菌为宿主时用氨苄青霉素抗性为选择性标记的载体。结果，如果用酵母作为需要尿嘧啶的宿主，在不含尿嘧啶的平板上就可以筛选转化体。实施例2分离转化体和Kex2-生产菌株用限制酶BamHI切割质粒pCU660，然后将形成的直链导入到尿嘧啶需要型菌株TK62中，通过尿嘧啶需要的互补性筛选插入到染色体中的重组TK62菌株。TK62菌株是由URA3突变产生的尿嘧啶需要型菌株，是从博伊丁氏假丝酵母菌株S2AOU-1衍生的，Sakai等人(SakaiY等人，细菌学杂志，173，7458-7463，1991)报道了TK62菌株的转化方法。已经将S2AOU-1菌株命名为博伊丁氏假丝酵母SAM1958，并于1992年2月25日保藏在工业科学和技术生物工程和人类技术研究所(InstituteofBioengineeringandHumanTechnologyAgencyofIndustrialScienceandTechnology)，保藏号为FERMBP-3766。pCU660是插入染色体的表达载体，所以根据基因的染色体插入位点，拷贝数等，对于所得的转化体TK62(pCU660)来说，表达的Kex2衍生物的量和分泌的量会不同。在试管水平培养20个转化体克隆(#1-#20)，研究分泌到培养基中的Kex2衍生物的量以筛选分泌大量Kex2衍生物的克隆。首先，在27℃，BMGY培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)胨，1％(w/v)甘油，1.34％(w/v)YNBwoAA不含氨基酸的YeastNitrogenBase，0.4mg/L生物素和100mM磷酸钾(pH6.0))中振荡培养#1-#20的20个TK62pCU660菌株。2天后，将所述培养基接种到BMMY培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)胨，0.5％(w/v)甘油，1.34％(w/v)YNBwoAA，0.4mg/L生物素和100mM磷酸钾(pH6.0))中以便OD600达到10，然后在27℃振荡培养。30小时后，测量上清液的Kex2活性，筛选有最高活性的5个菌株。用相似的方法培养这5个菌株，然后筛选TK62(pCU660)菌株#10，然后由于其始终如一高的Kex2活性水平，而用于下列试验。按照Mizuno等人的方法(Mizunoetal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，156，246-254，1988)测量Kex2活性。即，将用100mMTris-HCl(pH7.0)稀释的100μlKex2-660加到100μl含2mMCaCl2，0.2％(w/v)luburol和100μMBoc-Leu-Arg-Arg-MCA(PeptideResearch)的200mMTris-HCl(pH7.0)溶液中，然后使其在37℃保持30分钟。加入50μl25mM的EGTA后，用PANDEXFCA系统(Baxter-Travenol10-015-1型，激发＝365nm，发射＝450nm)测量切割的AMC的荧光强度。将在上述条件下在1分钟内释放1pmolAMC的Kex2活性量定义为1U。实施例3确定培养条件(见图3)1)基本培养条件通过从甘油冷冻原种中将1mlTK62(pCU660)#10菌株接种到含25mlYPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)胨，2％(w/v)葡萄糖)的300ml锥形烧瓶中，并在37℃振荡培养16小时来完成预培养。用5升发酵罐(MitsuwaScientificInstruments，KMJ-5B-4U-FP型)通过将上述预培养物接种到2升培养基(1.5％(v/v)甲醇，3％(w/v)甘油，1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)胨，50mM磷酸钾(pH6.0))以便在培养开始时的细胞密度为OD600＝0.2，在27℃搅拌并通气以完成主培养。通气速率为4L/分，控制搅拌速率以便溶解氧量不降到2.5ppm以下。用80ml的氮源补充溶液(5％(w/v)酵母提取物，10％(w/v)胨，6.7％(w/v)YNBwoAA)适宜补充培养基的氮，通过加入7.5％的氨水控制pH不降到5.5以下。在培养开始加入0.5ml/L消泡剂(DisfoamCC-222，NipponYushi)，此后按需要加入。用15-45％(v/v)甲醇溶液和10-50％(w/v)甘油溶液补充碳源(根据培养可以改变浓度)。通过操作每单位时间有恒定传递体积的蠕动泵定期加入甲醇和甘油，所述单位时间为每隔7.5分钟一次。加入速率用每小时每升培养基加入的甲醇量(ml/L·h)或甘油量(g/L·h)表示。2)研究甲醇加入条件培养基中的甲醇浓度是甲基营养型酵母菌株TK62(pCU660)#10生长的重要参数，所述菌株有甲醇代谢途径，并用于从AOD启动子表达Kex2-660，通过甲醇诱导所述启动子的表达。本发明的发明人首先试图确定甲醇的加入条件以使培养基中的甲醇浓度保持在碳源足够酵母生长而且不会表现出细胞毒性的浓度。根据基本培养条件完成培养。每隔3小时测量一次培养基的甲醇浓度，参考前2-3小时的浓度确定甲醇加到培养基中的时间和量。由于在培养开始后15小时，培养基中的甲醇浓度已经降到0.42％(v/v)，所以在培养开始后第18小时以0.75ml/L·h的速率开始加入甲醇(OD600＝52)。此外，培养开始后18小时，甲醇加入前培养基中的甲醇浓度已经降到0.26％(v/v)。由于培养开始后第21小时，培养基中的甲醇浓度已经降到0.1％(v/v)或更低，在培养开始后第23小时，甲醇的加入速率已经增加到7.5ml/L·h(是开始加入速率的10倍)。紧接着加入速率增加后，搅拌速率迅速降低，而且酵母消耗氧的速率突然降低。即，观察到细胞活性降低。此后，细胞密度降低，而且认为酵母溶解。在甲醇加入速率增加后1小时(培养开始后24小时)，培养基中的甲醇浓度为0.76％(v/v)，因此表明甲醇在培养基中积累。在上述结果的基础上，发现1)甲醇开始加入到培养基中的良好时间是培养开始后的第18小时(OD600＝约50)，2)由于在以0.75ml/L·h加入甲醇的3小时内，培养基中的甲醇浓度减少到0.1％(v/v)或更低，所以可能有作为碳源的甲醇短缺，和3)因加入速率很快超过7.5ml/L·h而引起的培养基中的甲醇积累，有可能发生细胞毒性。另外，发现在培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低的状态持续后，甲醇的迅速加入会杀死TK62(pCU660)#10菌株。从培养开始后第20-23小时，观察到溶解氧值与甲醇加入循环同时波动。由于该时期与培养基中的甲醇浓度降到0.1％(v/v)或更低的时间到因甲醇迅速加到培养基中而使甲醇开始积累的时间(即，培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低的时间)一致，表明溶解氧值的定期波动与培养基中的甲醇浓度之间有关系。3)溶解氧值波动和培养基中的甲醇浓度在前节定期加入甲醇的培养基中，当培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时，观察到溶解氧值与其加入循环同时波动，而当甲醇开始在培养基中积累时，就观察不到了。溶解氧值是用于培养控制的常规监测参数，用溶解氧电极测量。如果根据有甲醇代谢途径的微生物培养中溶解氧量的变化，可以预测所需的甲醇量，就可以很容易地确定稳定和有效的培养条件。因此，用2.25ml/L·h的甲醇加入速率(它介于培养基中甲醇浓度迅速降低时的速率0.75ml/L·h和在上述2节培养中甲醇在培养基中积累的速率7.5ml/L·h)进行培养，详细研究与甲醇加入循环同时发生的溶解氧值的波动与培养基中甲醇浓度之间的关系。以上述2)节的结果为基础，将开始加入甲醇的时间定为OD600达到约50时的时间(大约在培养开始后18小时)，将碳源的加入速率定为甲醇为2.25ml/L·h，甘油为0.15g/L·h。在培养开始后第23小时(OD600＝97)，开始观察到溶解氧值与碳源加入循环同时波动，而且持续到培养完成(培养开始后49小时，OD600＝198)。在此时，培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低。另外，当培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低，而甘油浓度也为0.1％(w/v)或更低时，与碳源加入循环同时发生的溶解氧值波动的变化量增加(图3)。当加入甘油以便此时培养基中的最终浓度增加到1.25％(w/v)时，尽管变化量恢复到正常，发现与碳源加入溶液的加入循环同时发生的溶解氧值的定期波动本身会持续(图3)。即，显然溶解氧值的定期波动表明培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低，变化量的增加表明培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低以及甘油浓度为0.1％(w/v)或更低时的状态。通过使用这些指标，可以监测甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低以及甘油浓度为0.1％(w/v)或更低的状态。另外，还清楚地表明在甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时(培养开始后23-49小时)期间，细胞数量增加两倍。换句话说，甚至当培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时，细胞也能够生长。实施例4根据溶解氧值的定期波动图确定最佳甲醇加入速率本发明的发明人清楚地表明在实施例3培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低，而且此时甲醇不会在培养基中积累的过程中，观察到溶解氧值与甲醇的定期加入同时波动，当甲醇开始积累时，就观察不到溶解氧值的波动。此外，还清楚地表明在观察到溶解氧值与甲醇的加入同时波动的状态中，细胞生长。因此，完成一项研究以确定甲醇加入速率与溶解氧值定期波动之间的关系，并确定甲醇加入速率与Kex2-660分泌产物量之间的关系。1)甲醇加入速率与溶解氧值的定期波动相关研究当甲醇加入速率改变时，与定期甲醇加入同时发生的溶解氧值波动图谱的变化以确定所述改变是否可作为控制甲醇加入到培养基中的指标。当培养开始后细胞密度达到OD600＝270(65gDCW/L培养基)时，甲醇加入速率改变到1.5，2.2，4.7和6.4ml/L·h，然后检测在那些时间溶解氧值的定期波动图谱和培养基中的甲醇浓度。以5g/L·h的速率同时加入甘油。发现当甲醇加入速率为1.5，2.2或4.7ml/L·h时，溶解氧值与甲醇的加入同时波动，在那些时间培养基中甲醇浓度均为0.1％(v/v)或更低，而且不积累甲醇。此外，发现随甲醇加入速率增加波动图谱也变化而且加入甲醇后，每单位时间溶解氧值的增加速率更平缓(图4)。另外，当甲醇的加入速率为6.4ml/L·h时，就不再观察到溶解氧值与甲醇加入循环同时定期波动(图4)。尽管此时培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低，当甲醇的加入速率进一步提高时，发现培养基中的甲醇开始积累。尽管仅通过测量培养基中的甲醇浓度不能确定酵母消耗甲醇的能力，以上述结果和实施例3中的2)节的为基础，确定如果每单位时间的溶解氧值迅速增加，酵母有相当大的甲醇消耗范围，而如果增加平缓，则几乎没有甲醇消耗。换句话说，通过观察溶解氧值的定期波动图谱，就可以确定如何调整甲醇加入速率。此外，已经清楚地表明，在细胞密度为OD600＝270的状态，只要甲醇加入速率不超过4.7ml/L·h，就观察到溶解氧值的定期波动，甲醇不积累，而且TK62(pCU660)#10菌株生长而不会被杀死。2)甲醇加入速率和分泌的Kex2-660的生产量当TK62(pCU660)#10菌株的细胞密度为OD600＝270(65gDCW/L培养基)时，甲醇不在培养基中积累而且酵母不会被杀死的甲醇加入速率为1.5-4.7ml/L·h。因此，为了研究在甲醇不会在培养基中积累的这些甲醇加入速率哪个对于TK62(pCU660)#10菌株的生长速率和分泌Kex2-660的生产量是最佳的，用2.25ml/L·h或4.5ml/L·h的甲醇加入速率完成培养，在那些时间确定细胞生长速率和分泌的Kex2-660产生量。在这两种情况下，甘油的加入速率均为5g/L·h。在用2.25ml/L·h和4.5ml/L·h的甲醇加入速率进行培养时，分别在培养开始后22和25小时，溶解氧值开始与甲醇的定期加入同时波动，波动持续到完成培养的第48小时。在此过程中，培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低。在观察到溶解氧值波动的过程中，在任何条件下，细胞密度和分泌的Kex2-660生产量均增加(例如，在以4.5ml/L·h的甲醇加入速率开始培养后第24-第48小时期间，细胞密度和分泌的Kex2-660生产量分别增加约2.5倍和约7.4倍；图5)，当观察到溶解氧值与甲醇加入循环同时波动时，在培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低的期间，不考虑甲醇加入速率显然细胞数量增加，而且Kex2-660表达并分泌到培养基中(图5和6)。即，发现在培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低，而且溶解氧值与甲醇的定期加入同时波动的甲醇加入速率是适宜于细胞生长和靶产物表达的速率。在用2.25ml/L·h和4.5ml/L·h的甲醇加入速率进行培养的过程中，在培养开始的第48小时，细胞数量分别增加1400和1800倍，而每升培养上清液表达和分泌的Kex2-660分别为1260MU和2850MU(等于约150mg和340mg)(表1)。因此，显然，只要保持甲醇加入条件以便溶解氧值的定期波动持续(换句话说，在等于或低于酵母最大甲醇消耗速率的速率)，细胞生长就会增加而且随加入的甲醇量增加，Kex2-660的生产量增加。此外，与甲基营养型酵母分成生长期和生产期的培养时间(100-160小时)相比，这些培养所需的的时间(48小时)是短的，所述酵母是甲醇代谢途径酶缺陷型，因此本发明是有用的。图6表明了按照Laemmli(Laemmli等人，自然，227，680-685，1970)的方法所得的SDS-PAGE的结果。即，将7μl4xSDS样品缓冲液(375mMTris-HCl(pH6.8)，30％(w/v)甘油，7％(w/v)SDS，15％(v/v)2-巯基乙醇，0.1％(w/v)溴酚蓝)加到20μl培养上清液中，然后在95℃加热5分钟以制备SDS-PAGE样品。用7μl上述样品，在18mA和90分钟的条件下，完成6％SDS-PAGE。电泳后，用染色溶液(10％(v/v)乙酸，40％(v/v)甲醇，0.25％(w/v)考马斯亮蓝R250)将凝胶染色。在图6中列出了那些结果。3)甲醇消耗速率在用2.25ml/L·h和4.5ml/L·h的甲醇加入速率进行培养的过程中，确定每gDCW酵母的甲醇消耗速率(平均每6小时)(表2)。取每升培养基的甲醇消耗速率是从加入的甲醇量减去剩余的甲醇量而得的值，同时通过将培养基的OD600值代入事先以这两者之间的关系为基础确定的转换式中来计算酵母干细胞重(DCW)。另外，由于预计在DCW为0.5g或更低时，如通气和因搅拌而引起热产生的因素的影响将会很显著，所以由于很可能不能计算正确的甲醇消耗量而从评价中消除了。在以溶解氧值的定期波动为基础培养TK62(pCU660)#10菌株的过程中，当DCW为0.5g或更高时，确定甲醇的消耗速率为0.03-0.16ml/gDCW·h。根据本发明，从微生物消耗的甲醇量可以确定适宜于微生物生长和用启动子控制的异源基因之表达的甲醇加入量，而不必测量培养基中的甲醇浓度，所述微生物具有甲醇代谢途径，在异源基因表达系统中使用甲醇可诱导的启动子和具有甲醇代谢途径的微生物作为宿主，不使用甲醇代谢途径酶缺陷型的菌株。另外，当培养基中的甲醇浓度为0.1％(v/v)或更低时，溶解氧值与甲醇的定期加入同时波动的过程中，所述微生物的最大甲醇消耗速率大于或等于甲醇的加入速率，而且甲醇不在培养基中积累，由此可以进行稳定的培养，其中不会因甲醇引起的细胞毒性而破坏微生物。此外，当微生物的最大甲醇消耗速率与甲醇的加入速率之间的差异减小以便两者相等时，由于溶解氧值波动图谱的变化，就可以确定适宜微生物生长和用启动子控制之异源基因表达的甲醇加入速率，而且用所述的变化作为指标可以进行控制。由于溶解氧值是正常用于控制培养的参数，所以从其波动图谱就可以确定甲醇的加入速率，可以按照自动反馈控制环加入甲醇，在具有甲醇代谢途径的微生物的培养中，这在过去是不可能的。即，本发明提供了培养方法，所述方法可以使微生物有效生长并能有效生产靶产物，同时通过使甲醇加入速率保持等于或小于所述微生物的最大甲醇消耗速率并接近所述最大消耗速率(它能够通过启动子的诱导而有效地转录而不需抑制宿主的生长)而提供了高度的可重复性。另外，可以迅速培养以甲醇作为其碳源的具有甲醇代谢途径的微生物，而且可以有效地生产。此外，就分泌到培养基中的基因产物而言，预期培养基中甲醇和甘油量的减少有助于提高基因产物的稳定性而且使纯化过程更简单。序列表1.SEQIDNO1序列类型核酸序列长度35个碱基对链型线性分子类型合成的DNA序列GCGGCCGCTTAAACATCCCGTTTTGTAAAAAGAGA2.SEQIDNO2序列类型核酸序列长度35个碱基对链型线性分子类型合成的DNA序列TAAGTCGACTTAAGGATCGGTACTCGCAGTAGTCG权利要求1培养具有甲醇代谢途径的微生物的方法，在所述微生物中导入了含有连接在甲醇可诱导之启动子下游的靶基因的表达单位；其中在包括连续或定期加入甲醇的培养过程中，将加入速率调整到等于或小于所述微生物的最大甲醇消耗速率。2根据权利要求1的方法，其中所述的甲醇加入是定期完成的，而且以培养基中的溶解氧浓度与甲醇加入过程同时波动的速率加入甲醇。3根据权利要求1或2的方法，其中所述的甲醇加入是定期完成的，而且通过检测培养基中因甲醇浓度降低而引起的溶解氧浓度的升高来开始每个时期的甲醇加入。4根据权利要求2或3的方法，其中在所述溶解氧浓度定期波动的过程中，培养基中的甲醇浓度等于或小于0.1％(v/v)。5根据权利要求1-4的任一方法，其中所述微生物是甲基营养型酵母。6根据权利要求5的方法，其中所述甲基营养型酵母是属于毕赤氏酵母属，汉逊酵母属或假丝酵母属的微生物。7根据权利要求6的方法，其中所述酵母是巴斯德毕赤氏酵母，多形汉逊酵母和博伊丁氏假丝酵母。8根据权利要求1-7的任一方法，其中当细胞密度至少为0.5g/L干细胞重(DCW)时，甲醇的消耗速率为0.01-0.02ml/gDCW·h。9根据权利要求1-8的任一方法，其中所述能够用甲醇诱导的启动子为醇氧化酶基因的启动子，甲酸脱氢酶基因的启动子或甲醇氧化酶基因的启动子。10根据权利要求9的方法，其中所述甲基营养型酵母是博伊丁氏假丝酵母，而且所述启动子是博伊丁氏假丝酵母的醇氧化酶基因启动子。11根据权利要求1-10的任一方法，其中所述靶基因是编码有用蛋白质的基因。12根据权利要求11的方法，其中所述有用蛋白质是酶或其它生理学活性物质。13根据权利要求12的方法，其中所述酶是Kex2蛋白酶，激素原转化酶1/3(PC1/3)，激素原转化酶2(PC2)，弗林蛋白酶，肽C末端α-酰胺酶，葡萄球菌蛋白酶V8，无色杆菌蛋白酶I(API)，胎盘亮氨酸氨肽酶，胞质血小板激活因子乙酰水化酶和其衍生物。14根据权利要求13的方法，其中在培养基中分泌所述Kex2蛋白酶的衍生物。15根据权利要求12的方法，其中所述生理学活性物质是生长激素，生长激素释放激素，促肾上腺皮质激素(ACTH)释放激素，胰高血糖素，胰高血糖素样肽I，胰高血糖素样肽II，干扰素α，干扰素β，干扰素γ，促红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(TPO)，G-CSF，HGF，组织血纤维蛋白溶酶原(tPA)，干细胞因子，TGF家族和其衍生物。全文摘要本发明公开了培养具有甲醇代谢途径的微生物的方法，在所述微生物中导入了含有连接在甲醇可诱导之启动子下游的靶基因的表达单位；其中在包括连续或定期加入甲醇的培养过程中，将加入速率调整到等于或小于所述微生物的最大甲醇消耗速率。文档编号C12N9/60GK1167152SQ9711003公开日1997年12月10日申请日期1997年3月3日优先权日1996年3月4日发明者孙田浩二,橹木智裕,阪井康能,加藤畅夫申请人:三得利株式会社