呫吨衍生物,其制备和用途的制作方法

专利名称：呫吨衍生物,其制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及呫吨衍生物，它用作药物组合物如免疫调节剂等。
免疫反应是一种细胞或体液反应，在自身/非自身辩别的基础上它能消除非自身。免疫系统是一种当外抗原包括各种传染性病原体侵入体内时体内进行的自身防御反应，并且免疫系统是一种使本身防御外敌的重要系统。这种免疫系统的损伤和过度反应对自身有害并引起各种疾病包括自身免疫疾病和变应性疾病。由这种免疫系统的损伤和过度反应引起的各种疾病可通过调节免疫反应而改善。
医疗技术的最近发展使得进行器官移植成为可能。体内的免疫反应妨碍器官移植，移植物的存活必须抑制免疫反应。免疫活性细胞参与炎症反应，过度免疫反应直接加重炎症反应。因此，各种慢性炎症疾病如类风湿性关节炎和肾炎可通过抑制免疫反应而改善。
当T细胞通过T细胞受体(下文缩写为TC R)辩认出用抗原呈递细胞呈递的抗原时，免疫反应就开始了，当T细胞通过识别抗原而活化时，T细胞开始产生细胞因子如白细胞介素-2(下文缩写为IL-2)并且增生。最近已清楚地了解到除了通过TCR约束递送的抗原特定信号外，T细胞的全活化需要从抗原呈递细胞中获得第二信号(称为共刺激信号)。通过TC R而无原刺激信号的抗原刺激不仅导致T细胞活化的抑制而且包含一种抗原特定的无反应状态(无反应性)，此时的T细胞甚至当它们受到TC R的抗原刺激和共刺激信号时仍不能被活化。当T细胞受到抗原刺激时，根据有或无共刺激信号，T细胞变成完全逆转状态，例如活化或无反应。
一种用于上述共刺激信号的分子B7/CD28配体受体受到特别的关注。B7表达在抗原呈递细胞或活化的B细胞的表面上，而CD28表达在T细胞的表面上，通过它们之间的相互作用，信号被传递到T细胞(AnnualReviewof Immunology，1993，11191-212)。已知B7包括两种分子例如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，人们假设由于它们在表面上的表达时间完全不同，因而它们之间的作用不同。与B7配体结合的受体不仅包括传递活化信号的CD28而且包括被认为能送递负信号的CTCA-4。表达在活化的T细胞上的CTLA-4被认为通过与B7结合导致T细胞的编程性细胞死亡。因而中止了免疫应答。现已报道了按一种次序CTLA-4与B7的结合活性强于CTLA-4与CD28的结合活性。这些分子是属于免疫球蛋白总科的蛋白质。
已经开始进行抑制这种共刺激信号的诱导对特定抗原的无反应的试验，对B7配体的抗体和CD28或CTLA-4加溶蛋白质已被试验用作抑制剂，因而得到所需的结果(Annual Review of Immunology，1993，11191-212)。
在此之前，低分子化合物如抑制活化免疫细胞的增生的抗代谢物以及被认为具有抑制各种细胞因子活性的甾族化合物被广泛用于免疫抑制。这些化合物具有较强的副作用，很难说它们是特异性地作用于免疫细胞。
最近发现环胞霉素A和FK506可作为抑制通过抗原刺激活化T细胞信号的药物，并且一般可用于器官移植的免疫抑制。尽管这些药物对免疫系统具有较高的特异性，但毒性相当大。
预期抑制共刺激信号的药物不仅具有免疫细胞的抑制作用而且对抗原特异性免疫应答具有抑制作用，即诱导对特定抗原的无反应状态的作用。由于对特定的抗原的过度免疫反应而不损伤体内的一般免疫反应，因此上述状态可能改善疾病，这对于器官移植的免疫抑制和变应性反应的抑制特别有利。用对共刺激分子的抗体抑制信号的试验，得到了预期的结果。因此，具有这种作用的低分子量化合物可用作开发新免疫治疗的抗原特异性免疫抑制剂。
在这种情况下，本发明人进行深入细致的研究，从而由微生物代谢产物得到抑制B7-1与CD28结合的药物。因此，本发明人成功地从培养物中分离出称为TA N-2421的新化合物，并发现本发明化合物不仅抑制B7-1与CD28的结合，而且抑制T细胞的B7-1依赖性活化。基于这些发现，本发明人进行了进一步研究，从而完成了本发明。
(1)如下通式表示的化合物或其盐
其中R1为可被酯化或酰胺化的羧基；R2为氢原子，羟基或可被取代的烃基；R3和R4相同或不同，并且为可被取代的羟基；R5和R6相同或不同，并且为氢原子或卤原子；R7为氢原子，硝基，卤原子，可被取代的烃基，可被取代的杂环基或可被取代的酰基；n为0-2的整数；Y为氧原子或两个氢原子；并且当n为0，R2可为下式表示的基团
其中符号的含义同上，(2)根据(1)的化合物，其中R7为氢原子或卤原子，(3)根据(1)的化合物，其中R2为-CH2(CHOH)m-R2′表示的基团，其中m为0或1，并且R2’为可被酯化或酰胺化的羧基或可被取代的羟基甲基；R7为氢原子；并且Y为氧原子，
(4)根据(1)的化合物，其中R2为(i)氢原子，(ii)羟基或(iii)可被选自下列基团的取代基取代的C1-19烃基，所述取代基选自(a)C1-8烷氧羰基羰基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(i)硝基，(j)卤素和(k)氧代；R3和R4可相同或不同，并且为可被下列基团取代的羟基(a)酰基或(b)可被取代的C1-10烷基；R7为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)可被选自下列基团的取代基取代的C1-19烃基，所述取代基选自(a)可被酯化或酰胺化的羧基，(b)可被酰化的羟基，(c)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(d)C1-6烷氧基，(e)氰基，(f)磺基，(g)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(h)硝基，(i)卤素和(j)氧代，(v)可被选自下列基团的取代基取代的5或6元杂环基(a)C1-6烷基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)硝基，(i)卤素和(j)氧代，或(vi)可被选自下列基团的取代基取代的酰基，所述取代基选自(a)C1-6烷基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(i)硝基，(j)卤素和(k)氧代，或其稠合的杂环基团，(5)根据(1)的化合物，其中R1为可被酯化的羧基；R2为(i)氢原子，(ii)羟基，(iii)可被选自下列基团的取代基取代的C1-10烷基，所述取代基选自(a)C1-8烷氧羰基羰基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-4烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(iv)可被羧基取代的C2-8链烯基，(v)可被选自下列基团的取代基取代的C7-19芳基烷基，所述取代基选自(a)氰基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)羟基，(d)硝基，(e)卤素和(f)5或6元含氮杂环基；R3和R4为(i)可被C1-7酰基取代的羟基或(ii)可被C1-6烷氧基取代的C1-10烷氧基；R7为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)c1-10烷基，(v)可被选自下列基团的取代基取代的C6-14芳基(a)C1-6烷基，(b)羧基，(c)C1-6烷氧基，(d)氨基，(e)硝基和(f)卤素，(vi)C1-6链烷酰基，或(vii)除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的5或6元杂环基或它与苯环稠合的杂环基，(6)根据(1)的化合物，其中R1为-COOR28表示的基团，其中R28为氢原子或可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基；R2为(i)氢原子，(ii)羟基，(iii)式-CH2(CHORb)m1COOR29表示的基团，其中m1为0或1，Rb为氢原子或C1-6链烷酰基，R29为氢原子或可被C1-6烷氧基，C1-6链烷酰氧基或C4-7环烷氧基羰氧基取代的C1-8烷基，(iv)式-CH2(CHOH)m2CONR30R31表示的基团，其中m2为0或1，R30和R31相同或不同，为氢原子或可被羧基、C1-6烷氧基或C2-5烷氧羰基取代的C1-8烷基，(v)式-CH2(CHOH)m3CONHS(＝O)2R32表示的基团，其中m3为0或1，R32为可被1-3个卤原子取代的C1-4烷基或可被C1-6烷基、硝基、C1-6烷氧基或卤素取代的C6-14芳基，(vi)式-CH2(CHOH)m4CONHOR33表示的基团，其中m4为0或1，R33为氢原子或C1-4烷基，(vii)式-CH2(CHOH)m5R34表示的基团，其中m5为0或1，R34为除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基，它可被羟基或氧代所取代，(viii)式-CH2(CHOH)m6-CH2OR35表示的基团，其中m6为0或1，R35为氢原子，C1-8烷基或C1-6链烷酰基，(ix)式-CH2(CHOH)m7-COCOOR36表示的基团，其中m7为0或1，R36为氢原子或C1-8烷基，(x)可被羧基取代的C2-8烷基，或(xi)可被如下基团取代的C7-19芳烷基羧基，氰基，卤素，硝基，羟基，氨基甲酰基，C2-5烷氧基羰基，或除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基；R3为式-OR37表示的基团，其中R37为氢原子，可被C1-6烷氧基或C1-6链烷酰基取代的C1-8烷基；R4为(i)式-OR38表示的基团，其中R38为(a)氢原子，(b)可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基，(c)C1-6链烷酰基或(d)C7-11芳酰基；或(ii)式-OCOOR39表示的基团，其中R39为C1-6烷基或C6-14芳基；以及R7为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)C1-8烷基，(v)可被卤素、羧基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氨基或硝基取代的C6-14芳基，(vi)C1-6链烷酰基，或(vii)除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基或它与6-8元碳环或6-8元杂环基稠合的杂环基，(7)根据(1)的化合物，其中R2为式-CH2COOR40表示的基团，其中R40为氢原子或可被C1-6烷氧基、C1-6链烷酰基氧基或C4-7环烷氧基羰氧基取代的C1-4烷基；R3和R4为羟基；R5和R6为氯原子；和R7为氢原子，硝基，溴原子或碘原子，(8)根据(1)的化合物，其中n为0或1，(9)根据(1)的化合物，其中Y为氧原子，(10)根据(1)的化合物，用下式表示
其中R51和R61相同或不同，为氢原子或氯原子，(11)根据(1)的化合物，用下式表示
其中R52和R62相同或不同，为氢原子或氯原子，(12)根据(1)的化合物，其中化合物为(1)2-(羧基甲基亚磺酰基)-5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-9H-占吨-1-羧酸甲酯，(2)2-(羧基甲基亚磺酰基)-5，7-二氯-3，8-二羟基-4-碘-6-甲基-9-氧代-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(3)5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-2-(新戊酰氧基甲氧基羰基甲硫基)-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(4)5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-2-(新戊酰氧基甲氧基羰基甲基亚磺酰基)-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，或(5)5，7-二氯-2-[1-(环己氧基羰氧基)乙氧羰基甲硫基]-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(13)制备根据(10)或(11)的化合物或其盐的方法，包括在介质中培养属于曲霉属的并且能够产生该化合物的微生物，产生化合物使其聚集在培养物中，然后收集该化合物，(14)产生根据(10)或(11)的化合物的微生物即土曲霉FL-67283菌株，(15)一种药物组合物，含有根据(1)的化合物或其盐，(16)抑制T-细胞信号转导的组合物，含有根据(1)的化合物或其盐，(17)根据(15)的药物组合物，它为免疫调节剂，(18)根据(17)的药物组合物，其中免疫调节剂为移植物排斥抑制剂或治疗变应性疾病，类风湿关节炎，自身免疫疾病，肾炎或糖尿病的组合物，(19)制备根据(1)的化合物或其盐的方法，所述化合物用如下通式表示
其中R2为氢原子或可被取代的烃基，R1为可被酯化或酰胺化的羧基；R3和R4相同或不同，为可被取代的羟基；R5和R6相同或不同，为氢原子或卤原子；R7为氢原子，硝基，卤原子，可被取代的烃基，可被取代的杂环基或可被取代的酰基；y为氧原子或两个氢原子；该方法包括使如下通式表示的化合物或其盐
其中各符号同上，进行还原反应，如果需要的话，接着进行引入烃基的反应，
(20)一种抑制哺乳动物T-细胞信号转导的方法，包括给哺乳动物施用有效量的根据(1)的化合物或其盐，(21)哺乳动物免疫调节的方法，包括给哺乳动物施用有效量的根据(1)的化合物或其盐，(22)治疗或预防哺乳动物的移植物排斥，变应性疾病，类风湿关节炎，自身免疫疾病，肾炎或糖尿病的方法，包括给哺乳动物施用有效量的根据(1)的化合物或其盐，(23)根据(1)的化合物或其盐用于制备T-细胞信号转导抑制剂的用途，(24)根据(1)的化合物或其盐用于制备免疫调节剂的用途，(25)根据(1)的化合物或其盐用于制备移植物排斥抑制剂或治疗变应性疾病，类风湿关节炎，自身免疫疾病，肾炎或糖尿病的药物组合物的用途，(26)一种筛选具有抑制或增强CD28与B7-1结合的活性的化合物或其盐的方法，包括将(1)当含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性的B7-1-Ig接触时，所得的CD28和B7-1-Ig之间的结合的量与(2)当含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性的B7-1-Ig和试验化合物接触时，所得的CD28和B7-1-Ig之间的结合的量进行比较，(27)一种筛选具有抑制IL-2产生的活性的化合物或其盐的方法，包括将(1)当含有B7-1的CHO-细胞或其细胞膜部分与T-细胞接触时，产生IL-2的量与(2)当含有B7-1的CHO-细胞或其细胞膜部分与T-细胞和试验化合物接触时，产生IL-2的量进行比较，(28)具有抑制或增强CD28与B7-1结合的活性的化合物或其盐，它是通过使用根据(26)的筛选方法得到的，(29)具有抑制IL-2产生的活性的化合物或其盐，它是通过使用根据(27)的筛选方法得到的，以及(30)用CD28-CHO-11(FERM BP-5431)表示的CHO细胞，用B7-1-CHO-22(FERM BP-5430)表示的CHO细胞或用sB7-1-Ig-CHO-20(FERM BP-5432)表示的CHO细胞。


图1表示CD28基因表达的质粒(p AKKO-CD28)构建的图解图，CD28表示CD28基因，dhfr表示二氢叶酸还原酶基因；Apr表示氨苄青霉素抵抗基因；polyA表示聚腺苷酸化信号。
图2表示克隆的CD28基因的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。
图3表示B7-1基因表达的质粒(pME-B7-1)构建的图解图，B7-1表示B7-1基因；Apr表示氨苄青霉素抵抗基因；polyA表示聚腺苷酸化信号。
图4表示克隆的B7-1基因的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。
图5表示可溶的B7-1-Ig-编码的基因表达的质粒(pB7-1-Ig)的构建的图解图，sB7-1-Ig表示可溶的B7-1-Ig基因，dhfr表示二氢叶酸还原酶基因；Apr表示氨苄青霉素抵抗基因；polyA表示聚腺苷酸化信号。
图6表示克隆的可溶性B7-1-Ig基因的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。
图7表示克隆的增溶B7-1基因的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列，续图6。
图8表示TAN-2421 A1的IR谱(用KBr片)。
图9表示TAN-2421 A1的13C NMR谱(75MHz，在DMSO-d6中，27℃)。
图10表示TAN-2421 B1的IR谱(用KBr片)。
图11表示TAN-2421 B1的13C NMR谱(75MHz，在DMSO-d6中，60℃)。
关于上述通式，R1表示的酯化的羧基可列举的是药物上可接受的酯化的羧基或在体内成为药物可接受的酯化的羧基。
可被酯化的羧基的实例为式-COOR8表示的基团，其中R8为氢原子或可被取代的烃基。
R8表示的烃基的实例为，C1-19烃基如(1)C1-10烷基(例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，己基，庚基，辛基等，优选C1-8烷基)，(2)C2-8链烯基(例如乙烯基，烯丙基，异丙烯基，1-丙烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，2-己烯基，2-辛烯基等，优选C2-6链烯基)，(3)C2-8炔基(例如乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，2-己炔基，2-辛炔基等，优选C2-6炔基)，(4)C3-6环烷基(例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基等)，(5)C6-14芳基(例如苯基，萘基等，在芳基环上任选具有C1-6烷基取代基)以及(6)C7-19芳烷基(例如苄基，苯乙基，二苯甲基，三苯甲基等)。在这些基团中，优选C1-8烷基，特别是C1-4烷基(例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基等)。
在这些烃基中的C1-10烷基、C2-8链烯基或C2-8炔基的取代基的实例为(1)可被1或2个选自下列基团的取代基取代的氨基(a)C1-10烷基(例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基等)，(b)C1-6链烷酰基(例如甲酰基，乙酰基，丙酰基，异丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，异戊酰基，新戊酰基，己酰基等)，(c)C7-11芳酰基(例如苯甲酰基，对甲苯酰基，萘甲酰基等)，(d)C2-7烷氧基羰基(例如甲氧基羰基，乙氧基羰基，丙氧基羰基，丁氧基羰基，叔丁氧基羰基等)，(e)C8-14芳烷氧基羰基(例如苄氧基羰基，苯乙基氧基羰基等)，(f)C1-6烷基磺酰基(例如甲基磺酰基，乙基磺酰基，丙基磺酰基等)和(g)C6-14芳基磺酰基(例如苯磺酰基，甲苯磺酰基等)，(2)可被选自下列基团的取代基取代的羟基(a)C1-6烷基，(b)C7-19芳烷基(例如苄基，苯乙基，二苯甲基等)，(c)C1-6链烷酰基，(d)C7-11芳酰基和(e)C4-7环烷氧基羰基(例如环己基氧基羰基等)，(3)羧基，(4)C2-5烷氧基羰基(例如甲氧基羰基，乙氧基羰基等)，(5)C8-14芳烷氧基羰基(例如苄氧基羰基等)，(6)氨基甲酰基，(7)硝基，(8)卤原子，(9)氰基，(10)氧代和(11)磺基。取代基的数目为大约1-3，在这些取代基中，优选可被C1-6烷基取代的羟基，更优选的实例是可被甲基或乙基取代的羟基。
C3-6环烷基、C6-14芳基或C7-19芳烷基的取代基的实例除了上述C1-10烷基的取代基外，还可以是被选自下列基团的取代基取代的C1-6烷基(a)卤素，(b)C1-6链烷酰基，(c)C7-11芳酰基，(d)C2-7烷氧基羰基，(e)C7-15芳氧基羰基，(f)C8-14芳烷氧基羰基，(g)C1-6烷基磺酰基，(h)C6-14芳基磺酰基，(i)羟基，(j)羧基，(k)硝基和(1)氰基。
R1表示的酰胺化的羧基可列举的是药物上可接受的酰胺化的羧基或在体内成为药物上可接受的酰胺化的羧基。酰胺化的羧基的实例为用式-CONR9R10表示的基团，其中R9和R10相同或不同，为氢原子或可被取代的烃基或可被取代的杂环基，R9和R10可与相邻的氮原子结合形成可被取代的含氮杂环基等。
R9和R10表示的可被取代的烃基与上述用R8表示的可被取代的烃基的定义相同，其中，烃基的优选实例为C1-8烷基，烃基的取代基的优选的实例为可被C1-4烷基，羧基和C2-5烷氧基羰基取代的羟基。
R9和R10表示的可被取代的杂环基的杂环基的实例为除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元，优选5或6元杂环基或它与6-8元碳环或与6-8元杂环基稠合的杂环基(例如，2-或3-噻吩基，2-或3-呋喃基，1-，2-或3-吡咯基，3-，4-或5-吡唑基，2-，4-或5-噻唑基，3-，4-或5-异噻唑基，2-，4-或5-噁唑基，3-，4-或5-异噁唑基，2-，4-或5-咪唑基，1，2，3-或1，2，4-三唑基，1H-或2H-四唑基，2-，3-或4-吡啶基，2-，4-或5-嘧啶基，3-或4-哒嗪基，喹啉基，异喹啉基，吲哚基，哌嗪基，吗啉基，2H-或4H-吡喃基，2-苯并[b]呋喃基等)。
杂环基的取代基的实例为(1)具有1-3个取代基的C1-6烷基，取代基选自(a)硝基，(b)卤原子和(C)C1-6烷氧基(例如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基等)，(2)具有1-4个取代基的C6-14芳基，取代基选自(a)硝基，(b)卤原子，(C)C1-6烷基和(d)C1-6烷氧基，(3)具有1-4个取代基的C7-13芳烷基，取代基选自(a)硝基，(b)卤原子，(C)C1-6烷基和(d)C1-6烷氧基，(4)可被下列基团取代的羟基，所述基团选自(a)C1-6烷基，(b)C7-13芳烷基，(c)C1-6链烷酰基和(d)C7-11芳酰基，(5)羧基，(6)C2-5烷氧基羰基，(7)C8-14芳烷氧基羰基，(8)氨基甲酰基，(9)硝基，(10)卤原子，(11)具有1-2个取代基的氨基，取代基选自(a)C1-10烷基，(b)C7-13芳烷基，(c)C1-6链烷酰基，(d)C7-11芳酰基，(e)C2-7烷氧基羰基，(f)C8-14芳烷氧基羰基，(g)C1-6烷基磺酰基和(h)C6-14芳基磺酰基，(12)氰基，(13)氧代和(14)磺基。取代基的数目为大约1-5。
R9和R10与相邻的氮原子一起结合形成的可被取代的含氮杂环基的含氮杂环基为除了碳原子外还含有1-4个选自氧、硫和氮原子的杂原子的5-8元，优选5或6元杂环基或它与6-8元碳环或与6-8元杂环基稠合的杂环基。
含氮杂环基的优选实例具体为(1)除了氮原子外还含有1-3个选自氧、硫和氮原子的杂原子的5元杂环基(例如吡咯烷-1-基，2-吡咯啉-1-基，1，3-二氮杂双环戊烷-1-基，1-氮杂-3-氧杂环戊烷-1-基，1-氮杂-3-硫杂环戊烷-1-基，吡唑-1-基，吡唑烷-1-基，3-吡唑啉-2-基，2-咪唑烷-1-基，1，2，3-三唑-1-基，1，2，3-三唑-2-基，1，2，4-三唑-1-基，四唑-1-基，四唑-2-基等)，(2)除了氮原子外还含有1或2个选自氧、硫和氮原子的杂原子的6元杂环基(例如哌啶子基，硫代吗啉代，吗啉代，哌嗪基，1，4-噁嗪-4-基，1，4-噻嗪-4-基等)，(3)除了氮原子外还含有1或2个选自氧、硫和氮原子的杂原子的二环或三环的稠合杂环基(例如1H-吲唑-1-基，嘌呤-7-基，吩噻嗪-10-基，吩噁嗪-10-基，吲哚-1-基等)。
在这些杂环基中，优选使用除了氮原子外还含有1或2个选自氧、硫和氮原子的杂原子的6元杂环基(例如哌啶子基，硫代吗啉代，吗啉代，哌嗪基，1，4-噁嗪-4-基，1，4-噻嗪-4-基等)。
这些杂环基的取代基的实例与R9和R10表示的可被取代的杂环基的取代基相同，取代基的数目为大约1-5。
R2表示的烃基的实例与R8表示的烃基相同，其中，优选C1-19烃基，更优选C1-10烷基，C2-8链烯基和C7-19芳烷基。更优选的实例为C1-8烷基和C7-19芳烷基，特别优选为C1-3烷基(例如甲基，乙基，丙基等)和苄基。
烃基的取代基的实例与R8表示的烃基的取代基的实例相同。另外，烃基的取代基的实例为(1)式-COOR11表示的基团，其中R11为可被取代的烃基，它代替C2-5烷氧基羰基和C8-14芳烷氧基羰基，(2)式-CONR12R13表示的基团，其中R12和R13相同或不同，表示氢原子，可被取代的烃基或可被取代的杂环基，并且R12和R13与相邻的氮原子结合形成含氮杂环基，(3)式-CONHS(＝O)2R14表示的基团，其中R14为可被取代的烃基，(4)式-CONHOR15表示的基团，其中R15为氢原子或可被取代的烃基，(5)可被取代的杂环基，(6)式-OR16表示的基团，其中R16为氢原子，可被取代的烃基或可被取代的酰基，它代替具有一个取代基的羟基，(7)式-COCOOR17表示的基团，其中R17表示氢原子或可被取代的烃基。
R11，R12，R13，R14，R15，R16，或R17表示的可被取代的烃基与R8表示的可被取代的烃基的定义相同。
R12或R13表示的可被取代的杂环基与R9或R10表示的可被取代的杂环基的定义相同，当R12和R13与相邻的氮原子结合形成含氮杂环基时的含氮杂环基与当R9和R10与相邻的氮原子结合形成含氮杂环基时的含氮杂环基的定义相同。
R16表示的可被取代的酰基的实例为C1-6酰基，酰基的优选实例为(1)C1-16链烷酰基(例如甲酰基，乙酰基，丙酰基，异丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，异戊酰基，新戊酰基，己酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基等)，(2)C3-6链烯酰基(例如丙烯酰基，甲基丙烯酰基，丁烯酰基，异丁烯酰基等)，(3)C4-7环烷羰基(例如环丙烷羰基，环丁烷羰基，环戊烷羰基，环己烷羰基等)，(4)C7-11芳酰基(例如苯甲酰基，萘甲酰基等)，(5)C8-13芳基链烷酰基(例如苯基乙酰基，苯基丙酰基，苯基丁酰基)，(6)C9-13芳基链烯酰基(例如肉桂酰基，阿托酰基等)，(7)C1-6烷基磺酰基(例如甲基磺酰基，乙基磺酰基，丙基磺酰基等)，(8)C6-14芳基磺酰基(例如苯磺酰基等)，(9)C1-6烷氧基羰基(例如甲氧基羰基，乙氧基羰基等)，(10)C6-12芳氧基羰基(例如苯氧基羰基，萘氧基羰基等)，(11)C7-12芳烷氧基羰基(例如苄氧基羰基等)等等。更优选的酰基的实例为C1-13酰基等如(1)C1-6链烷酰基(例如甲酰基，乙酰基，丙酰基，异丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，异戊酰基，新戊酰基，己酰基等)，(2)C3-6链烯酰基，(3)C4-7环烷羰基，(4)C7-11芳酰基，(5)C8-13芳基链烷酰基，(6)C9-13芳基链烯基酰基，(7)C1-6烷基磺酰基，(8)C6-14芳基磺酰基等。其中，优选使用C1-7酰基等如C1-6链烷酰基(例如C1-3链烷酰基如甲酰基，乙酰基，丙酰基，异丙酰基)和苯甲酰基。
作为酰基的取代基，可使用与R8表示的可被取代的烃基的取代基相同的取代基。取代基的数目为大约1-3。
用作R2表示的可被取代的烃基的取代基的可被取代的杂环基与R9或R10表示的可被取代的杂环基的取代基的定义相同。作为杂环基的取代基，可使用与R9和R10表示的可被取代的杂环基的取代基相同的取代基。取代基的数目为大约1-5。
在R2表示的烃基的这些取代基中，优选的实例为(1)C1-8烷氧基羰基羰基，(2)可被酯化的羧基，(3)可被酰胺化的羧基(例如可被下列基团取代的氨基甲酰基，所述基团选自(i)羟基，(ii)C1-6烷氧基，(iii)卤代-C1-6芳基磺酰基，(iv)C1-6烷基磺酰基，(v)可被卤素、硝基、C1-6烷基或C1-6烷氧基取代的C6-14芳基磺酰基，(vi)可被酯化的羧基取代的C1-6烷基和(vii)C1-6烷氧基-C1-8烷基等，(4)可被酰基化的羟基，(5)可被C1-10烷基、C1-6链烷酰基、C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(6)C1-6烷氧基，(7)氰基，(8)磺基，(9)5或6元杂环基(例如含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的5或6元杂环基)，它可被C1-6烷基、C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代所取代，(10)硝基，(11)卤原子，(12)C1-6烷基，(13)氧代等。
其他优选的实例为(1)式-COOR11’表示的基团，其中R11’为氢原子或可被C1-6烷氧基、C1-6链烷酰氧基或C4-7环烷氧基羰氧基取代的C1-8烷基，(2)式-CONR12’R13’表示的基团，其中R12’和R13’相同或不同，为氢原子或可被羧基、C1-6烷氧基或C2-5烷氧基羰基取代的C1-8烷基，(3)式-CONHS(＝O)2R14’表示的基团，其中R14’为可被1-3个卤原子任意取代的C1-4烷基，或可被C1-6烷基，硝基，C1-6烷氧基或卤素取代的C6-14芳基，(4)式-CONHOR15’表示的基团，其中R15’为氢原子或C1-4烷基，(5)式-OR16’表示的基团，其中R16’为氢原子，C1-8烷基或C1-6链烷酰基，(6)式-COCOOR17’表示的基团，其中R17’为氢原子或C1-8烷基，(7)除了碳原子外还含有1-4个选自氧、硫和氮原子的杂原子的3-8元杂环基，它可被C1-6烷基、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基、卤素、羟基或氧代所取代，(杂环基如1H-或2H-四唑基，5-羟基-4H-吡喃-4-酮-2-基等)，(8)可被C1-10烷基、C1-6链烷酰基、C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(9)C8-14芳烷氧基羰基，(10)硝基，(11)卤原子，(12)氰基，(13)氧代和(14)磺基。
R2表示的可被取代的烃基中，优选式-CH2(CHOH)mR2″表示的基团，其中m为0或1，R2″为可被酯化或酰胺化的羧基，可被取代的杂环基或可被取代的羟基甲基，更优选式-CH2(CHOH)mR2’表示的基团，其中m为0或1，R2’为可被酯化或酰胺化的羧基或可被取代的羟基甲基。
R2’或R2”表示的可被酯化或酰胺化的羧基的实例与R1表示的可被酯化或酰胺化的羧基相同。
R2”表示的可被取代的杂环基的实例与R9或R10表示的可被取代的杂环基相同。
R2”表示的可被取代的羟基甲基的实例为下式表示的基团-CH2ORa其中Ra为氢原子，可被取代的烃基或可被取代的酰基等。
Ra表示的可被取代的烃基的实例与R8表示的可被取代的烃基相同，作为烃基，例如优选C1-8烷基等。
Ra表示的可被取代的酰基的实例与R16表示的可被取代的酰基相同，其中，优选使用C1-6链烷酰基等。
作为R2表示的可被取代的烃基，例如优选(1)式-CH2(CHORb)m1COOR18表示的基团，其中m1为0或1，Rb为氢原子或C1-6链烷酰基，R18为氢原子或可被取代的烃基，(2)式-CH2(CHOH)m2CONR19R20表示的基团，其中m2为0或1，R19和R20相同或不同，为氢原子，可被取代的烃基或可被取代的杂环基，和R19和R20与相邻的氮原子结合形成含氮杂环基，(3)式-CH2(CHOH)m3CONHS(＝0)2R21表示的基团，其中m3为0或1，R21为可被取代的烃基，(4)式-CH2(CHOH)m4CONHOR22表示的基团，其中m4为0或1，R22为氢原子或可被取代的烃基，(5)式-CH2(CHOH)m5R23表示的基团，其中m5为0或1，R23为可被任意取代的杂环基，(6)式-CH2(CHOH)m6CH2OR24表示的基团，其中m6为0或1，R24为氢原子，可被取代的烃基或可被取代的酰基，(7)式-CH2(CHOH)m7COCOOR25表示的基团，其中m7为0或1，R25为氢原子或可被取代的烃基，等等。
另外，还优选(8)可被式-COOR18’表示的基团取代的C2-8烷基，其中R18′为氢原子或C1-8烷基，(9)C7-19芳烷基(特别是苄基)，它可被羧基、氰基、羟基、氨基甲酰基、C2-5烷氧基羰基或可被取代的杂环基所取代。
R18，R19，R20，R21，R22，R24，或R25表示的可被取代的烃基的实例与R8表示的可被取代的烃基的实例相同。
R19，R20或R23表示的可被取代的杂环基的实例与R9或R10表示的可被取代的杂环基的实例相同。
R19和R20与相邻的氮原子结合形成的含氮杂环基的实例与R9和R10与相邻的氮原子结合形成的含氮杂环基的实例相同。
用作C7-19芳烷基的取代基的可被取代的杂环基的实例与R9或R10表示的可被取代的杂环基相同。
R24表示的可被取代的酰基的实例与R16表示的酰基的实例相同，其中，优选C1-6链烷酰基特别是C1-4链烷酰基(例如甲酰基，乙酰基，丙酰基，异丙酰基等)，作为这些酰基的取代基，可使用与R8表示的烃基的取代基的同样的取代基。
R3或R4表示的可被取代的羟基的实例为式-OR26表示的基团，其中R26为氢原子，可被取代的烃基或可被取代的酰基，式-OCOOR27表示的基团，其中R27为可被取代的烃基等。
R26或R27表示的可被任意取代的烃基的实例与R8表示的可被取代的烃基相同，作为烃基，例如优选使用C1-8烷基和C6-14芳基。作为烃基的取代基，例如优选C1-6烷氧基等。
R26表示的可被取代的酰基的实例与R16表示的可被任意取代的酰基相同，作为酰基，例如优选使用C1-6链烷酰基，C7-11芳酰基(例如苯甲酰基等)等。更优选的实例为C1-7酰基如C1-6链烷酰基和苯甲酰基等。
作为在R3的-OR26中的R26表示的烃基，优选C1-8烷基特别是C1-3烷基等，作为其取代基，例如优选C1-6烷氧基(例如甲氧基等)等。
作为在R3的-OR26中的R26表示的酰基，优选C1-6链烷酰基等。
作为在R4的-OR26中的R26表示的烃基，例如优选C1-8烷基或C6-14芳基，特别优选C1-3烷基或苯基。
作为在R4的-OR26中的R26表示的酰基，例如优选C1-6链烷酰基，C7-11芳酰基，特别是C1-4链烷酰基，苯甲酰基等，作为其取代基，例如优选C1-3烷基(例如甲基等)等。
作为在R3或R4的-OCOOR27中的R27表示的烃基，例如优选C1-8烷基或C6-14芳基，特别优选C1-3烷基或苯基。
R5，R6或R7表示的卤原子的实例为氟原子，氯原子，溴原子和碘原子等，其中对于R5和R6来说，优选氯原子或溴原子，对于R7来说，优选溴原子或碘原子。
R7表示的可被取代的烃基的实例与R8表示的可被取代的烃基相同，作为烃基，优选C1-19烃基。更优选的实例是C1-8烷基，C6-14芳基等，特别优选C6-14芳基。作为烃基的取代基，例如优选卤原子，羧基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，氨基和硝基。
R7表示的可被取代的杂环基的实例与R9或R10表示的可被取代的杂环基相同，例如，优选2-或3-噻吩基和2-苯并[b]呋喃基。
R7表示的可被取代的酰基的实例与R16表示的可被取代的酰基相同，作为酰基，例如优选C1-6链烷酰基等。
在上述基团中，R1的优选实例为式-COOR28表示的基团，其中R28为氢原子或可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基，等等。其中，优选使用可被C1-3烷基(特别是甲基等)酯化的羧基。
R2的优选实例为(i)氢原子，(ii)羟基，(iii)可被下列基团取代的C1-19烃基，所述基团选自(a)C1-8烷氧基羰基羰基，(b)可被酯化或可被酰胺化的羧基，(c)可被酰基化的羟基，(d)可被C1-10烷基、C1-6链烷酰基、C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被C1-6烷基、C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代所取代的5或6元杂环基，(i)硝基，(j)卤素，(k)氧代等。
R2的更优选实例为(i)氢原子，(ii)羟基，(iii)可被下列基团取代的C1-10烷基，所述基团选自(a)C1-8烷氧基羰基羰基，(b)可被酯化或可被酰胺化的羧基，(c)可被酰基化的羟基，(d)可被C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被羟基或氧代所取代的5或6元杂环基(例如含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的5或6元杂环基等)，(iv)可被羧基取代的C2-8链烯基，(v)可被选自下列的基团取代的C7-19芳烷基，所述基团选自(a)氰基，(b)可被酯化或可被酰胺化的羧基，(c)羟基，(d)硝基，(e)卤素和(f)5或6元含氮杂环基等。
以及，R2的其他优选实例为(1)氢原子，(2)羟基，(3)式-CH2(CHORb)m1COOR29表示的基团，其中m1为0或1，Rb为氢原子或C1-6链烷酰基，R29为氢原子或可被C1-6烷氧基、C1-6链烷酰氧基或C4-7环烷氧基羰氧基取代的C1-8烷基，(4)式-CH2(CHOH)m2CONR30R31表示的基团，其中m2为0或1，R30和R31相同或不同，为氢原子，或可被羧基、C1-6烷氧基或C2-5烷氧羰基取代的C1-8烷基，(5)式-CH2(CHOH)m3CONHS(＝0)2R32表示的基团，其中m3为0或1，R32为可被1-3个卤原子取代的C1-4烷基，或可被C1-6烷基、硝基、C1-6烷氧基或卤素取代的C6-14芳基，(6)式-CH2(CHOH)m4CONHOR33表示的基团，其中m4为0或1，R33为氢原子或C1-4烷基，(7)式-CH2(CHOH)m5R34表示的基团，其中m5为0或1，R34为除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基，它可被羟基或氧代所取代，(如1H-或2H-四唑基，5-羟基-4H-吡喃-4-酮-2-基等)，(8)式-CH2(CHOH)m6CH2OR35表示的基团，其中m6为0或1，R35为氢原子，C1-8烷基或C1-6链烷酰基，(9)式-CH2(CHOH)m7COCOOR36表示的基团，其中m7为0或1，R36为氢原子或C1-8烷基，(10)可被羧基等取代的C2-8烷基等，以及(11)C7-19芳烷基(特别是苄基)，它可被羧基、氰基、羟基、氨基甲酰基、C2-5烷氧基羰基或除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基(例如2-四唑基等)所取代，等等。
R3和R4的优选实例为可被下列基团取代的羟基(1)酰基或(2)可被取代的C1-10烷基，更优选的实例为(i)可被C1-7酰基取代的羟基或(ii)可被C1-6烷氧基取代的C1-10烷氧基。
R3和R4的更优选实例为(i)式-OR26’表示的基团，其中R26′为氢原子，可被C1-6烷氧基、C1-6链烷酰基或C7-11芳酰基取代的C1-8烷基，(ii)式-OCOOR27’表示的基团，其中R27’为C1-8烷基或C6-14芳基，等等。
R3的更优选实例为式-OR37表示的基团，其中R37为氢原子，可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基或C1-6链烷酰基等。
R4的更优选实例为(i)式-OR38表示的基团，其中R38为氢原子，可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基、C1-6链烷酰基或C7-11芳酰基，(ii)式-OCOOR39表示的基团，其中R39为C1-6烷基或C6-14芳基，等等。
对于R3和R4，优选使用羟基、甲氧基、乙酰基、丙酰氧基、异丙酰氧基和丁酰氧基，特别优选羟基。
R5和R6的优选实例为氢原子，氯原子和溴原子，特别优选氯原子和溴原子，尤其特别优选当R5和R6同时表示氯原子的情况。
R7的优选实例为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)可被选自下列基团的取代基取代的C1-19烃基，所述取代基选自(a)可被酯化或酰胺化的羧基，(b)可被酰化的羟基，(c)可被C1-6烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(d)C1-6烷氧基，(e)氰基，(f)磺基，(g)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(h)硝基，(i)卤素和(j)氧代，(v)可被选自下列基团的取代基取代的5或6元杂环基(a)C1-6烷基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)硝基，(i)卤素和(j)氧代，或(vi)可被选自下列基团的取代基取代的酰基，所述取代基选自(a)C1-6烷基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(i)硝基，(j)卤素和(k)氧代，或其稠合的杂环基团，等等。
R7的更优选的实例为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)C1-8烷基，(v)可被卤素、羧基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氨基或硝基取代的C6-14芳基，(vi)C1-6链烷酰基，或(vii)除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的3-8元杂环基或它与6-8元碳环(例如苯环等)或与6-8元杂环基稠合的杂环基等。
在上述基团中，优选氢原子、硝基，溴原子和碘原子，特别优选R7为硝基、溴原子、碘原子。
作为n，特别优选0或1。
作为Y，特别优选氧原子。
当n为0时，R2可为下式表示的基团

其中各符号定义同上。
R1，R3，R4，R5，R6，R7和Y的优选实例与上述的实例相同。
R1的更优选的实例为可被C1-8烷基酯化的羧基等，R3和R4的更优选的实例为羟基等，R5和R6的更优选的实例为氢原子或卤原子如氯原子，R7的更优选的实例为氢原子等，Y的更优选的实例为氧原子等。
本发明化合物(I)的优选实例包括这些代表性符号的优选实例所列举的基团结合的所有化合物。
本发明化合物(I)的更优选实例为化合物(Ia)、化合物(Ib)、化合物(Ic)、化合物(Id)、化合物(Ie)等等。[化合物(Ia)]R1为可被酯化或酰胺化的羧基；
R2为(i)氢原子，(ii)羟基或(iii)可被下列基团取代的C1-19烃基，所述基团选自(a)C1-8烷氧基羰基羰基，(b)可被酯化或可被酰胺化的羧基，(c)可被酰基化的羟基，(d)可被C1-10烷基、C1-6链烷酰基、C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被C1-6烷基、C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代所取代的5或6元杂环基，(i)硝基，(j)卤素，(k)氧代；R3和R4相同或不同，为可被下列基团取代的羟基(a)酰基或(b)可被取代的C1-10烷基，R5和R6相同或不同，为氢原子或卤原子；R7为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)可被选自下列基团的取代基取代的C1-19烃基，所述取代基选自(a)可被酯化或酰胺化的羧基，(b)可被酰化的羟基，(c)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(d)C1-6烷氧基，(e)氰基，(f)磺基，(g)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(h)硝基，(i)卤素和(j)氧代，(v)可被选自下列基团的取代基取代的5或6元杂环基(a)C1-6烷基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)硝基，(i)卤素和(j)氧代，或稠合的此杂环基，或(vi)可被选自下列基团的取代基取代的酰基，所述取代基选自(a)C1-6烷基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(i)硝基，(j)卤素和(k)氧代；当n为0，R2可用下式基团表示
R1为可被酯化的羧基；R2为(i)氢原子，(ii)羟基，(iii)可被选自下列基团取代的C1-10烃基，所述基团选自(a)C1-8烷氧基羰基羰基，(b)可被酯化或可被酰胺化的羧基，(c)可被酰基化的羟基，(d)可被C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被羟基或氧代所取代的5或6元杂环基(例如含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的5或6元杂环基)，(iv)可被羧基取代的C2-8链烯基，(v)可被选自下列基团取代的C7-19芳烷基，所述基团选自(a)氰基，(b)可被酯化或可被酰胺化的羧基，(c)羟基，(d)硝基，(e)卤素和(f)5或6元含氮杂环基，R3和R4相同或不同，为(i)可被C1-7酰基取代的羟基或(ii)可被C1-6烷氧基取代的C1-10烷氧基，R5和R6相同或不同，为氢原子或卤原子；R7为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)C1-10烷基，(v)可被选自下列基团的取代基取代的C6-14芳基(a)C1-6烷基，(b)羧基，(c)C1-6烷氧基，(d)氨基，(e)硝基和(f)卤素，(vi)C1-6链烷酰基，或(vii)除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的5或6元杂环基或它与苯环稠合的杂环基；当n为0时，R2可用下式基团表示
R1为式-COOR28表示的基团，其中R28为氢原子或可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基；R2为(1)氢原子，(2)羟基，(3)式-CH2(CHORb)m1COOR29表示的基团，其中m1为0或1，Rb为氢原子或C1-6链烷酰基，R29为氢原子或可被C1-6烷氧基、C1-6链烷酰氧基或C4-7环烷氧基羰氧基取代的C1-8烷基，(4)式-CH2(CHOH)m2CONR30R31表示的基团，其中m2为0或1，R30和R31相同或不同，为氢原子，可被羧基、C1-6烷氧基或C2-5烷氧羰基取代的C1-8烷基，(5)式-CH2(CHOH)m3CONHS(＝0)2R32表示的基团，其中m3为0或1，R32为可被1-3个卤原子所取代的C1-4烷基，或可被C1-6烷基、硝基、C1-6烷氧基或卤素取代的C6-14芳基，(6)式-CH2(CHOH)m4CONHOR33表示的基团，其中m4为0或1，R33为氢原子或C1-4烷基，(7)式-CH2(CHOH)m5R34表示的基团，其中m5为0或1，R34为除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基(如2-吡啶基，1H-或2H-四唑基，5-羟基-4H-吡喃-4-酮-2-基等)，它可被羟基或氧代所取代，(8)式-CH2(CHOH)m6CH2OR35表示的基团，其中m6为0或1，R35为氢原子，C1-8烷基或C1-6链烷酰基，(9)式-CH2(CHOH)m7COCOOR36表示的基团，其中m7为0或1，R36为氢原子或C1-8烷基，(10)可被羧基取代的C2-8烷基，(11)C7-19芳烷基，它可被羧基、氰基、卤素、硝基、羟基、氨基甲酰基、C2-5烷氧基羰基或除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基(例如1H-或2H-四唑基等)所取代；R3为式-OR37表示的基团，其中R37为(i)氢原子，(ii)可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基或(iii)C1-6链烷酰基，R4为(i)式-OR38表示的基团，其中R38为(i)氢原子，(ii)可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基，(iii)C1-6链烷酰基或(iv)C7-11芳酰基，或(2)式-OCOOR39表示的基团，其中R39为C1-6烷基或C6-14芳基；R5和R6相同或不同，为氢原子或卤原子；R7为(1)氢原子，(2)硝基，(3)卤原子，(4)C1-8烷基，(5)可被卤素、羧基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氨基或硝基取代的C6-14芳基，(6)C1-6链烷酰基或(7)除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基(例如2-或3-噻吩基等)或它与6-8元碳环(例如苯环)或与杂环稠合的杂环基(例如2-苯并[b]呋喃基等)，当n为0时，R2可用下式基团表示时
R1为可被甲基酯化的羧基等；R2为式-CH2COOR40表示的基团，其中R40为氢原子或C1-4烷基(例如甲基，乙基等)，它可被C1-6烷氧基、C1-6链烷酰基氧基或C4-7环烷氧基羰基氧基取代；R3和R4为羟基；R5和R6为氯原子；以及R7为氢原子，硝基，溴原子或碘原子；当n为0时，R2可为下式表示的基团
(1)2-(羧基甲基亚磺酰基)-5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(2)2-(羧基甲基亚磺酰基)-5，7-二氯-3，8-二羟基-4-碘-6-甲基-9-氧代-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(3)5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-2-(新戊酰氧基甲氧基羰基甲硫基)-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(4)5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-2-(新戊酰氧基甲氧基羰基甲基亚磺酰基)-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，或(5)5，7-二氯-2-[1-(环己氧基羰氧基)乙氧羰基甲硫基]-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-9H-呫吨-1-羧酸甲酯。
本发明的筛选方法包括(1)一种筛选具有抑制或增强CD28与B7-1结合的活性的化合物或其盐的方法，它包括将(i)当含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性的B7-1-Ig接触时，所得的CD28和B7-1-Ig之间的结合的量与(ii)当含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性的B7-1-Ig和试验化合物接触时，所得的CD28和B7-1-Ig之间的结合的量进行比较，(2)一种筛选具有抑制IL-2产生的活性的化合物或其盐的方法，它包括将(i)当含有B7-1的CHO-细胞或其细胞膜部分与T-细胞(特别是给T细胞的第一信号是由抗-CD3抗体给出)接触时，产生IL-2的量与(ii)当含有B7-1的CHO-细胞或其细胞膜部分与T-细胞(特别是给T细胞的第一信号是由抗-CD3抗体给出的)和试验化合物接触时产生IL-2的量进行比较。
作为用于本发明生产TAN-2421A1、A2、A3、A4、B1、B2和/或B3的微生物，例如可以使用任何微生物，只要它属于曲霉属并且能够制备TAN-2421A1、A2、A3、A4、B1、B2和/或B3。这些微生物包括FL-67283菌株，即一种从印度土壤中新分离出的霉菌。该菌株具有下列性质(I)培养性质(1)麦芽提取琼脂介质菌落在24℃下生长适中，2周后菌落直径达到25mm，表面平整，在其中心包含有稍微升高的类似丝绒的菌丝体以及有规则的外边缘。空气中的菌丝体生长良好，但分生孢子的生成较差。从中心到中间部分为红棕色至浅红棕色，外周为乳白色。从背面的中心到中间部分为深黄棕色至浅黄棕色，没有可溶性色素生成。
(2)马铃薯-葡萄糖琼脂介质菌落在24℃下生长良好，2周后菌落直径达到46-50mm，表面平整，在其中心包含有稍微升高的类似丝绒的菌丝体，中心有一洞并且迅速从中心扩展至四周，外边缘稍微无规则。空气中的菌丝体生长良好，但稍后才生成分生孢子。从中心到中间部分为红棕色，外周为乳白色。从背面的中心为深红棕色至红棕色，中心部分为浅红棕色，四周为浅黄棕色，没有可溶性色素生成，菌株在pH为3-12下生长，生长温度为11-44℃，最佳温度为24-30℃，菌株在37℃仍可生长。
(3)Czapek琼脂介质菌落在24℃下生长适中，2周后菌落直径达到35-40mm，在表面中心包含有稍微升高的类似丝绒的又有点象羊毛的菌丝体以及有规则的外边缘。空气中的菌丝体生长适中，但分生孢子的生成较差。从中心到中间部分为浅黄棕色，外周为乳白色。从背面的中心到中间部分为红棕色至浅红黄棕色，没有可溶性色素生成。
(4)燕麦琼脂介质菌落在24℃下生长良好，2周后菌落直径达到60-65mm，表面平整，包含有类似丝绒的菌丝体，中心有一洞并且迅速而很薄地从中心扩展至四周，外边缘稍微无规则。空气中的菌丝体生长以及分生孢子的生成良好。从中心到中间部分为红棕色至浅红棕色，外周为浅黄棕色。背面的中心部分为黄棕色，四周至中心为浅黄棕色至乳白色。没有可溶性色素生成。
(II)形态特征分生孢子圆柱形，大小为100-180μm×40-60μm；分生孢子梗它在空气中的菌丝体上生成，大小为60-100μm×6.0-8.0μm；可识别出中隔墙。它有稍微弯曲的平整的表面，其顶端变厚形成小泡。
小泡半球形，直径为15-20μm，上半部有梗基；梗基圆柱形，大小为4.5-5.0μm×1.5-2.0μm；瓶梗瓶形，大小为5-6μm×1.2-1.8μm；其上有平滑的表面，在梗基上簇生有2-4个瓶梗；分生孢子球形或半球形，大小为1.6-2.0μm×1.3-1.7μm；连接在一起，有平滑的表面；根据上述各种性质和参考在“Separation，Cultivation and Identification of Fungi”(D.Malloch著，S.Udagawa翻译成日文，1983，Ishiyaku Publishers)的第51页中描述的鉴定关键词表，很明显这种菌株属于曲霉属，这是因为孢子包括一个细胞，无色或浅色的分生孢子和分生孢子梗，以及具有形成瓶状梗的小泡的分生孢子梗。
关于曲霉属真菌的各种属性见K.B.Paper等人的“THE GENUSAspergillus”(1965，THE Williams & Wilkins Company)中所述，据认为这种菌株属于土曲霉组，这是因为泡囊上有梗基形成且其上还有瓶形梗形成，分子孢子为棕黄色圆柱形，分子孢子梗为无色。
因此，此菌株可确定为土曲霉FL-67283株。
按照布达佩斯条约，该菌株被保藏在NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology(NIBH)，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry，保藏号FERM BP-5433。
本发明化合物TAN-2421 A1，A2，A3，A4，B1，B2和/或B3可按下述产生在培养基上不仅培养此菌株，而且还培养能产生本发明化合物的菌株突变体(采用本领域已知方法，包括基因操作技术，由该菌株衍生得到)，以及培养能产生相关化合物的微生物，在培养液中产生本发明化合物并积累；收集本发明化合物。
用于培养生产本发明化合物TAN-2421A1，A2，A3，A4，B1，B2和/或B3的真菌的培养基可以是液体或固体，只要含有可有用的营养源即可。在大规模培养时，优选使用液体培养基。
根据需要，培养基中可补加有碳源、氮源、无机物以及可由生产真菌同化的痕量营养源。碳源包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、环糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、油和脂肪(如棉籽油、(大)豆油、猪油、鸡油等)，n-石蜡等等。氮源包括肉羹、酵母提取物、干酵母、大豆粉、玉米浸渍液、胨、绿豆粉、棉籽粉、马铃薯糊、花生粗粉、乳化黑色油废糖浆(black strap molasses)、尿素和铵盐(如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、乙酸铵等)等等。
根据需要，可以使用包含钠、钾、钙、镁的盐；金属盐，所述金属如铁、锰、锌、钴和镍；磷酸盐或硼酸盐；以及有机酸盐，如乙酸盐和丙酸盐。培养基中也可掺入氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸等)，肽(如二肽、三肽等)，维生素(如B1、B2、烟酸、B12、C等)以及核酸(如嘌呤、嘧啶、它们的衍生物等)。可以加入无机酸、有机酸、碱、缓冲液和其它添加物来调节培养液的PH值。为了消泡，也可以加入适当量的油和脂肪、去污剂和其它添加物。
至于培养方式，可使用如静止培养、振荡培养、通气培养等方式。在大规模培养时，优选使用所谓的深度通气培养。培养条件可根据培养基的状态和组成、菌株种类、培养方式等的不同而改变。优选选择的条件是温度为约12-44℃和起始pH值为约5-9。在培养的中间阶段，特别优选温度为约14-30℃和起始pH为约6-8。尽管培养时间也随着上述各种条件而改变，但优选培养至各种生物活性浓度达到最大。在振荡培养或通气培养的情况下，此时需要的时间一般为约1-14天。
从培养物中收集所需要化合物TAN-2421A1，A2，A3，A4，B1，B2和/或B3的方法见下文所述。由于这些化合物为酸性脂溶性的，故可使用利用这种特性的普通方法。在调节培养液或培养物滤液至酸性pH后，向提取物TAN-2421A1，A2，A3，A4，B1，B2和/或B3中加入与水不混溶的有机溶剂如卤代烃(如二氯甲烷等)、酯类(如乙酸乙酯等)、酮类(如甲异丁酮等)或醇类(如异丁醇等)。当用碱水溶液提取所形成的有机层时，所需产物溶于水层内。调节所得水层的pH至酸性，再用上述有机溶剂提取，水洗所形成的有机层，接着浓缩，得到含有TAN-2421A1，A2，A3，A4，B1，B2和/或B3的产物。
为获得纯净TAN-2421A1，A2，A3，A4，B1，B2或B3，最好使用各种已知色谱技术纯化粗产物。适用的载体包括对各种化合物具有不同吸收性的载体，如活性炭、硅胶、微晶纤维素、吸收型树脂等，或凝胶过滤用的载体等等。为从这些载体上洗脱出所需化合物，可使用各种单一溶剂或以适当比例混合的溶剂，例如有机溶剂(如卤代烃如二氯甲烷、氯仿等；芳烃如甲苯等；酯类如乙酸乙酯等；酮类如丙酮等；醇类如甲醇，乙醇，异丙醇等；以及腈类如乙腈等)，有机酸(如乙酸，甲酸等)，水溶液[如水，稀碱水溶液(如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、氨水等)，稀酸水溶液(如盐酸、乙酸、甲酸、磷酸、三氟乙酸等)，以及含水稀盐溶液(如盐水、乙酸缓冲液、磷酸缓冲液等)]，其组成依赖于载体的种类和性质。
更具体地讲，优选使用的载体如色谱用活性炭(Takeda ChemicalIndustries生产)、Kieselgel 60(Merck(German)生产)、微晶纤维素[如Avicel(Asahi Chemical生产)，Funacel(Funakoshi Pharmaceutical生产)等]、吸收型树脂[如Diaion HP-20或SP-207(Mitsubishi Chemical Industries生产)和Amberlite XAD-I或II(Rohm & Haas生产，USA)，等]，以及凝胶过滤用载体[如Sephadex LH-20(Pharmacia生产，Sweden)，在某些情况下，可优选使用高效液相色谱(HPLC)纯化各化合物。使用此方法时，最好使用十八烷基硅烷(ODS)载体、聚合物载体和硅胶载体。在ODS载体情况下，可使用YMC凝胶(YMC生产)或TSK凝胶(Toyo Soda Manufacturing生产)等等。在聚合物载体情况下，可使用通过向聚合物中，引入十八烷基而制得ODP(Asahi Chemical生产)或使用通过向聚合物中引入聚胺所制得的NH2P(Asahi Chemical生产)等。较有利的是使用甲醇或乙腈和水或含水稀盐溶液或酸(如盐酸、三氟乙酸、乙酸、甲酸等)混合溶剂作为流动相。
由于TAN-2421A1，A2，A3，A4，B1，B2和/或B3为酸性物质，它们也可以以碱加成盐形式制得，如碱金属盐如钠盐、钾盐等，以及碱土金属盐如钙盐、镁盐等。
下文所述实施例2和3中得到的TAN-2421A1(化合物1)，A2(化合物2)，A3(化合物3)，A4(化合物4)，B1(化合物5)，B2(化合物6)和B3(化合物7)的结构通过详细分析物化数据和NMR数据确定，见表1和表2中所示。表1


<p>表2<

生产上述化合物[I]或其盐的方法见下文所述。
在以后所述的反应中，关于不参与反应的官能团的保护、所使用的保护基、保护基的消去等，根据需要可选择本领域公知的保护基或本领域公知的方式进行。
本文中经常提到的试剂缩写如下DCC二环己基碳化二亚胺WSC1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(水溶性碳化二亚胺盐酸盐)DICN，N’-二异丙基碳化二亚胺HOBT1-羟基苯并三唑THF四氢呋喃DMFN，N-二甲基甲酰胺TEA三乙胺TFA三氟乙酸其中R1为酯化羧基的通式[I]化合物或其盐可通过将其中R1为羧基的通式[I]化合物或其盐进行酯化反应而制得。酯化反应可通过下面所述的本领域公知方法进行。1)原料化合物与重氮烷烃(如重氮甲烷、苯基重氮甲烷、二苯基重氮甲烷等)反应。2)原料化合物与活化的烷基卤(如甲基碘、苄基溴、氯甲基甲基醚等)反应。3)原料化合物与醇(如甲醇，乙醇，苯甲醇等)在酸催化剂或缩合剂存在下反应。至于酸催化剂，例如可使用盐酸、硫酸、樟脑磺酸等。至于缩合剂，例如可使用DCC、WSC、DIC等。4)衍生原料化合物成活性酯，然后与醇(如甲醇、乙醇、苯甲醇等)反应，至于活性酯，例如可以使用与1-羟基-1H-2-吡啶酮、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯邻二甲酰亚胺、HOBT等形成的酯。5)原料化合物与酰基卤(如氯甲酸乙酯、氯甲酸苄酯等)反应，给出酸酐，然后与醇(如甲醇，乙醇，苯甲醇等)反应。6)由原料化合物产生酰基卤(如酰基氯、酰基溴等)，然后与醇(如甲醇、乙醇、苯甲醇等)反应。
此反应也可以在碱存在下进行。适用的碱包括叔胺(如三甲胺、三乙胺、三丙胺、N-甲基哌啶、N-甲基吡咯烷、环己基二甲胺、N-甲基吗啉等)，仲胺(如二正丁胺、二异丁胺、二环己胺等)，芳族叔胺(如吡啶、卢剔啶、可力丁、4-二甲基氨基吡啶等)，碱金属氢氧化物(如氢氧化钠、氢氧化钾等)，碱金属碳酸盐(如碳酸钠、碳酸钾等)，碱金属碳酸氢盐(如碳酸氢钠等)，以及碱土金属氢氧化物(如氢氧化钙等)。
此方法通常是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例包括酰胺(如甲酰胺、DMF、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等)，亚砜类(如二甲亚砜等)，芳族碱(如吡啶等)，卤代烃(如氯仿、二氯甲烷等)，醚类(如乙醚、四氢呋喃、二噁烷等)，腈类(如乙腈等)，酯类(如乙酸乙酯、甲酸乙酯等)，脂族或芳族烃类(如己烷、苯、甲苯等)，酮类(如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等)等等。
用作反应物的醇的过量部分可用作溶剂。
各种溶剂可以以适当比例混合。
反应温度通常为约-50至150℃，优选约-30至80℃，不过反应不受此条件限制，只要反应能进行即可。反应时间通常为数分钟至数小时，这取决于所用的原料、碱、反应温度和溶剂种类。
其中R1为酰胺化羧基的通式[1]化合物或其蓾可通过使其中R1为羧基的通式[I]化合物进行酰胺化反应而生成。
酰胺化反应可以通过，例如，使其中R1为羧基的化合物(以下简称作“羧酸”)或其活性衍生物与下述通式化合物或其盐反应来进行HN-(R9)R10[III]其中R9和R10的定义同上有关羧酸活性衍生物，例如，可以使用酰基卤和活性酯。这种活性衍生物具体说明如下1)酰基卤酰基卤的实例包括酰基氯和酰基溴等。
2)活性酯活性酯的实例包括酯如甲酯、乙酯、甲氧甲醌、烯丙酯、4-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、三氯苯酯、五氯苯酯、十四烷基(mecyl)苯酯等，以及与如1-羟基-1H-2-吡啶酮、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBT形成的酯等。
当羧酸与化合物[III]或其盐直接反应时，可以使用缩合剂，如DCC、WSC DIC等。这些缩合剂可用于合成活性酯如1-羟基-1H-2-吡啶酮、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBT等。
此反应可以在碱存在下进行。碱的实例与上文所述相同。
在此方法中，相对于每摩尔羧酸或其活性衍生物，通常使用1摩尔化合物[III]或其盐，但也可以过量使用，只要不影响反应。当使用碱时，相对于每摩尔羧酸或其活性衍生物，其用量一般为1至5mol，优选约1至3mol，这取决于所用的原料化合物、羧酸种类及其活性衍生物以及其它反应条件。
该反应通常在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例包括酰胺(如甲酰胺、DMF、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等)，亚砜(二甲亚砜等)，芳胺(如吡啶等)，卤代烃(如氯仿、二氯甲烷等)，醚类(如四氢呋喃、二噁烷等)，腈类(如乙腈等)，酯类(如乙酸乙酯、甲酸乙酯等)，脂族或芳族烃(如己烷、苯、甲苯等)，酮类(如丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮等)，水等。这些溶剂可以以适当比例混合。
反应温度通常为约-50至150℃，优选-30至80℃，不过反应温度不受该范围限制，只要反应能进行。反应时间通常从几分钟至数小时不等，这取决于所用的原料、碱、反应温度以及溶剂种类。
其中R2代表式-CH2(CHOH)m1COOR18(其中m1和R18的定义同上)的通式[I]化合物或其盐通过使其中R2代表式-CH2(CHOH)m1COOH(其中m1的定义同上)的式[I]化合物或其盐进行上述酯化反应产生。
其中R2代表式-CH2(CHOH)m2CONR19R20(其中m2，R19和R20的定义同上)的通式[I]化合物或其盐可通过使其中R2代表式-CH2(CHOH)m2COOH(其中m2的定义同上)的通式[I]化合物或其盐进行上述酰胺化反应产生。
酰胺化反应可通过使其中R2代表式-CH2(CHOH)m2COOH的化合物或其盐与下述通式化合物或其盐按照上述方法进行HN-(R19)R20[IV]其中R19和R20的定义同上。
其中R2代表式-CH2(CHOH)m3CONHS(＝0)2R21(其中m3和R21的定义同上)的通式[I]化合物或其盐可按下述制备例如，使其中R2代表式-CH2(CHOH)m3COOH(其中m3的定义同上)的通式(1)化合物或其盐进行上述酰胺化反应。此反应可按照上述方法通过使其中R2代表式-CH2(CHOH)m3COOH的化合物或其活性衍生物与下述通式化合物或其盐反应来进行
H2NS(＝0)2R21[V]其中R21的定义同上。
其中R2代表式-CH2(CHOH)m4CONHOR22(其中m4和R22的定义同上)的通式[I]化合物或其盐可按下述制备使其中R2代表式-CH2(CHOH)m4COOH(其中m4的定义同上)的通式(I)化合物或其盐进行上述酰胺化反应。此反应可按照上述方法通过反应其中R2代表式-CH2(CHOH)m4COOH或其活性衍生物和下述通式化合物或其盐进行H2NOR22[VI]其中R22的定义同上。
其中R2代表式-CH2(CHOH)m5R23(其中m5和R23的定义同上)的通式[I]化合物或其盐可按下述生产在碱存在下使其中R2代表氢且n为0的通式[I]化合物或其盐与带有离去基团的化合物反应。此反应可以通过与按照下文所述生产其中R2为可被取代的烃基的通式[I]化合物或其盐的方法中所用相同的反应进行。
其中R2代表式-CH2(CHOH)m6CH2OH(其中m6的定义同上)的通式[I]化合物或其盐可按下所述生产使其中R2代表式-CH2(CHOH)m6COOR18(其中m6及R18的定义同上)的通式[I]化合物或其盐进行还原反应。
此还原反应优选采用还原剂来进行。至于还原剂，可使用金属氢化物(如氢化铝锂、二异丁基氢化铝、氢化三-叔丁氧基铝锂、硼氢化锂、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二硼烷等)，金属或金属盐(如锌等)，硫醇(如苯硫酚、二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇等)等等。
此反应可以在酸存在下进行。所用酸的实例包括无机酸(如盐酸、硫酸等)，有机酸(如乙酸、丙酸、TFA、甲磺酸、甲苯磺酸、樟脑磺酸等)以及路易斯酸(如氯化铝、三氟化硼、四氯化钛等)。
此反应通常是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例包括醚类(如乙醚、四氢呋喃(以下简写作“THF”)、二噁烷等)，酰胺类(如甲酰胺、DMF、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等)，亚砜(如二甲亚砜等)芳胺(如吡啶等)，卤代烃(如氯仿、二氯甲烷等)，醚类(如乙醚、THF、二噁烷等)，腈(如乙腈等)，脂族或芳族烃(如己烷、苯、甲苯等)，水等等。这些溶剂可以适当比例混合。
反应温度一般为约-70至150℃，优选约-40至100℃，不过温度可以不受此范围限制，只要反应能进行就行。反应时间一般从几分钟至数小时不等，这取决于所用的反应原料、反应温度和溶剂种类。
其中R2代表式-CH2(CHOH)m6CH2OR24′(其中m6定义同上，R24′代表可被取代的烃基)的通式[I]化合物或其盐可按下述反应生成使其中R2代表式-CH2(CHOH)m6CH2OH(其中m6的定义同上)的通式[I]化合物或其盐与下述通式化合物(以下简写为“带有离去基团的化合物”)反应R24′-X′其中R24′代表可被取代的烃基，而X′为离去基团。X ′表示的离去基团实例包括卤原子、磺酰氧基等等。
关于此反应中所用的带有离去基团的化合物、碱、溶剂、反应温度和反应时间，这些条件与产生其中R3或R4为被烃基(该烃基可被取代)取代的羟基的通式(I)化合物或其盐的方法中的条件相同，见下文说明。
其中R2代表式-CH2(CHOH)m6CH2OR24″(其中m6的定义同上，R24″代表可被取代的酰基)的通式[I]化合物或其盐可按下述反应生成使其中R2代表式-CH2(CHOH)m6CH2OH(其中m6的定义同上)的通式[I]化合物或其盐进行酰化反应。
关于此反应中所用的酰化剂、碱、溶剂、反应温度和反应时间，这些条件与产生其中R3或R4为被酰基取代的羟基(酰基是可被取代的)的通式(I)化合物或其盐的方法中的条件相同，见下文说明。
其中R2代表羟基且n为1或2的通式[I]化合物或其盐可通过下述反应生成使其中R2为氢原子或可被取代的烃基且n为0的通式[I]化合物或其盐，或使通式[II]化合物或其盐进行氧化反应。
此氧化反应优选采用氧化剂来进行。氧化剂的实例有过酸(如过乙酸、过甲酸、过苯甲酸、间-氯过苯甲酸等)，过酸酯(如过苯甲酸叔丁酯、间-氯过苯甲酸叔丁酯等)，铬酸(如三氯化铬、硫酸-铬酸盐、乙酸-铬酸盐等)，铬酸盐(如铬酸钾、铬酸钠、铬酸吡啶鎓、氯铬酸吡啶翁等)，重铬酸盐(如重铬酸钾、重铬酸钠、重铬酸吡啶鎓等)，高锰酸盐(如高锰酸钾、高锰酸钠等)，高卤酸(如高碘酸、高溴酸、高氯酸等)，高卤酸盐(如高碘酸钠、高溴酸钾、高氯酸钠等)，卤素(如碘、溴、氯等)，过氧化物(如过氧化氢、叔丁基过氧化氢等)，乙酸高铅，硝酸，氧，硫酰氯，二甲亚砜等等。此反应通常在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例包括酰胺类(如甲酰胺、DMF、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等)，亚砜(如二甲亚砜等)，芳胺(如吡啶等)，卤代烃(如氯仿、二氯甲烷等)，醚类(如乙醚、THF、二恶烷等)，腈类(乙腈等)，酯类(如乙酸乙酯、甲酸乙酯等，酮类(如丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮等)，醇类(如甲醇、乙醇、叔丁醇等)，脂肪酸(如甲酸、乙酸、丙酸等)，脂族或芳族烃(如己烷、苯、甲苯等)，水等等。这些溶剂可以适当比例混合。
此反应可在酸存在下进行。所用酸实例包括无机酸(如盐酸、硫酸、磷酸等)，有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、TFA、甲磺酸、甲苯磺酸、樟脑磺酸等)以及路易斯酸(如氯化铝、三氟化硼、四氢化钛等)。
此反应也可在碱存在下进行。碱的实例包括碱金属氢化物(如氢化钠、氢化钾等)，碱土金属氢化物(如氢化钙等)，碱金属醇盐(如甲醇钠、乙醇钠等)，碱金属氢氧化物(如氢氧化钠、氢氧化钾等)，碱金属碳酸盐(如碳酸钠、碳酸钾等)，碱金属碳酸氢盐(如碳酸氢钠等)，碱土金属氢氧化物(如氢氧化钙等)，碱金属磷酸盐(如磷酸钾等)，叔胺(如三甲胺、三乙胺、三丙胺、N-甲基哌啶、N-甲基吡咯烷、环己基二甲胺、N-甲基吗啉等)，仲胺(如二正丁胺、二异丁胺、二环己胺等)，以及芳族叔胺(如吡啶、卢剔啶、可力丁、4-二甲基氨基吡啶等)。
反应温度通常为约-70至150℃，优选约-30至100℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即行。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用原料、反应温度及溶剂种类。
其中R2为氢原子且n为0的通式[I]化合物或其盐可按照文献]Journal of Organic Chemistry 31，835，(1966))中所述方法，通过其中R2代表式-CH2COOH且n为1的通式[I]化合物或其盐反应生成。在该方法中，可形成下述通式化合物或其盐

其中R1、R3、R4、R5、R6、R7及Y的定义同上。
在这种情况下，例如，可通过还原反应，随后如有必要进行烃基引入反应，使通式[II]化合物或其盐转化成下述通式化合物

其中R2为氢原子或可被取代的烃基，其它符号定义同上。R2所示的可被取代的烃基基团实例与R2所表示的可被取代的烃基实例相同。
此还原反应在与上述相同的还原反应条件下进行。烃基的引入反应可按下所述进行。
其中R2为可被取代的烃基的通式[I]化合物或其盐也可以在碱存在下通过其中R2为氢原子且n为0的通式[I]化合物或其盐与带有离去基团的化合物反应生成。
上述带有离去基团的化合物是指带有这类官能团的化合物，这些官能团通过化学反应易被取代离去。具体地讲，优选下述各类化合物通式R2-X [VII]表示的化合物或其盐，其中R2为可被取代的烃基，X为氯原子，溴原子或碘原子；通式R2-OSO2R41[VIII]表示的化合物或其盐，其中R2为可被取代的烃基，且R41为可被取代的烃基；或者为通式(R2-OSO2)O [IX]表示的化合物或其盐，其中R2为可被取代的烃基。
R41所示的可被取代的烃基实例包括甲基、乙基、被甲基或溴原子任意取代的苯基、三氟甲基等等。
有关带有离去基团的化合物，也可使用环氧化物。环氧化物的实例包括1，2-环氧丙烷、缩水甘油、2，3-环氧丙酸乙酯等等。
此反应可以在碱存在下进行。碱的实例与上面氧化反应中所提及的那些相同。
此反应通常是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例与上述氧化反应中所提及的溶剂相同。
反应温度一般为约-70至150℃，优选约-30至80℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用的原料、碱、反应温度和溶剂种类。
还原二硫化物成硫醇的反应以及引入烃基到所形成的硫醇基团上的反应也可以在同一反应容器中连续进行。
其中R3或R4为被烃基(烃基也可被取代)取代的羟基的通式[I]化合物或其盐可通过下述反应生成在碱存在下将其中R3或R4为羟基的通式[I]化合物或其盐与带有离去基团的化合物反应，或者使原料化合物与重氮烷烃(如重氮甲烷、苯基重氮甲烷、二苯基重氮甲烷等)反应。
上述带有离去基团的化合物是指这样一类带有官能团的化合物，这些官能团通过化学反应很容易被取代。离去基团的实例包括卤化物(如甲基碘、乙基碘、丙基碘、异丙基碘、丁基碘、戊基碘、烯丙基溴、苄基溴、氯甲基甲基醚等)，磺酸酯(如甲磺酸甲酯、对-甲苯磺酸甲酯、对-甲苯磺酸乙酯、苯磺酸甲酯、三氟甲磺酸甲酯、三氟甲磺酸乙酯等)和硫酸酯(硫酸二甲酯、硫酸二乙酯等)。
此反应可以在碱存在下进行。碱的例子与上述氧化反应中所提及的那些相同。
反应通常是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-70至150℃，优选约-30至80℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即行。反应时间一般为数分钟至几小时，这取决于所用的原料、碱、反应温度及溶剂种类。
其中R3或R4为酰基(此酰基可被取代)取代的羟基的通式[I]化合物或其盐可通过其中R3和/或R4为羟基的通式[I]化合物或其盐经过酰化反应生成。
酰化反应可以通过例如原料化合物与酰化剂在溶剂中反应进行，酰化剂可为有机酸(如有机羧酸、有机磺酸等)或其活性衍生物。有机酸的活性衍生物实例为如上所述的酰基卤、酸酐，混合酐，活性酯等等。
当其中R3和/或R4为羟基的通式[I]化合物或其盐直接与有机酸反应时，可以使用缩合剂如DCC、WSC、DIC等。这些缩合剂可以用于合成与1-羟基-1H-2-吡啶酮、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯邻二酰亚胺、HOBT等形成的活性酯。
此反应可在碱存在下进行。碱的实例与上述酯化反应中所提及的那些相同。
该反应通常是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂的实例与上述酯化反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-50至150℃，优选约-30至80℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用原料、碱、反应温度及溶剂种类。
其中R3和/或R4代表式-OCOOR27(其中R27的定义同上)的通式[I]化合物或其盐可通过下述反应生成使其中R3和/或R4为羟基的通式[I]化合物或其盐与下述通式[X]的化合物或其盐反应X-COOR27[X]其中R27的定义同上，X为氯原子或溴原子；或与通式[XI]化合物或其盐反应(R27OCO)2O [XI]其中R27的定义同上。
上述反应可在碱存在下进行。碱的实例与上述酯化反应中所提及的那些相同。
该反应通常是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂的实例与上述酯化反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-50至150℃，优选约-30至80℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用的原料、碱、反应温度及溶剂种类。
其中R5、R6和/或R7为卤素的通式[I]化合物或其盐可通过其中R5、R6和/或R7为氢原子的通式[I]化合物或其盐经过卤化反应生成。
该反应所用的卤化剂包括氯、溴、碘、N-溴丁二酰亚胺、N-氯丁二酰亚胺、N-溴乙酰胺、吡啶鎓三溴化物、次氯酸叔丁酯、磺酰氯等等。
该反应可在自由基引发剂如2，2’-偶氮二异丁腈等存在下进行。
该反应可在酸存在下进行。酸的实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
该反应可在碱存在下进行。碱的实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-70至150℃，优选约-30至100℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用的原料、反应温度及溶剂种类。
其中R7为硝基的通式[I]化合物或其盐可通过文献中所述的硝基化合物的合成方法[日本化学会编辑，Shinjikken Kagaku Koza，Vol.14，p.1261-1300，Maruzen(1978)；和日本化学会编辑，the fourth edition of Jikken Kagaku Koza，Vol.20，p.394-405，Maruzen(1992)]或其改进方法产生。
该反应的原料化合物的实例包括其中R7为氢原子或卤原子的通式[I]化合物或其盐。反应所用试剂的实例包括硝酸、硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾等)、硝基苯、苯甲酰硝酸、乙酰硝酸、二乙酰原硝酸、四氧化二氮、五氧化二氮、亚硝酸和亚硝酸盐(如亚硝酸钠、亚硝酸钾等)。
该反应可在酸存在下进行。酸的实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
该反应一般是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-70至150℃，优选约-40至100℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用的原料、反应温度及溶剂种类。
其中R7为可被取代的酰基的通式[I]化合物或其盐可通过文献中所述的Friedel-Crafts反应产生[日本化学会编辑，ShinjikkenKagaku Koza，Vol.14，p.751-875，Maruzen(1977)；和日本化学会编辑，the fourthedition of Jikken Kagaku Koza，Vol.20，p.394-405，Maruzen(1992)]。
该反应的原料化合物的实例包括其中R7为氢原子的通式[I]化合物或其盐。反应所用的酰化剂实例包括羧酸、酰卤和羧酸酐。
该反应可在酸存在下进行。酸的实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
该反应一般是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-70至150℃，优选约-40至100℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用的原料、反应温度及溶剂种类。
其中R7为甲酰基的通式[I]化合物或其盐可通过文献中所述的甲酰化反应[日本化学会编辑，Shinjikken Kagaku Koza，Vol.14，p.636-751，Maruzen(1977)；和日本化学会编辑，thefourth edition of Jikken Kagaku Koza，Vol.21，p.106-124，Maruzen(1991)]或其改进反应生成。
该反应的原料化合物的实例包括其中R7为氢原子的通式[I]化合物或其盐。甲酰化反应实例包括Vilsmeier反应。
该反应可通过结合使用卤化剂(如磷酰氯、光气、草酰氯、亚硫酰氯、溴化三苯膦、六氯三磷氮杂三烯等)和给甲酰基试剂(如DMF、N-甲基-N-甲酰苯胺、N-甲酰基吗啉、N，N-二异丙基甲酰胺、原甲酸乙酯)进行。
该反应一般是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-70至150℃，优选约-40至100℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用的原料、反应温度及溶剂种类。
其中R7代表可被取代的烃基或可被取代的杂环基的通式[I]化合物或其盐可通过其中R7代表卤原子的通式[I]化合物或其盐与有机硼化合物间的偶合反应生成。该反应可按文献中所述的方法[Synthetic Communication，11，513(1981)；Journal of American Chemical Society，111，314(1989)；Tetrahedron Letters，33，2773(1992)；Synlett，207(1992)；and Journal of American Chemical Society，116，10847(1994)]或其改进方法进行。
在该反应中，通常使用催化量钯试剂(如四(三苯膦)合钯、乙酸钯(II)、氯化钯(II)等)。有时使用一或多当量这些钯试剂。
该反应可在磷化合物存在下进行。磷化合物的实例包括三苯膦、三(2-甲基苯基)膦等等。
该反应可在碱存在下进行。碱的实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
该反应一般是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-70至200℃，优选约-20至150℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用的原料、反应温度及溶剂种类。
其中R7代表可被取代的烃基的通式[I]化合物或其盐也可通过使其中R7代表可被取代的酰基的通式[I]化合物或其盐经过还原反应生成。
该反应可按与生成其中R2代表式-CH2(CHOH)m6CH2OH的通式[I]化合物或其盐相同的方法进行。
其中n为1或2的通式[I]化合物或其盐可通过氧化其中n为0的通式[I]化合物或其盐产生。
该氧化反应优选采用氧化剂进行。氧化剂的实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
该反应一般是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例与上述氧化反应中所提及的那些相同。
其中Y为两个氢原子的通式[I]化合物或其盐可通过使其中Y为氧原子的通式[I]化合物或其盐经过还原反应生成。
该还原反应优选采用还原剂进行。还原剂的实例与上述还原反应中所提及的那些相同。
该反应可在酸存在下进行。酸的实例与上述还原反应中所提及的那些相同。
该反应一般是在不影响反应的溶剂中进行。溶剂实例与上述还原反应中所提及的那些相同。
反应温度一般为约-70至150℃，优选约-40至100℃，不过反应温度不受上述范围限制，只要反应能进行即可。反应时间一般从数分钟至几小时不等，这取决于所用的原料、反应温度及溶剂种类。
按照上述产生方法所制得的化合物的实例见表3至表11中所示。
表3化合 实施物号 例号R1R2R3R4R5R6R7nY12CO2CH3CH2CO2HOHOHCl ClH0023CO2CH3CH2CO2HOHOHHClH0033CO2CH3CH2CO2HOHOHCl H H0043CO2CH3CH2CO2HOHOHHH H0053CO2CH3CH2CH(OH)CO2HOHOHCl ClH0063CO2CH3CH2CH(OH)CO2HOHOHHClH0073CO2CH3CH2CH(OH)CO2HOHOHCl H H0084CO2CH3CH2CO2CH3OCH3OHCl ClH0095CO2CH3CH2CO2HOCH3OHCl ClH00106CO2CH3CH2CO2CH3OHOHCl ClH00117CO2CH3CH2CO2CH2OCH3OCH2OCH3OHCl ClH00128CO2CH3CH2CO2H OH OCH3Cl ClH00139CO2CH3CH2CONH2OH OHCl ClH0014 10CO2CH3CH2CONH(CH2)2OCH3OH OH Cl ClH0015 11CO2CH3CH2CO-Gly-OCH2CH3OH OH Cl ClH0016 12CO2CH3CH2CO-Gly-OH OH OH Cl ClH0017 13CO2CH3CH2CO2H OH OH Cl ClH1018 14CO2CH3CH2CO2H OH OCOCH3Cl ClH00
表4化合实施物号例号R1R2R3R4R5R6R7nY19CO2CH3CH2CO2CH3OCOCH3OCOCH3ClClH002015CO2CH3CH2CH2OH OHOCOCH3ClClH002116CO2CH3CH2CH2OH OHOH ClClH0022CO2CH3CH2CH2OH OHOH ClClH1023CO2CH3CH2CH2OCOCH3OHOH ClClH0024CO2CH3CH2CH2OCH3OHOH ClClH0025CO2CH3CH2CO2HOHOH BrBrH002617CO2CH3CH2CO2CH3OHOCOCH3ClClH002718CO2CH3CH2CO2HOHOCOCH2CH3ClClH002819CO2CH3CH2CO2HOHOCOCH(CH3)2ClClH002920CO2CH3CH2CO2HOHOCOPh ClClH003021CO2CH3CH2CO2CH3OHOHClClH0H，H3122CO2CH3CH2CH2OH OH OH ClClH0H，H3223CO2CH3CH2CO2HOH OH ClClH0H，H3324CO2H CH2CO2HOH OH ClClH003425CO2CH3CH2CO2CH2OCH3OCH2OCH3OCH2OCH3ClClH003526CO2CH3CH2CO2CH2OCH3OH OH ClClH003627CO2CH3CH2CO2CH2OCH3OCOCH3OCOCH3ClClH00
表5化合实施物号例号R1R2R3R4R5R6R7nY3728CO2CH3CH2CO2HOCOCH3OCOCH3ClClH 0003829CO2CH3CH2CO2H OCOCH3OHClClH003930CO2CH3CH2CO2H OHOH ClCl Br 004031CO2CH3CH2CO2H OHOH ClCl I004132CO2CH3CH2CO2H OHOH ClCl H2O4233CO2CH2OCH3CH2CO2CH2OCH3OHOH ClCl H004334CO2CH2OCH3CH2CO2H OHOH ClCl H004435CO2H CH2CO2CH3OHOH ClCl H004536CO2H CH2CO2CH2CH3OHOH ClCl H004637CO2CH2CH3CH2CO2CH2CH3OHOH ClCl H004737CO2CH2CH3CH2CO2H OHOH ClCl H004838CO2CH3CH2CO2CH2PhOHOH ClCl H004939CO2CH3CH2CO2CH2PhOCH2OCH3OCH2OCH3ClCl H005040CO2CH3CH2CO2H OCH2OCH3OCH2OCH3ClCl H005140CO2CH3CH2CO2H OCH2OCH3OHClCl H005241CO2CH3CH2CO2H OHOCOCH3ClCl H105342CO2CH3CH2CO2H OHOCOCH2CH3ClCl H105443CO2CH3CH2CO2H OHOHClCl I10
显示高CD28表达的CHO细胞可以通过首先利用选择标记作为指示剂，选择掺有上述表达载体的转化体CHO细胞，随后通过克隆所述细胞得到。当使用dhfr基因时，通过在逐渐增加的MTX浓度的培养物中选择抗氨甲蝶呤(MTX)的细胞，并在细胞中扩增导入的基因，可以得到显示高表达的细胞株。能够表达高水平CD28的CHO细胞的实例包括称为CD28-CHO-11(FERM BP-5431)的CHO细胞，它含有上述称为pAKKO-CD28的表达载体。
含有CD28的CHO细胞可通过在能表达上述基因的条件下培养含有本发明编码CD28的基因的表达载体的CHO细胞而产生。
培养含有编码CD28的基因表达载体的CHO细胞的培养基包括EMEM、DMEM、RPMI1640和MEM-α，所有这些都含有约0.5至20％胎牛血清。当含有dhfr基因的表达载体用作选择标记时，优选使用含有不含核酸的透析胎牛血清的DMEM培养基，或含有不含核酸的透析胎牛血清的α-MEM培养基。PH优选为约6至8。培养通常在约30至40℃下进行约15至200小时；如果需要，可在改变培养基、通气、搅拌等条件下进行。
含CD28的CHO细胞的细胞膜部分是指富集细胞膜的部分；它们按照常规已知方法，匀浆这类CHO细胞得到。
细胞匀浆方法包括采用Potter-Elvehjem匀浆器的细胞压缩法，采用Waring掺合器或Polytron(Kinematica生产)的破裂法，超声波破裂法，采用氟氏压碎器等在加压下通过薄喷嘴细胞喷雾的破裂法，以及冻融法。
细胞膜分级分离主要通过如分级离心和密度梯度离心的方法完成。例如，先低速(500-3,000rpm)离心匀浆细胞较短时间(一般约1-10分钟)，然后高速(15,000-30,000rpm)离心所得到的上清液约30分钟至2小时，得到沉淀，为细胞膜部分。所述膜部分富含已表达的CD28和多种膜组分如细胞源磷脂和膜蛋白。
含有本发明CD28的CHO细胞或其膜部分中的CD28的量优选103-107分子/细胞，较优选104-106分子。
表8化合实施物号例号R1R2R3R4R5R6R7n Y7867CO2CH3CH2Ph-5-NO2-2-OHOHOHClClH0 07968CO2CH3CH2Ph-3，5-diBr-2-OHOHOHClClH0 08069CO2CH3Kojic acid OHOHClClH0 08170CO2H CH2Ph-2-CONH2OHOHClClH0 08271CO2CH3CH2Ph-2-CONH2OCH3OHClClH0 08372CO2CH3CH2Ph-2-四唑OHOHClClH0 08473CO2CH3CH2Ph-3-CO2H OHOHClClH0 08574CO2CH3CH2Ph-2-CO2H OHOHClClH0 08675CO2CH3CH2-2-吡啶基OHOHClClH0 O8776CO2CH3CH2CONHSO2Ph OHOHClClH0 08877CO2CH3CH2CONHSO2CH3OHOHClClH0 08978CO2CH3CH2CONHSO2Ph-4-CH3OHOHClClH0 09079CO2CH3CH2CONHSO2-2-萘基OHOHClClH0 09180CO2CH3CH2CONHSO2Ph-4-ClOHOHClClH0 09281CO2CH3CH2CONHSO2Ph-4-NO2OHOHClClH0 09382CO2CH3CH2CONHSO2CF3OHOHClClH0 09483CO2CH3CH2CONHOHOHOHClClH0 09584CO2CH3CH2CONHOCH3OHOHClClH0 0
表9化合实施物号例号R1R2R3R4R5R6R7nY9685CO2CH3CH2CH(OH)CO2HOH OHClClH109786CO2CH3CH2CH(OH)CO2HOH OHClClH209887CO2CH3CH2CH(OH)CO2CH3OCH3OCH3ClClH009988CO2CH3CH2CH(OH)CO2CH3OCH3OCH3ClClH20100 89CO2CH3CH2CH(OH)CO2CH2CH3OH OH ClClH00101 90CO2CH3CH2CH(OAc)CO2CH3OCH3OCH3ClClH00102 91CO2CH3CH2CH(OH)CO2CH2CH3OCH2OCH3OH ClClH00103 92CO2CH3CH2CH(OH)CO2CH2OCH3OCH2OCH3OH ClClH00104 93CO2CH3OHOHOH ClClNO220105 94CO2CH3CH2CH(OAc)CO2HOHOH ClClH00106 95CO2CH3CH3OHOH ClClH00107 96CO2CH3CH3OHOH ClClH10108 97CO2CH3CH3OHOH ClClH20109 98CO2CH3CH3OCH3OCH3ClClH20110 99CO2CH3CH2CO2CH2CH3OHOH ClClH00111 100 CO2CH3CH2CO2CH2OC(＝O)C(CH3)3OHOH ClClH00112 101 CO2CH3CH2C(＝O)CO2CH2CH3OHOH ClClH00113 102 CO2CH3CH2CH(NH2)CO2CH2CH3OHOH ClClH00
表10化合 实施物号 例号 R1R2R3R4R5R6R7nY114103CO2CH3CH2CH(NH2)CO2HOHOH ClClH00115104CO2CH3CH2CONHSO2Ph-4-OCH3OHOH ClClH00116105CO2CH3CH2CO2HOHOH ClClPh 00117106CO2CH3CH2CO2HOHOH ClClPh-4-CH300118107CO2CH3CH2CO2HOHOH ClClPh-4-CO2H 00119108CO2CH3CH2CO2HOHOH ClCl2-萘基 00120109CO2CH3CH2CO2HOHOH ClClPh-4-Cl00121110CO2CH3CH2CO2HOHOH ClClPh-4-OCH300122112CO2CH3ONa OHOH ClClH20123113CO2CH3CH2C(＝CH2)CO2H OHOH ClClH00124111CO2CH3CH2CO2HOHOH ClClPh-3-NH200125 CO2CH3CH2CO2HOHOH ClClPh-3-NO200126121CO2CH3CH2CO2HOHOH ClCl2-噻吩基 00127 CO2CH3CH2CO2HOHOH ClCl3-噻吩基 00128 CO2CH3CH2CO2HOHOH ClCl2-苯并[b]- 00-呋喃基129 CO2CH3CH2CO2HOHOH ClCl(CH2)3CH300130 CO2CH3CH2CO2HOHOH ClCl(CH2)7CH300
表11化合 实施物号 例号 R1R2R3R4R5R6R7nY131 CO2CH3CH2CO2H OHOHCl Cl CHO00132115CO2CH3CH2CO2H OHOHCl Cl NO200133114CO2CH3CH2CO2CH2OC(＝O)C(CH3)3OHOHCl Cl H10134116CO2CH3CH2CO2CH(CH3)- OHOHCl Cl H00-OC(＝O)O-cyc-hexyl135117CO2CH3CH2CO2H OHOHCl Cl NO210136118CO2CH3CH2-四唑OHOHCl Cl H10137119CO2CH3CH2CONHSO2CH3OHOHCl Cl H10138120CO2CH3CH2CO2CH(CH3)- OHOHCl Cl H10-OC(＝O)O-cyc-hexyl上述各表中的缩写含义如下表12Gly-NHCH2CO-Ph苯基 Ac乙酰基 cyc-hexyl环己基CH2Ph-4-CO2H

CH2-四唑

CH2Ph-4-CN

CH2Ph-3-CO2CH2

CH2Ph-5-NO2-2-OH

CH2Ph-3，5-diBr-2-OH

kojic acid

CH2Ph-2-四唑

CH2Ph-2-CONH2

CH2Ph-2-CO2H

CH2Ph-3-CO2H

CH2-2-吡啶基

CH2CONHSO2Ph-4-CH2

CH2CONHSO2-2-萘基

CH2CONHSO2Ph-4-Cl

CH2CONHSO2Ph-4-NO2

CH2CONHSO2Ph-4-OCH3

当本发明化合物[I]含有不对称碳原子或不对称硫原子时，可以存在立体异构体。这些立体异构体及其混合物也包含在本发明范围内。当化合物[I]的取代基中存在不对称碳原子或不对称硫原子时，也可能存在立体异构体。这些立体异构体及其混合物也包含在本发明范围之内。
按照上述生产方法得到的化合物[I]可以盐形式使用，优选以可药用盐形式使用。当化合物[I]含有酸性基团时，这些盐的实例可包括碱盐如与碱金属(如钠、钾)和碱土金属(如钙、镁)形成的盐；当化合物[I]含有碱性基团时，所述盐可包括酸加成盐如与无机酸(如盐酸、硫酸、磷酸)形成的盐和与有机酸(如乙酸、丙酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、草酸、甲磺酸)形成的盐。
本发明化合物[I]或其盐能够抑制配体B7-1与受体蛋白CD28的结合，还能抑制T细胞产生IL-2。因此化合物[I]或其盐可用作对人和动物(如小鼠、豚鼠、大鼠、猫、狗、羊、马、牛、猴等)安全低毒的药物，如免疫调节剂。具体地讲，可用作移植排斥抑制剂，用于治疗性处理变态反应、类风湿性关节炎、自身免疫病、肾炎、糖尿病等的药物组合物。
例如，对于人的给药，本发明化合物[I]或其盐能以本身形式或以与适当可药用载体、赋形剂或稀释剂结合的药物组合物形式经口或非经口安全地给药。
这种药物组合物包括口服制剂如粉剂、粒剂、胶囊和片剂，以及非口服制剂如可注射制剂、滴注剂、外用制剂(如经鼻制剂、经皮制剂)和栓剂(如直肠栓剂、阴道栓剂)。
这些制剂可通过常规使用的公知的制药方法生产。
口服制剂可按下述方法形成在下述成份存在下将化合物[I]或其盐压制成形赋形剂(如乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇)，崩解剂(如碳酸钙、羧甲基纤维素钙)，粘合剂(如明胶化淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇6000)及其它添加剂，然后根据调味、肠内释放或持续释放的需要，采用通常公知的方法涂层包衣。适用涂层剂的实例包括乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚亚氧烷基乙二醇、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和Eudra-git(Rohm(Germany)生产，甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)。
注射剂可按下述方法形成将化合物[I]或其盐与下述各组分一起配制成水注射剂分散剂[如吐温80(Atlas Powder(USA)生产)、HCO60(Nikko Chemicals生产)、聚乙二醇、羧甲基纤维素、藻酸钠]，防腐剂(如羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、苯甲醇、氯丁醇)，等渗剂(如氯化钠、甘油、山梨醇、葡萄糖)以及其它添加剂；或者配制成溶在植物油如橄榄油、芝麻油、棉籽油或玉米油、丙二醇等中的溶液、悬浮液或乳剂形式的注射油剂。
外用制剂可通过配制化合物[I]或其盐成固体、半固体或液体组合物形式产生。这种固体组合物可通过下述方式产生，例如，粉化本发明化合物本身或与赋形剂(如乳糖、甘露糖醇、淀粉、微晶纤维素、蔗糖)，增稠剂(如天然橡胶、纤维素衍生物、丙烯酸聚合物)以及其它添加剂的混合物。这类液体组合物可通过与制备注射剂几乎相同的方式制备本发明化合物成油或水悬浮液而产生。半固体组合物优选为水或油凝胶或软膏剂。所有这些组合物均可包含pH调节剂(如碳酸、磷酸、柠檬酸、盐酸、氢氧化钠)，防腐剂(如对-羟苯甲酸盐、氯丁醇、洁尔灭)以及其它添加剂。
栓剂可通过将本发明化合物[I]或其盐制成油或水性固体、半固体或液体组合物而生产。对所述组合物适用的油性基质包括高级脂肪酸的甘油酯[如可可脂、uitepsol系列(Dynamite No bel Com-pany生产)]，中级脂肪酸[如MIGL YOL系列(Dynami-te Nobel Company生产)]和植物油(如芝麻油、豆油、棉籽油)。水性基质包括聚乙二醇和丙二醇。水性凝胶基质包括天燃橡胶、纤维素衍生物、乙烯基聚合物和丙烯酸聚合物。
根据靶标疾病的种类及严重程度、患者年龄以及其它因素，用于治疗疾病的本发明化合物或其盐的量是可变的，但对于成人(50kg体重)而言，优选每天口服给药约1mg至1g，较优选约4mg至200mg活性成分。这种制剂每天可分1至3次给药。
当本发明化合物[I]或其盐以注射剂形式经皮下、静脉或肌内注射等非经口给药时，对成人而言，其剂量一般为每天约0.5mg至200mg，优选约1mg至50mg。
本发明提供了一种筛选具有抑制或增强CD28与B7-1结合的活性的化合物或其盐的方法，该方法包括将(1)当含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性B7-1-Ig接触时得到的CD28和B7-1-Ig之间的结合量与(2)当含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性的B7-1-Ig和试验化合物接触时得到的CD28和B7-1-Ig之间的结合量进行比较。
在本发明筛选能抑制或增强B7-1配体与受体蛋白CD28结合的化合物或其盐的方法中，通过将包含CD28基因的表达载体引入到CHO细胞内，并在能够表达上述基因的条件下培养此细胞，可以产生含CD28的CHO细胞。
编码CD28的基因的实例包括(但不限于)CD28编码cDNA和基因组DNA，只要含有CD28编码核苷酸序列即可。基因的实例包括具有SEQ ID NO1(图2)所示的核苷酸序列的CD28编码DNA。这些DNA也可以采用一般公知的基因工程技术产生。
表达载体的实例包括pAKKO-1.11H、pXT1、pRC/CMV、pRC/RSV和pcDNA I Neo，优选的例子为pAKKO-1.11H。
可使用任何启动子，只要它们在宿主细胞内能有效起作用；优选的启动子包括SV40启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子、SRα启动子和RSV启动子，更优选SRα启动子。
除上述各组分外，还优选使用具有增强子、剪接信号、聚腺苷酸化信号、选择标记等的表达载体。
选择标记包括二氢叶酸还原酶基因(以下也称作dhfr)、氨苄青霉素抗性基因(以下也称作Apr)和新霉素抗性基因(G418抗性)，优选dhfr基因。
包含编码CD28的基因的表达载体的实例包括一种通过如下述制备的载体在编码CD28的基因的上游插入上述启动子之一(尤其是SRα启动子、CMV启动子、RSV启动子等)，在编码CD28的基因的下游插入聚腺苷酸化信号，在下游进一步插入选择标记如dhfr基因或新霉素抗性基因，并再在下游进一步插入氨苄青霉素抗性基因。
更准确地说，优选例如称为pAKKO-CD28的表达载体(图1，参考实施例1)，它可按照图1中所示的方法，通过下述制得在编码CD28的基因的上游插入SRα启动子，在编码CD28的基因的下游插入聚A加合物信号，在下游进一步插入dhfr基因，并再在下游进一步插入氨苄青霉素抗性基因。
将如此制得的包含编码CD28的基因的表达载体引入到CHO细胞，可以得到表达有高CD28量的CHO细胞。
优选的CHO细胞[Journal of ExperimentalMedicine，108945(1995)]的实例包括缺乏dhfr基因的CHO细胞[Proceedings of the Natio-nal Academy of Sciences of the U-nited State of America，774216-42 20(1980)](以下也称作CHO(dhfr-)细胞)，CHO k-1细胞[Proceedings of the National Academy of Scienees of the United State of America，601275(1968)]等等。当dhfr基因作为选择标记插入到表达载体内时，优选CHO(dhfr-)细胞。在这种情况下，通过在不含核酸的培养其中培养细胞，能很容易选择转化体。CHO细胞不仅能表达高水平表达编码CD28的基因，而且具有显著稳定性。
如果需要，可选择表达载体与宿主细胞的任何优选结合。例如，优选称之为pAKKO-CD28的表达载体(参考实施例1)和CHO(dhfr-)细胞的结合。
采用已知方法如磷酸钙法[Virology，52456-467(1973)]和电极化法[EMBO Journal，1841-845(1982)]，可以将表达载体引入宿主细胞内。
显示高CD28表达的CHO细胞可以通过首先利用选择标记作为指示剂，选择掺有上述表达载体的转化体CHO细胞，随后通过克隆所述细胞得到。当使用dhfr基因时，通过在逐渐增加的MTX浓度的培养物中选择抗氨甲蝶呤(MTX)的细胞，并在细胞中扩增导入的基因，可以得到显示高表达的细胞株。能够表达高水平CD28的CHO细胞的实例包括称为CD28-CHO-11(FERM BP-5431)的CHO细胞，它含有上述称为pAKKO-CD28的表达载体。
含有CD28的CHO细胞可通过在能表达上述基因的条件下培养含有本发明编码CD28的基因的表达载体的CHO细胞而产生。
培养含有编码CD28的基因表达载体的CHO细胞的培养基包括EMEM、DMEM、RPMI1640和MEM-α，所有这些都含有约0.5至20％胎牛血清。当含有dhfr基因的表达载体用作选择标记时，优选使用含有不含核酸的透析胎牛血清的DMEM培养基，或含有不含核酸的透析胎牛血清的α-MEM培养基。PH优选为约6至8。培养通常在约30至40℃下进行约15至200小时；如果需要，可在改变培养基、通气、搅拌等条件下进行。
含CD28的CHO细胞的细胞膜部分是指富集细胞膜的部分；它们按照常规已知方法，匀浆这类CHO细胞得到。
细胞匀浆方法包括采用Potter-Elvehjem匀浆器的细胞压缩法，采用Waring掺合器或Polytron(Kinematica生产)的破裂法，超声波破裂法，采用氟氏压碎器等在加压下通过薄喷嘴细胞喷雾的破裂法，以及冻融法。
细胞膜分级分离主要通过如分级离心和密度梯度离心的方法完成。例如，先低速(500-3,000rpm)离心匀浆细胞较短时间(一般约1-10分钟)，然后高速(15,000-30,000rpm)离心所得到的上清液约30分钟至2小时，得到沉淀，为细胞膜部分。所述膜部分富含已表达的CD28和多种膜组分如细胞源磷脂和膜蛋白。
含有本发明CD28的CHO细胞或其膜部分中的CD28的量优选103-107分子/细胞，较优选104-106分子。
当含CD28的CHO细胞用于本发明的筛选方法时，所述CHO细胞可用作活细胞。所述CHO细胞也可以在按照常规已知方法使用戊二醛、多聚甲醛固定后使用。
本发明筛选方法中所用的可溶性B7-1-Ig是指由B7-1和IgG的FC区融合产生的蛋白。
细胞表面蛋白B7-1具有分泌信号和跨膜位点。可溶性B7-1-Ig起胞外分泌蛋白作用，这是由于它是通过移去B7-1的跨膜位点制得，并代之融入免疫球蛋白的Fc区。
可溶性B7-1-Ig可通过常规已知方法或其改进方法产生。例如，Journal of Experimental Medicine，1991，173721-730等中所述的方法可用于其生成。
同样，含有CHO细胞和胞外分泌的可溶性B7-1-Ig可通过下述方法产生建立含编码B7-1的基因(具有SEQ ID NO2(图4)表达的核苷酸序列)的表达载体(图5)，以及含有编码IgG(具有SEQ ID NO3表达的核苷酸序列(图6和7))Fc区的基因的基因；将所述表达载体引入CHO细胞，然后在能表达所述编码B7-1-Ig的基因的条件下培养细胞。
表达载体的优选实例为称为pB7-1-Ig(图5，参考实施例2)的表达载体，它可通过图5中所图示的方法按下述步骤制得在编码可溶性B7-1-Ig的基因的上游掺入SRα启动子，在编码可溶性B7-1-Ig的基因的下游掺入聚腺苷酸化信号，在下游进一步掺入dhfr基因，以及再在下游进一步掺入氨苄青霉素抗性基因。
通过将如此制得的含有B7-1-Ig基因的表达载体引入CHO细胞内，可以制得表达高含量B7-1-Ig的CHO细胞。
CHO细胞的优选实例有CHO(dhfr-)细胞、CHO K-1细胞等。当dhfr基因作为选择标记插入到表达载体内时，优选CHO(dhfr-)细胞。在这种情况下，通过在不含核酸的培养基中培养细胞，能很容易地选择转化体。
如果需要，可以选择表达载体与宿主细胞的任何优选结合。例如优选称为pB7-1-Ig的表达载体(参考实施例2)和CHO(dhfr-)细胞的结合。
利用已知方法如磷酸钙法[Virology，52456-467(1973)]和电极化法[EMBO Journal，1841-845(1982)]，可以将表达载体引入宿主细胞内。
显示高B7-1-Ig表达的CHO细胞可以通过如下所述方法得到首选采用选择标记作为指示剂选择掺有上述表达载体的转化体CHO细胞，接着克隆这种细胞。当使用dhfr基因时，通过在逐渐增加氨甲蝶呤(MTX)浓度的培养物中选择抗MTX的细胞并在细胞中增扩导入的基因，可以得到显示高表达的细胞。
能够表达高水平B7-1-Ig的CHO细胞的实例包括称为sB7-1-Ig-CHO-20(FERM BP-5432)的CHO细胞，该细胞含有上述称为pB7-1-Ig的表达载体。
通过在能表达下述基因的条件下，培养含有带本发明编码B7-1-Ig的基因的表达载体的CHO细胞，可以生产可溶性B7-1-Ig。
培养含有含B7-1-Ig基因的表达载体的CHO细胞的培养基包括EMEM、DMEM、RPMI1640和MEM-α，所有这些培养基都含有约0.5至20％胎牛血清。当使用含有dhfr基因的表达载体作为选择标记时，优选使用含有不含核酸的透析胎牛血清的DMEM培养基或使用含有不含核酸的透析胎牛血清的α-MEM培养基。pH优选约6至8。培养通常在约30至40℃下进行约24至200小时，优选约48-96小时，如果需要的话，可在改变培养基、通气、搅拌等条件下进行培养。
可溶性B7-1-Ig可以由这类能产生可溶性B7-1-Ig的CHO细胞或其培养物上清液得到并纯化，优选培养物上清液。
这种纯化可以利用B7-1-Ig的免疫球蛋白Fc区，通过常规已知的免疫球蛋白纯化法完成。当从培养物上清液中得到并纯化可溶性B7-1-Ig时，通过下述方法可以防止血清免疫球蛋白沾污可溶性B7-1-Ig的标准制品在产生B7-1-Ig的CHO细胞粘附于培养装置几乎形成单层后，用一种较低血清浓度(优选含有0-1％血清)的新鲜培养基替换原培养基，继续培养，收集培养物并纯化。
纯化培养物的适用方法包括超滤、硫酸铵分级分离、离子交换层析、亲和层析和凝胶过滤，其中优选亲和层析，这是由于该方法程序简单。特别优选装有蛋白A或蛋白G作为载体的柱子。通过凝胶过滤等方法，可以除去沾污的血清免疫球蛋白。
用于此筛选方法的试验化合物实例包括肽、蛋白质、非肽类化合物、合成化合物、微生物发酵产物、海洋生物体提取物、植物提取物、细胞提取物及动物组织提取物。这些试验化合物可以是新化合物或已知化合物。
在该筛选方法中，比较下述两种情况之间可溶性B7-1-Ig和CD28的结合量在情况(1)中，其中含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性B7-1-Ig彼此相互接触；在情况(2)中，其中含有CD28的CHO细胞或其细胞膜部分、可溶性B7-1-Ig与试验化合物彼此相互接触。
当情况(2)中的结合量低于情况(1)时，可以认定所得化合物为抑制B7与CD28结合的化合物，相反，可以认定所得化合物为增强B7与CD28结合的化合物。
CD28与B7的结合量可以采用已知方法测定，如采用放射性同位素标记的B7-1-Ig的放射免疫测定(RIA)，或采用结合于B7-1-Ig的Ig部分的标记次级抗体的酶免疫测定法(Zoku Seikagak uJikken Koza，5th edition，Meneki Ka-gaku Kenkyuho，1986，pp.62-65，Tokyo Kagaku Dojin)。
例如，在EIA法中，通过在可溶性B7-1-Ig和试验化合物存在下，在微量培养板中培养表达CD28的CHO细胞，然后彻底洗涤混合物，加入如辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人免疫球蛋白抗体、蛋白A等，洗涤混合物，然后显影染色反应，可以测得结合于表达CD28的CHO细胞的可溶性B7-1-Ig的量。具体地讲，上述量可按照下述试验实施例1测定。
本发明提供了一种筛选具有抑制IL-2产生活性的化合物或其盐的方法，它包括将(1)当含有B7-1的CHO-细胞或其细胞膜部分与T-细胞接触时产生的IL-2的量与(2)当含有B7-1的CHO-细胞或其细胞膜部分与T-细胞和试验化合物接触时产生的IL-2的量进行比较。
在本发明筛选具有抑制IL-2产生活性的化合物或其盐的方法中，含有B7-1的CHO细胞可按与上述产生含有CD28的CHO细胞或其细胞膜部分相同的方式产生。
例如，含有B7-1的CHO细胞可按下面所述产生建立含有编码B7-1的基因(具有SEQ ID NO2(图4)表达的核苷酸序列)的表达载体(图3)，将所述表达载体引入CHO细胞，然后在能够表达所述的编码B7-1的基因条件下培养细胞。
表达载体的优选实例包括称为pME-B-7-1的表达载体(图3，参考实施例1)，它可通过图3中所示的方法制备，在编码B7-1的基因的上游掺入SRα启动子且将氨苄青霉素抗性基因掺入编码B7-1的基因的下游。
适用的能够表达高水平B7-1的CHO细胞包括称之为B7-1-CHO-22(FERM BP-5430)的CHO细胞，它含有上述称之为pME-B7-1的表达载体。
用于产生外加共刺激信号的IL-2的人T细胞可从健康人体中采集。也可以使用能产生IL-2的人T细胞系。
为了从健康人体中采集T细胞，将外周血铺涂在LymphocyteSeparation Medium(Organon Teknika Co.)等上并离心，得到单核细胞部分。利用一些方法可以从单核细胞部分分出T细胞；所述方法包括使用常规已知的尼龙羊毛柱，使用抗体和使用流式细胞仪，其中使用尼龙羊毛柱是简便且优选的，通过将单核细胞部分加到尼龙羊毛柱上并收集未吸附的细胞，可以富集T细胞。重复该步骤，可以提高T细胞纯度。
当用刺激模拟抗原刺激，如用抗CD3抗体刺激T细胞，继之用T细胞中B7-1至CD28的共刺激信号刺激刺激T细胞时，T细胞被激活，能有效产生IL-2。
适用的能产生IL-2的人T细胞系的实例它包括Jurkat细胞。在使用Jurkat细胞情况下，抗CD3抗体和PHA等都可用于给出与抗原刺激有关的第一信号。
可以使用如上所述的那些相同的试验化合物。
在此筛选方法中，比较下述情况(1)和情况(2)中所产生的IL-2的量。在情况(1)中，含有B7-1的CHO细胞或其细胞膜部分与T细胞(具体地讲，为借助于抗CD3抗体等给与第一信号的T细胞)彼此相互接触；在情况(2)中，含有B7-1的CHO细胞或其细胞膜部分、T细胞(具体地讲，为借助于抗CD3抗体等给与第一信号的T细胞)与试验化合物彼此相互接触。
当情况(2)中的结合量低于情况(1)时，可以认定所得化合物为抑制IL-2产生的化合物。
产生的IL-2量可通过利用抗IL-2抗体的EIA法、IL-2依赖细胞生长的生物测定法以及其它公知方法测定。当各种试验化合物存在于单一样品中时，优选根据EIA法定量，这是因为它们能作用于细胞。利用“Meneki Jikken Sousa II，”p.819，Nan-kodo中所述的已知方法或利用市场上可购得的IL-2 EIA药盒，可以完成EIA法的IL-2定量。具体地讲，上述量可以按照下述试验实施例2测定。
采用本发明筛选方法得到的化合物或其盐是指这样的化合物或其盐，它们通过采用上述筛选方法从各种试验化合物中选择到(试验化合物如肽、蛋白质、非肽类化合物、合成化合物、微生物发酵产物、海洋生物体提取物、植物提取物、细胞提取物、动物组织提取物，这些试验化合物可以是新化合物或已知化合物)。例如，其中采用本发明筛选方法得到的所述化合物的结构式通过加成、消去、取代等被部分改变的这些化合物也包括在采用本发明筛选方法得到的化合物或其盐的范围之内。
采用本发明筛选方法得到的化合物或其盐是指这样化合物，它们能抑制或增强CD28与B7的结合，或者具有抑制IL-2产生的活性，并能用作安全低毒药物，如免疫调节剂。具体地讲，所述化合物可用作移植排斥抑制剂或治疗变应性疾病、类风湿性关节炎、自身免疫病、肾炎、糖尿病等疾病的药物组合物。
当采用本发明筛选方法得到的化合物或其盐用作药物时，正如本发明化合物[I]或其盐一样，它们可以适当的药物组合物形式使用。具体地讲，它们可用作安全低毒药物，如免疫调节剂；更准确地讲，它们是用作移植排斥抑制剂或治疗变应性疾病、类风湿性性节炎、自身免疫病、肾炎或糖尿病的药物组合物。
本发明说明书和附图中所用的有关核苷酸、氨基酸和其它物质的缩写是以IUPAC-IUB生化命名委员会所规定的缩写或相关领域中一般使用的缩写为基础的。下面给出了一些实例。除非另外说明，当氨基酸中存在光学异构体时，它是指L-构型。
DNA脱氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶G甘氨酸A丙氨酸V缬氨酸L亮氨酸I异亮氨酸S丝氨酸T苏氨酸C半胱氨酸M甲硫氨酸E谷氨酸D天冬氨酸K赖氨酸
R精氨酸H组氨酸F苯丙氨酸Y酪氨酸W色氨酸P脯氨酸N天冬酰氨Q谷氨酰胺BSA牛血清白蛋白FBS胎牛血清SDS十二烷基硫酸钠CHO中国仓鼠卵巢细胞DMEMDulbecco改进的Eagle培养基DBS磷酸缓冲盐溶液下文说明了说明书中的序列表中所示的序列号。
SEQ ID NO1表示参考实施例1中得到的编码CD28的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO2表示参考实施例1中得到的编码B7-1的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO3表示参考实施例2中得到的编码可溶性B7-1-Ig的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO4表示用于克隆B7-1基因的合成引物77的核苷酸序列。
SEQ ID NO5表示用于克隆B7-1基因的合成引物78的核苷酸序列。
SEQ ID NO6表示用于克隆CD28基因的合成引物28-A的核苷酸序列。
SEQ ID NO7表示用于克隆CD28基因的合成引物28-B的核苷酸序列。
SEQ ID NO8表示用于克隆可溶性B7-1-Ig基因的合成引物IG-3的核苷酸序列。
SEQ ID NO9表示用于克隆可溶性B7-1-Ig基因的合成引物IG-4的核苷酸序列。
SEQ ID NO10表示用于克隆可溶性B7-1-Ig基因的合成引物IG-1的核苷酸序列。
SEQ ID NO11表示用于克隆可溶性B7-1-Ig基因的合成引物IG-2的核苷酸序列。
实施例122中得到的B7-1-CHO-22按照布达佩斯条约自1996年2月28日起保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology(NIBH)，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of Inter-national Trade and Industry，保藏号FERM BP-5430。
实施例122中得到的CD28-CHO-11按照布达佩斯条约自1996年2月28日起保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology(NIBH)，Agency of IndustrialScience and Technology，Ministry of Inter-national Trade and Industry，保藏号FERM BP-5431。
实施例122中得到的sB7-1-Ig-CHO-20按照布达佩斯条约自1996年2月28日起保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology(NIBH)，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of Inter-national Trade and Industry，保藏号FERM BP-5432。[实施例]借助(但不限于)下述参考实施例、实施例、试验实施例和制剂实施例，更详细地说明了本发明。
本发明化合物具有呫吨(Zanthene)骨架。骨架及其编号如下

除非另有说明，百分比(％)是指重量/体积百分比；溶剂混合比是指体积比。
NMR光谱采用Bruker DPX-300光谱仪(1H NMR；300Hz，13C NMR；75MHz)测定。所用的内标物为四甲基硅烷；所有δ值以ppm表示。
本说明书中所用的各符号的含义如下s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；dd，双二重峰；dt，双三重峰；m，复峰；br，宽峰；J，耦合常数(Hz)；Q，季碳；CH，次甲基；CH2，亚甲基；CH3，甲基。参考实施例1克隆共同刺激(constimulatory)分子和建立各种表达载体a)克隆B7-1基因根据Freeman等人有关B7-1的DNA核苷酸序列的报道[Journal of Immunology，143，2714(1989)]，在B7-1的N-和C-端侧链相应制备两个克隆引物77和78。
引物77的序列为5′-TGGATCCATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAAC-3′(SEQID NO4)，在邻近B7-1的N-端起始密码子的5’-侧链上具有Bam HI位点。
引物78的序列为5′-TGGATCCTTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTCTC-3′(SEQID NO5)，在邻近B7-1的C-端终止密码子的5’-侧链上具有Bam HI位点。
按照PCR方法，利用引物77和78，将取自淋巴细胞B-细胞CDNA库(Clontech Laboratories，Inc.，PaloAlto，CA，USA)中的B7-1-编码DNA扩增，并克隆入质粒载体pUC118的Bam HI位点，产生pUC118-B7-1(图3)。然后测定翻译区的全(部)核苷酸序列(图4)。b)建立细胞中B7-1表达的质粒用PstI和EcoRI消化pUC118-B7-1；所得的B7-1DNA片断引入到pME18S的PstI-EcoRI位点中，得到pMEB7-1(一种B7-1在动物细胞中表达的质拉)(图3)。c)克隆CD28基因根据Aruffo等人有关CD28的DNA核苷酸序列的报道[Pro-ceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，84，8573(1987)]，对CD28的N-和C-端侧链分别制备两个克隆引物28-A和28-B。
引物28-A的序列是5′-TCTCGAGGTCGACATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTC-3′(SEQ ID NO6)，在邻近CD28的N-端起始密码子的5’-侧链上具有XhoI位点和SalI位点。
引物28-B的序列是5′-AACTAGTTCAGGAGCGATAGGCTGCGAAG-3(SEQ ID NO7)，在邻近CD28的C-端终止密码子的5’-侧链上具有SpeI位点。通过采用28-A和28-B的PCR方法扩增取自人淋巴瘤(Raji)快速克隆cDNA库(Clontech Laboratories Inc.，Palo Alto，CA，USA)中的CD28编码DNA，并克隆入质粒载体pME18S的XhoI和SalI位点之间，产生pME-CD28(图1)。然后测定翻译区域的全核苷酸序列(图2)。d)建立CD28在CHO细胞中表达的质粒通过把用SalI和SpeI消化pME-CD28制得的DNA片断引入pAKKOl.llH的SalI和SpeI位点之间，产生pAKKO-CD28(图1)。参考实施例2建立编码增溶性B7-1的质粒通过将人IgG的Fc区连接到B7-1的胞外区的C-端侧链上，建立编码增溶性B7-1的质粒。为按照PCR方法扩增超出编码B7-1胞外区的DNA的EcoRV位点范围之外部分，制得引物IG-3和IG-4。
引物IG-3的序列为5′-CTTTGATATCACTAATAACCTC-3′(SEQ ID NO8)，其在5’-侧链上具有EcoRV位点。
引物IG-4的序列为5′-GGTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTG-3(SEQ ID NO9)，在5’-侧链上具有BclI位点。
为将人IgG的Fc区引到增溶性B7-1的C-端侧链中，使用按Tada等人所述制备的质粒PTB1455，[Journal of Biotechnology，33，157(1994)]，这种质粒编码人IgG的Fc区。为按照PCR方法扩增人IgG的Fc区，制得引物IG-1和IG-2。为防止增溶性B7-1二聚化，可根据Linsley等人的方法[Journalof Experimental Medi-cine，173，721(1991)]，将这些引物设计成能用丝氨酸残基替换IgG的铰链区中的三个半胱氨酸残基。
引物IG-1的序列为5′-GGTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACGTCTCCACCGTCCCCGGC GCCTGAACTCCTG-3′(SEQ ID NO10)，在5’-侧链上具有BclI位点。
引物IG-2的序列为5′-CCCTGCAGTCTAGATCATTTACCCGGGGACAGGGAG-3′(SEQ ID NO11)，在5’-侧链上具有PstI位点和XbaI位点。(1)通过用Eco RV和NheI消化质粒pAKKO-B7-1(所述质粒带有B7-1基因和dhfr基因)，并用CIAP处理消化产物，制得DNA片断；(2)按照PCR方法，利用IG-3和IG-4，以pAKKO-B7-1为模板，扩增编码B7-1胞外区的DNA部分，并利用Eco RV和BclI消化扩增产物，从而制得DNA片断；(3)按照PCR方法，利用IG-1和IG-2，以pTB1455为模板，扩增编码IgG的Fc区的DNA部分，并采用XbaI和BclI消化扩增产物，从而制得DNA片断。
将上面(1)、(2)和(3)得到的三种DNA片断相互连接构建所需要的质粒pB7-1-Ig(图5)。在构建pB7-1-Ig期间，分析按照PCR方法扩增部分的序列，以测定全部核苷酸序列(图6)。参考实施例3制备N-Boc-2-溴乙胺将2-溴乙基溴化铵(Wako Pure Chemical Industries生产)(500mg)溶于THF-水(10∶1，11.0ml)；在冰冷却条件下加入三乙胺(711μl)和二碳酸二叔丁酯(617μl)(Wako Pure Chemical Indus-tries生产)继之室温搅拌1小时。减压浓缩反应混合物；将所得残留物溶于乙酸乙酯(30ml)，用水(2×10ml)和盐水(5ml)洗涤。接着用无水硫酸钠干燥有机层，减压浓缩后，得到的残留物经硅胶柱色谱纯化(用90∶10-85∶15正-己烷/乙酸乙酯洗脱)，得到N-Boc-2-溴乙胺(350mg)为无色油状物。1H NMR，CDCl3，δppm；4.94(1H，brs)，3.59-3.41(4H，m)，1.45(9H，s)。参考实施例4制备2-溴乙胺-N-苯磺酰胺将2-溴乙基溴化铵(500mg)溶于二氯甲烷(10.0ml)；在冰冷却条件下，加入苯磺酰氨(Wako Pure Chemical Industries生产)(350μl)和三乙胺(710μl)，随后室温搅拌2小时。减压浓缩反应混合物；所得残留物溶于乙酸乙酯(40ml)并用水(3×10ml)和盐水(5ml)洗涤。接着用无水硫酸钠干燥有机层，然后减压浓缩。得到的残留物通过硅胶柱色谱纯化(用80∶20正-己烷/乙酸乙酯洗脱)，得到2-溴乙胺-N-苯磺酰胺(640mg)，为无色结晶。1H NMR，CDCl3，δppm；7.92-7.85(2H，m)，7.65-7.50(3H，m)，5.00(1H，br s)，3.43-3.37(4H，m)。参考实施例5制备2-溴乙胺-N-甲磺酰胺将2-溴乙基溴化铵(500mg)溶于二氨甲烷(10.0ml)；在冰冷却条件下，加入甲磺酰氯(Wako Pure Chemical Industries生产)(210μl)和三乙胺(710μl)，继之室温搅拌2小时。减压浓缩反应混合物；所得残留物溶于乙酸乙酯(40ml)并用水(3×10ml)和盐水(3ml)洗涤。接着用无水硫酸钠干燥有机层，然后减压浓缩；所得残留物通过硅胶柱色谱纯化(用70∶30-60∶40正己烷/己酸乙酯洗脱)，得到2-溴乙胺-N-甲磺酰胺(320mg)，为无色油状物。1H NMR，CDCl3，δppm；4.81(1H，br s)，3.61-3.48(4H，m)，3.02(3H，s)。参考实施例6制备α-氯-α-脱氧曲酸将曲酸(150mg，Sigma Corporation生产)溶于氯仿(5.0ml)；加入亚硫酰氯(308μl，Wako Pure Chemical Industries生产)，接着回流5小时。加入氯仿(50ml)后，反应混合物用水(2×10ml)洗涤；然后用无水硫酸钠干燥有机层，随后减压浓缩。所得残留物进行硅胶柱色谱纯化，氯仿洗脱。减压浓缩洗脱液，得到α-氯-α-脱氧曲酸(64mg)，为棕色粉末。参考实施例7制备5-(2-溴甲基)苯基四唑将邻-甲苯基氰(500mg，Wako Pure Chemical Industries生产)溶于DMF(10ml)；加入叠氮化钠(555mg，Wako Pure Chemical Industries生产)和氯化铵(453mg)，接着于127℃ 搅拌14小时。加入乙酸乙酯(50ml)后，反应混合物用0.01M盐酸(2×30ml)洗涤；然后用2％碳酸氢钠水溶液(2×20ml)提取。在pH校正至2.0后，所得水层用乙酸乙酯(40ml)提取。水(3×20ml)洗涤后，有机层用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩，得到5-(2-甲基)苯基四唑(111mg)，为白色粉末。取60mg此粉末溶于四氯化碳(10ml)，加入N-溴丁二酰亚胺(67mg，Wako Pure Chemical In-dustries生产)和2，2’-偶氮二异丁腈(1.0mg，WakoPure Chemical Industries)，接着在90℃搅拌2小时。浓缩反应混合物之后，残留物进行硅胶柱色谱纯化，氯仿洗涤，然后用氯仿/甲醇(80∶20)洗脱和分级。减压浓缩洗脱液，得到5-(2-溴甲基)苯基四唑(25mg)，为棕色油状物。参考实施例8制备3-(溴甲基)苯甲酸甲氧甲酯在间-甲苯甲酸(500mg，Wako Pure Chemical Industries生产)溶于二氯甲烷(10ml)后，加入氯甲基·甲基醚(360μl)和三乙胺(665μl)，接着室温搅拌2小时。加入乙酸乙酯(50ml)后，反应混合物用0.01M盐酸、2％碳酸氢钠水溶液和水以(2×30ml)量洗涤。无水硫酸钠干燥所得有机层，然后减压浓缩，产生棕色油状物(588mg)。取此油状物300mg溶于四氯化碳(20ml)；加入N-溴丁二酰亚胺(296mg)和2，2’偶氮二异丁腈(3.0mg)，接着于90℃搅拌4小时。过滤除去琥珀酰亚胺后，浓缩反应混合物。向所得油状残留物中加入己烷，接着搅拌；减压浓缩得到的上清液，得3-(溴甲基)苯甲酸甲氧甲基酯(374mg)，为无色油状物。参考实施例9制备2-(溴甲基)苯甲酸甲氧甲酯在邻-甲苯甲酸(500mg，Wako Pure Chemical Industries生产)溶于二氯甲烷(10ml)之后，加入氯甲基·甲基醚(360μl)和三乙胺(665μl)，继之室温搅拌2小时。加入乙酸乙酯(50ml)后，反应混合物用0.01M盐酸、2％碳酸氢钠水溶液和水以(2×30ml)量洗涤。所得有机层用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩，得无色油状物(600mg)。取200mg此油状物溶于四氯化碳(10ml)；加入N-溴丁二酰亚胺(198mg)和2，2’-偶氮二异丁腈(1.8mg)，继之于90℃搅拌3小时。滤去琥珀酰亚胺后，浓缩反应混合物。所得残留物进行硅胶柱色谱纯化，用己烷和己烷/乙酸乙酯(50∶1)洗涤，然后用己烷/乙酸乙酯(20∶1)洗脱和分级。减压浓缩洗脱液，得到2-(溴甲基)苯甲酸甲氧甲酯(65mg)，为无色油状物。1H NMR，CDCl3，δppm；8.03(1H，d，J＝7.8Hz)，7.50(2H，m)，7.40(1H，m)，5.52(2H，s)，4.98(2H，s)，3.59(3H，s)参考实施例10制备2-噻吩(代)硼酸1，3-丙二醇酯将2-噻吩(代)硼酸(Aldrich Chemical Com-pany，Inc.生产)(200mg)悬浮于甲苯中(2.0ml)；加入1，3-丙二醇(Wako Pure Chemical Indus-tries生产)(230μl)，继之室温搅拌1小时。反应混合物用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩；所得残留物通过硅胶柱色谱纯化(90∶10-70∶30正-己烷/乙酸乙酯洗脱)，得到2-噻吩(代)硼酸丙二醇酯(221mg)，为白色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；7.59-7.52(2H，m)，7.15(1H，dd，J＝4.3，3.8Hz)，4.16(4H，t，J＝5.5Hz)，2.06(2H，m)。实施例1制备TAN-2421 A1，A2，A3，A4，B1，B2和B3280℃下，将曲霉属微生物物种菌株FL-67283在由24g马铃薯葡萄糖肉汤(Difco生产，U.S.A)、20g琼脂和1l水组成的斜面培养基中培养7天；并将上述菌株接种到40ml种子培养基(pH6.0)(2％葡萄糖、3％麦芽糖、1.5％大豆原粉、1％玉米浸渍液、0.5％多胨、0.3％酵母提取物和0.3％氯化钠)，并在200ml锥形瓶中于28℃培养48小时，得到种子培养液。取1升所得种子培养液转至200l含有120l主培养基(principal medium)(pH6.5)的培养槽中，其中主培养基含有3％糊精、0.5％葡萄糖、1％SBF、0.3％麦芽提取物、0.05％酒石酸铵、0.05％磷酸二氢钾、0.015％硫酸镁、0.007％氯化钙、0.05％actcol和0.02％硅氧烷，并于28℃以120rpm搅拌速率培养5天。实施例2分离TAN-2421A1将实施例1所得的培养液(120l)与采用同样条件得到的培养液(120l)混合(共240l)；在调节混合物至pH3.0后，加入乙酸乙酯(200l)，随后室温搅拌并混合30分钟。利用助滤剂(Radiolite 600，Showa Kagaku Kogyo生产)过滤混合物；细胞用乙酸乙酯(60l)洗涤。所得有机层(215l)用2％碳酸氢钠(140l)提取。调节至pH3.0后，水层用乙酸乙酯(100ml)提取。有机层用水洗(40l)，然后减压浓缩至200ml。此浓缩物进行硅胶(Kiesel Gel 60，500g)柱色谱纯化，用己烷/乙酸乙酯(4∶1，4l，2∶1，4l)洗涤，并用乙烷/乙酸乙酯(1∶1，4l)和乙酸乙酯(4l)洗脱。减压浓缩洗脱液至500ml，得浓缩物，然后用2％碳酸氢钠(500ml)提取两次，将水层合并，再减压浓缩至500ml。调节至pH7.5后，所得溶液加到Diaion HP-20(200ml)并用水(1l)和含水甲醇(20％，1l，50％，1l，80％，1∶1)洗涤，然后用80％甲醇/0.02 N氨水(1∶1)洗脱。
浓缩洗脱液至100ml，然后加水(100ml)，调节浓缩液的pH至3.0，用乙酸乙酯(400ml)提取两次。合并有机层(800ml)并水洗(300ml)，然后用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得粗粉(2.36g)。所得粗粉进行Sephadex LH-20(3.0l)柱层析，然后用甲醇(各300l)洗脱并分级。合并馏分14至17并浓缩至干。得635mg粉末。将该粉末溶于二甲亚砜-甲醇(1∶1，4.0ml)；取2ml此溶液进行制备高效液相色谱[柱；YMC-Pack ODS SH-363-15(YMC制造)，流动相；55％(V/V)乙腈/0.02M磷酸缓冲液(pH3.0)，流速；15ml/min]，得20ml馏分。合并两次走柱得到的馏分14；减压蒸除乙腈后，残留物用乙酸乙酯提取；有机层用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩，得到含有TAN-2421 A4的粉末(34mg)。合并两次走柱得到的馏分15和16，按与上相同的方式处理，得到含有TAN-2421 B2和B3的粉末(54mg)。合并两次走柱得到的馏分18和19，并按与上相同的方式处理，得到含有TAN-2421 A2和A3的粉末(38mg)。合并两次走柱得到的馏分22至24，按与上所述相同的方式处理，得到含有TAN-2421 B1的粉末(30mg)。合并两次走柱得到的馏分26至31，并用与上相同的方式处理，得到TAN-2421 A1(182mg)，为浅黄色粉末。[TAN-2421 A1]1)外观浅黄色粉末2)分子式C18H12Cl2O8S3)元素分析数据(％)计算值C，47.08；H，2.63；Cl，15.44；S，6.98实测值C，47.10；H，2.84；Cl，15.43；S，7.114)高分辨FAB-MS质谱m/z 458.9753(C18H12Cl2O8S+H)+的计算值m/z458.97095)UV光谱溶在甲醇中最大nm(E1cm1％)；243(765)，267(肩形，630)，275(645)，315(290)，368(200)6)IR谱KBr压片，示出主要吸收峰(波数，cm-1)3700-2300(br)，1725，1645，1585，1480，1435，1370，1330，1290，1250，1190，1170，10157)13C NMR谱75MHz，DMSO-d6，27℃，δppm178.1(Q)，170.1(Q)，166.2(Q)，165.7(Q)，157.1(Q)，154.5(Q)，148.7(Q)，142.8(Q)，139.3(Q)，117.0(Q)，114.6(Q)，110.6(Q)，108.6(Q)，106.8(Q)，102.9(CH)，52.4(CH3)，35.8(CH2)，18.4(CH3)。实施例3分离TAN-2421 A2，A3，A4，B1，B2和B3分两次将实施例2中所得的含有TAN-2421 A2和A3的粉末(36mg)通过制备高效液相色谱[柱；YMC-Pack ODS SH-343-5(YMC生产)，流动相；30％(V/V)乙腈/0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)，流速；10ml/min]，得到10ml馏分。合并两次走柱得到的馏分18至20；减压蒸除乙腈。然后调节pH2.5，残留物用乙酸乙酯提取。无水硫酸钠干燥有机层，然后减压浓缩，得TAN-2421 A3(12mg)，为浅黄色粉末。合并两次走柱得到的馏分22至25，并按与上相同的方式处理，得到TAN-2421 A2(6mg)，为浅黄色粉末。
将实施例2中所得的含有TAN-2421 A4的粉末(32mg)通过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相；32％(V/V)乙腈/0.01M磷酸缓冲液(pH6.3)，流速；10ml/min]，得到10ml馏分。保并两次走柱得到的馏分15至17；减压蒸除乙腈，然后调节至pH2.5，残留物用乙酸乙酯提取。有机层用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩，得TAN-2421 A4(15mg)，为浅黄色粉末。
将实施例2中得到的含有TAN-2421 B1的粉末(28mg)通过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相；32％(V/V)乙腈/0.01M磷酸缓冲液(pH6.3)，流速；10ml/min]，得到10ml馏分。合并两次走柱所得的馏分18至24；减压蒸除乙腈。然后调节至pH2.5，残留物用乙酸乙酯提取。无水硫酸钠干燥有机层，然后减压浓缩，得TAN-2421 B1(14mg)，为浅黄色粉末。
将实施例2中所得的含有TAN-2421 B2和B3的粉末(52mg)分两次通过制备高效液相色谱[柱；YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相；27％(V/V)乙腈/0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)，流速；10ml/min]，得到10ml各种馏分。合并两次走柱所得的馏分16至20；减压蒸除乙腈。然后调节至pH2.5，残留物用乙酸乙酯提取。无水硫酸钠干燥有机层，然后减压浓缩，得TAN-2421B2(8mg)，为浅黄色粉末。合并第-次走柱得到的馏分12和13和第二次走柱得到的馏分11和12，并按与上所述相同的方式处理，得到17mg含有TAN 2421 B3的粉末。将该粉末通过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相；50％(V/V)含水乙腈(含0.05％TFA)，流速；10ml/min]，得到10ml各种馏分。合并馏分17至18；减压蒸除乙腈。然后调节至pH2.5，残留物用乙酸乙酯提取。有机层用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩，得TAN-2421 B3(13mg)，为浅黄色粉末。[TAN-2421 A2]1)外观浅黄色粉末2)分子式C18H13ClO8S3)高分辨FAB-MS谱m/z 425.0114(C18H13ClO8S+H)+的计算值m/z425.00984)UV光谱溶在甲醇中最大nm(E1cm1％)；244(760)，270(690)，315(320)，361(195)
5)IR谱KBr压片，给出主要吸收峰(波数，cm-1)3700-2300(br)，1720，1700，1650，1590，1570，1480，1435，1410，1370，1310，1265，1200，10156)13C NMR谱75MHz，DMSO-d6，27℃，δppm178.4(Q)，170.1(Q)，166.4(Q)，165.3(Q)，157.4(Q)，155.7(Q)，152.9(Q)，145.7(Q)，139.4(Q)，116.2(Q)，113.9(Q)，108.9(Q)，108.6(Q)，106.4(Q)，102.8(CH)，52.3(CH3)，35.8(CH2)，20.7(CH3)。[TA N-2421 A3]1)外观浅黄色粉末2)分子式C18H13ClO8S3)高分辨FAB-M S谱m/z 425.0108(C18H13ClO8S+H)+的计算值m/z425.00984)UV光谱溶在甲醇中最大nm(E1cm1％)；242(740)，266(肩形，610)，274(625)，305(290)，365(205)5)IR谱KBr压片，给出主要吸收峰(波数，cm-1)3700-2800(br)，1730，1650，1590，1485，1435，1365，1255，1180，1160，10106)13C NMR谱75MHz，DMSO-d6，27℃，δppm178.4(Q)，170.1(Q)，166.3(Q)，165.3(Q)，158.6(Q)，157.1(Q)，150.2(Q)，145.8(Q)，139.3(Q)，116.5(Q)，112.4(CH)，109.7(Q)，109.0(Q)，106.8(Q)，102.9(CH)，52.3(CH3)，35.8(CH2)，20.5(CH3)。[TA N-2421 A4]1)外观浅黄色粉末2)分子式C18H14O8S3)高分辨FAB-MS谱m/z 391.0472(C18H14O8S+H)+的计算值m/z391.04884)UV光谱溶在甲醇中最大nm(E1cm1％)；242(855)，263(肩形，750)，269(765)，307(365)，358(240)5)IR谱KBr压片，给出主要吸收峰(波数，cm-1)3700-2200(br)，1725，1650，1615，1590，1575，1480，1435，1370，1255，1210，10156)13C NMR谱75MHz，DMSO-d6，27℃，δppm178.6(Q)，170.1(Q)，166.5(Q)，164.8(Q)，160.5(Q)，157.3(Q)，155.0(Q)，148.8(Q)，139.5(Q)，115.7(Q)，111.2(CH)，109.4(Q)，107.3(CH)，105.5(Q)，102.8(CH)，52.3(CH3)，35.8(CH2)，21.9(CH3)。[TAN-2421 B1]1)外观浅黄色粉末2)分子式C19H14Cl2O9S3)高分辨FAB-M S谱m/z 488.9808(C19H12Cl2O9S+H)+的计算值m/z488.98144)UV谱溶在甲醇中最大nm(E1cm1％)；245(555)，270(460)，275(肩形，460)，308(200)，370(165)5)IR谱KBr压片，给出主要吸收峰(波数，cm-1)3700-2300(br)，1740，1700，1645，1590，1485，1440，1370，1335，1290，1240，1185，1170，1105，10106)13C NMR谱75MHz，DMSO-d6，60℃，δppm 178.3(Q)，173.5(br，Q)，166.3(br，Q)，165.6(Q)，157.2(Q)，154.7(Q)，148.9(Q)，142.9(Q)，139.8(br，Q)，118.4(Q)，114.8(Q)，110.8(Q)，109.0(Q)，107.1(Q)，103.1(CH)，69.8(CH)，52.4(CH3)，38.8(br，CH2)，18.4(CH3)7)比旋光[α]D24-22.90(C0.49，DMF)[TAN-2421 B2]1)外观浅黄色粉末2)分子式C19H15ClO9S3)高分辨FAB-MS谱m/z 455.0197(C19H15ClO9S+H)+的计算值m/z455.02044)UV光谱溶在甲醇中最大nm(E1cm1％)；245(560)，266(510)，314(220)，362(155)5)IR谱KBr压片，给出主要吸收峰(波数，cm-1)3700-2300(br)，1715，1650，1590，1570，1480，1435，1410，1370，1335，1255，1200，1100，1070，10106)13C NMR谱75MHz，DMSO-d6，60℃，δppm178.6(Q)，173.3-173.5(br，Q)，166.5(br，Q)，165.1(Q)，157.5(Q)，156.0(Q)，153.1(Q)，145.8(Q)，139.9(br，Q)，117.7(Q)，114.1(Q)，109.3(br，Q)，108.6(CH)，106.6(Q)，103.1(CH)，69.8(CH)，52.3(CH3)，38.8-39.0(br，CH2)，20.7(CH3)。[TAN-2421 B3]1)外观浅黄色粉末2)分子式C19H15ClO9S3)高分辨FAB-MS谱m/z 455.0200(C19H15ClO9S+H)+的计算值m/z455.02044)UV光谱溶在甲醇中最大nm(E1cm1％)；240(665)，266(肩形，570)，272(585)，303(265)，364(195)5)IR谱KBr压片，给出主要吸收峰(波数，cm-1)3700-2300(br)，1725，1650，1590，1485，1435，1365，1330，1305，1255，1180，1160，1100，10106)13C NMR谱75MHz，DMSO-d6，60℃，δppm178.5(Q)，173.3(br，Q)，166.5(br，Q)，165.2(Q)，158.8(Q)，157.2(Q)，150.4(Q)，145.8(Q)，139.8(br，Q)，117.9(Q)，112.4(CH)，109.8(Q)，109.3(Q)，107.0(Q)，103.1(CH)，69.8(CH)，52.3(CH3)，38.8-38.9(br，CH2)，20.5(CH3)对于实施例2和3中所制得的各组分，得到在高效液相色谱中的保留时间、在硅胶薄层色谱中的Rf值和显色反应结果。
1)高效液相色谱中的保留时间条件柱YMC-Pack A312，ODS，6.0×150mm(由YMC生产)流速2.0ml/min检测UV 214nm流动相155％(V/V)乙腈水溶液(含有0.05％ TFA)流动相235％(V/V)乙腈水溶液/0.01M磷酸缓冲剂(pH6.3)保留时间(min)流动相1流动相2TAN-2421A17.716.8TAN-2421A25.010.2TAN-2421A35.09.6TAN-2421A43.66.1TAN-2421B15.84.8TAN-2421B23.83.3TAN-2421B33.83.02)硅胶薄层色谱的Rf值条件载体Kiesel Gel 60F 254，0.25mm厚度(由Merck，Germany生产)展开剂氯仿/甲醇/甲酸(9∶1∶0.5)Rf值TAN-2421A10.63TAN-2421A20.63TAN-2421A30.64TAN-2421A40.62TAN-2421B10.41TAN-2421B20.39TAN-2421B30.413)显色反应结果(对于所有成分)阳性Barton试剂、碘、高锰酸钾、磷钼酸阴性茚三酮、Sakaguchi试剂实施例4将化合物1(40mg)悬浮于乙酸乙酯(9.4ml)中，加入甲醇(40μl)和2.0M的(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(由Tokyo Kasei生产)的己烷溶液(500μl)，而后室温搅拌25分钟。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物用硅胶柱色谱纯化(用氯仿洗脱)，再一次用柱硅柱色谱纯化(用乙酸乙酯/己烷和氯仿/甲醇洗脱)后得到化合物8(32mg)，为浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm12.90(1H，s)，7.05(1H，s)，4.10(3H，s)，4.05(3H，s)，3.67(3H，s)，3.56(1H，d，J＝13.7Hz)，3.49(1H，d，J＝13.7Hz)，2.65(3H，s)FAB-MS谱(M+H)+m/z 487实施例5将化合物8(11mg)悬浮于甲醇/乙腈/水(3∶2∶1，6ml)中，加入1M氢氧化钠水溶液(100μl)，而后在室温下搅拌2小时再在60℃搅拌2小时。加水后，用稀盐酸中和反应混合物，接着浓缩。将所得剩余物用10％柠檬酸水溶液酸化后用氯仿萃取(3×10ml)。接下来，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。将所得剩余物经过硅胶柱色谱并用氯仿/甲醇/甲酸(90∶10∶0和80∶20∶1)洗脱。减压浓缩洗脱液后，加入氯仿(9ml)；用10％柠檬酸水溶液(2×3ml)和盐水(3ml)洗浓缩液。将所得有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得到化合物9(2.7mg)，为浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3-CD3OD，δppm7.07(1H，s)，4.09(3H，s)，4.06(3H，s)3.51(2H，s)，2.65(3H，s)FAB-MS谱(M+H)+m/z 473实施例6将化合物1(50mg)悬浮于10％盐酸-甲醇(由Tokyo Kasei生产)(10ml)中，而后在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物用硅胶柱色谱纯化(用氯仿洗脱)，得到化合物10(46mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.87(1H，s)，9.12(1H，br s)，7.18(1H，s)，4.07(3H，s)，3.77(3H，s)，3.74(1H，d，J＝17.5Hz)，3.60(1H，d，J＝17.5Hz)，2.64(3H，s)实施例7将化合物1(40mg)溶于DMF(1.0ml)，加入碳酸氢钠(36mg)和氯甲基甲基醚(由Tokyo Kasei生产)(33μl)，而后在室温下搅拌2小时。加入乙酸乙醇(20ml)后，用0.1M盐酸(10ml)和水(3×10ml)洗反应混合物。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，用硅胶柱色谱纯化所得剩余物(用氯仿洗脱)得到化合物11(40mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.87(1H，s)，7.36(1H，s)，5.45(2H，s)，5.24(1H，d，J＝5.9Hz)，5.18(1H，d，J＝5.9Hz)，4.05(3H，s)，3.58(3H，s)，3.42(3H，s)，2.65(3H，s)实施例8将化合物11(20mg)溶于DMF(1.0ml)，加入碳酸钾(10mg)和甲基碘(由Wako Pure Chemical Industries生产)(11.4μl)，而后在室温下搅拌16小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用水(3×15ml)洗反应混合物。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得到浅黄色粉末(20mg)。将该粉末溶于THF(0.8ml)中，加入1M盐酸(0.2ml)后在60℃搅拌24小时。减压浓缩反应混合物以除去THF后，将剩余物悬浮于乙酸乙酯(10ml)中并用水洗(2×5ml)。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相55％乙腈水溶液(含0.05％TFA)流速10ml/min]得到10ml级分。混合级分19和20并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(10ml)萃取提浓物。接着，将有机层用水(3×5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到化合物12白色粉末(11mg)。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.34(1H，br)，7.00(1H，s)，3.89(3H，s)，3.82(3H，s)，3.54(2H，s)，2.60(3H，s)实施例9将化合物10(15mg)溶于7.2M氨/甲醇(3.0ml)，而后在室温下搅拌21小时。减压浓缩反应混合物后，将剩余物悬浮在0.1M盐酸(5ml)中并用乙酸乙酯(30ml)萃取。将有机层用水(2×15ml)洗后，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将剩余物悬浮于甲醇(3ml)中，离心收集不溶物以得到化合物13(13mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm13.00(1H，s)，12.52(1H，br)，7.55(1H，br s)，7.32(1H，br s)，7.08(1H，s)，3.93(3H，s)，3.55(2H，s)，2.58(3H，s)实施例10溶解化合物10(13mg)于二氯甲烷(0.5ml)中，加入2-甲氧基乙胺(0.1ml，由Aldrich，USA生产)，而后在室温下搅拌19小时。加入乙酸乙酯(20ml)后，将反应混合物用1M盐酸(10ml)和水(2×15ml)洗涤，接着将有机层用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。用硅胶柱色谱(用10∶1氯仿/甲醇洗脱)纯化所得剩余物得到化合物14(14mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6δppm13.08(1H，s)，8.17(1H，br t，J＝5.3Hz)，7.02(1H，s)，3.91(3H，s)，3.54(2H，s)，3.33(4H，m)，3.22(3H，s)，2.57(3H，s)实施例11将化合物1(25mg)溶于DMF(0.5ml)，加入WSC(由Dojin Kagaku Kenkyujo生产)(14mg)、HOBT(由DojinKagaku Keukyujo生产)(9.5mg)、甘氨酸乙酯盐酸盐(由Wako PureChemical Industries生产)(9.8mg)和三乙胺(15μg)后，在室温下搅拌2小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，将反应混合物用0.1M盐酸(10ml)、2％碳酸氢钠水溶液(10ml)和水(2×10ml)洗，随后用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。用硅胶柱色谱(用10∶1氯仿/甲醇洗脱)纯化所得剩余物以得到化合物15(24mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.24(1H，s)，8.66(1H，br)，6.91(1H，s)，4.07(2H，q，J＝7.1Hz)，3.89(3H，s)，3.82(2H，m)，3.57(2H，s)，2.57(3H，s)，1.17(3H，t，J＝7.1Hz)实施例12将化合物15(14mg)悬浮于甲醇(1.4ml)中，加入1M氢氧化钠水溶液(100ml)后，在室温下搅拌20小时。减压浓缩反应混合物，将剩余物悬浮于乙酸乙酯(15ml)中后用0.1M盐酸(5ml)和水(2×5ml)洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相50％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。混合级分19至25后减压浓缩以除去乙腈，随后用乙酸乙酯(20ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×10ml)后，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到化合物16(12mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.02(1H，s)，12.50(1H，br)，8.34(1H，brt，J＝5.7Hz)，7.08(1H，s)，3.91(3H，s)，3.75(2H，m)，3.60(2H，s)，2.59(3H，s)实施例13将化合物1(15mg)悬浮于氯仿(3ml)中，加入间-氯过苯甲酸(由Wako Pure Chemical Industries生产，纯度70％)(8.1mg)后，在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，通过硅胶柱色谱(用20∶1∶0.5的氯仿/甲醇/甲酸洗脱)纯化所得剩余物，得到化合物17(13mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CD3OD，δppm；7.04(1H，s)，4.30(1H，d，J＝14.7Hz)，4.15(1H，d，J＝14.7Hz)，3.98(3H，s)，2.61(3H，s)实施例14将化合物1(10mg)溶于吡啶(0.4ml)，加入乙酸酐(0.1ml)后，在室温下搅拌1.5小时。减压将反应混合物浓缩到干后，将剩余物溶于70％(V/V)含水乙腈(10ml)，而后在室温下搅拌18小时。浓缩反应混合物，将所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。混合级分12和13并减压浓缩，得到化合物18(9.1mg)白色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.45(1H，br)，7.02(1H，s)，3.86(3H，s)，3.54(2H，m)，2.64(3H，s)，2.41(3H，s)实施例15将化合物1(30mg)溶于吡啶(2.4ml)，加入乙酸酐(0.6ml)后，在室温下搅拌2小时。减压将反应混合物浓缩到干后，将剩余物溶于无水THF(2.5ml)，加入1.0M甲硼烷-THF配合物盐(由Aldrich生产)(1.0ml)的THF溶液后，在氩气中室温下搅拌3小时。减压将反应混合物浓缩到干后，将剩余物悬浮在乙酸乙酯(30ml)中，并用0.1M盐酸(5ml)和盐水(2×5ml)洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过硅胶柱色谱(用98∶2-97∶3氯仿/甲醇洗脱)纯化，得到化合物20(26mg)白色粉末。
1NMR，CDCl3，δppm；8.13(1H，br)，7.16(1H，s)，4.05(3H，s)，3.69(2H，t，J＝5.0Hz)，2.92(2H，m)，2.67(3H，s)，2.47(3H，s)实施例16将化合物20(13mg)溶于甲醇(4.4ml)，在冰冷却的条件下加入0.1M碳酸钾水溶液(1.4ml)，而后在室温下搅拌5小时。加入0.1M盐酸(2.7ml)后，减压浓缩反应混合物。将剩余物悬浮在乙酸乙酯(25ml)中，再用0.1M盐酸(5ml)和盐水(2×5ml)来洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。合并级分31至35并减压浓缩，得到化合物21(10mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.11(1H，s)，7.04(1H，s)，3.91(3H，s)，3.44(2H，t，J＝7.0Hz)，2.88(2H，t，J＝7.0Hz)，2.58(3H，s)实施例17将化合物1(10mg)溶于吡啶(0.4ml)，加入乙酸酐(0.1ml)后，在室温下搅拌1.5小时。减压将反应混合物浓缩到干后，将剩余物溶于甲醇(10ml)，再在室温下搅拌18小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。合并级分18和19后减压浓缩，得到化合物26(8.2mg)白色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；8.96(1H，br)，7.15(1H，s)，4.04(3H，s)，3.76(3H，s)，3.67(2H，m)，2.67(3H，s)，2.47(3H，s)实施例18将化合物1(15mg)溶于吡啶(1.5ml)，加入丙酸酐(12.7μl，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌2小时。减压浓缩反应混合物至蒸干后，将剩余物悬浮在70％(V/V)乙腈水溶液(15ml)中，而后在室温下搅拌18小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。合并级分19和20再减压浓缩，得到化合物27(15mg)白色粉末。
1H，DMSO-d6，δppm；12.40(1H，br)，7.03(1H，s)，3.85(3H，s)，3.54(2H，m)，2.74(2H，q，J＝7.5Hz)，2.64(3H，s)，1.23(3H，t，J＝7.5Hz)实施例19将化合物1(15mg)溶于吡啶(1.5ml)，加入异丁酰氯(10.4μl，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌2小时。减压将反应混合物浓缩到干后，将剩余物悬浮在70％(V/V)乙腈水溶液(15ml)中，而后在室温下搅拌18小时，再在60℃搅拌2小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-PackODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。合并级分27至29后减压浓缩，得到化合物28(16mg)白色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.24(1H，br)，7.04(1H，s)，3.83(3H，s)，3.54(2H，m)，2.97(1H，m)，2.63(3H，s)，1.33(6H，d，J＝6.9Hz)实施例20将化合物1(12mg)溶于DMF(1.2ml)，加入WSC(15mg)后，在室温下搅拌30分钟。在反应混合物中，加入苯甲酸(6.4mg，由Wake Pure Chemical Industries生产)和4-二甲氨基吡啶(3.2mg，由Wake Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌3小时。将反应混合物用70％(V/V)含水乙腈(3.5ml)稀释后，再在室温下搅拌18小时。减压浓缩反应混合物，用乙酸乙酯(15ml)稀释浓缩液，再用0.1M盐酸(10ml)和水(3×10ml)洗稀释液。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]而得到10ml级分。合并级分22和23后减压浓缩，得到化合物29(11mg)白色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.22(1H，br)，8.15(2H，br d，J＝7.5Hz)，7.80(1H，br t，J＝7.5Hz)，7.66(2H，t，J＝7.5Hz)，7.06(1H，s)，3.68-3.50(5H，m)，2.67(3H，s)实施例21将化合物10(40mg)溶于无水THF(4.0ml)；在冰冷却条件下加入1.0M甲硼烷-THF配盐的THF溶液(1.0ml)后，在0℃、氩气中搅拌2小时。在冰冷却条件下，加入饱和氯化铵水溶液(2.0ml)，而后减压浓缩反应混合物。将剩余物悬浮在乙酸乙酯(30ml)中并用0.1M盐酸(5ml)和盐水(2×5ml)来洗；接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-PackODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。合并级分34至38后减压浓缩，得到化合物30(19mg)黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；8.05(1H，br)，6.86(1H，s)，5.74(1H，br)，4.00(3H，s)，3.82(2H，s)，3.75(3H，s)，3.56(2H，s)，2.46(3H，s)实施例22将化合物1(15mg)溶于无水THF(2.5ml)，室温加入1.0M甲硼烷-THF配盐的THF溶液(0.5ml)后，在室温氩气下搅拌3小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)后用0.1M盐酸(5ml)和盐水(2×5ml)来洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后再减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。合并级分22至25后减压浓缩，得到化合物31(12mg)浅棕色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm10.40(1H，s)，9.78(1H，s)，6.69(1H，s)，3.90(3H，s)，3.68(2H，s)，3.43(2H，t，J＝7.2Hz)，2.80(2H，t，J＝7.2Hz)，2.41(3H，s)实施例23将化合物11(19mg)溶于无水THF(3.0ml)，在用冰冷却的条件下加入1.0M甲硼烷-THF的THF溶液(0.5ml)，而后在0℃、氩气中搅拌3小时。在用冰冷却的条件下加入饱和氯化铵水溶液(2.0ml)后，减压浓缩反应混合物；将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)后用0.1M盐酸(5ml)和盐水(2×5ml)来洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后再减压浓缩。在所得剩余物中加入三氟乙酸(0.5ml)并在室温下静置20分钟。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相55％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]而得到10ml级分。合并级分28和29后减压浓缩，得到化合物32(7.8mg)棕色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；10.56(1H，br，s)，9.77(1H，br s)，6.69(1H，s)，3.88(3H，s)，3.68(2H，s)，3.50(2H，s)，2.40(3H，s)实施例24将化合物1(15mg)溶于25％溴化氢的乙酸溶液(3.0ml，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，在100℃搅拌15小时。减压浓缩反应混合物到干后，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相55％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]以得到10ml级分。合并级分10至12后减压浓缩，得到化合物33(12mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.20(1H，s)，7.00(1H，s)，3.58(2H，s)，2.58(3H，s)实施例25将化合物1(50mg)溶于DMF(5.0ml)，加入碳酸钾(150mg)和氯甲基甲基醚(83μl)后，在室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯(30ml)后，用10％柠檬酸水溶液、2％碳酸氢钠水溶液和水(每种2×10ml)来洗反应混合物。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩；所得剩余物经过硅胶柱色谱(5.0ml)纯化，用己烷/乙酸乙酯(90∶10和80∶20)来洗后，再用己烷/乙酸乙酯(70∶30和65∶35)洗脱；收集该洗脱液后浓缩到干，得到化合物34(55mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；7.32(1H，s)，5.45(2H，s)，5.22(4H，m)，4.05(3H，s)，3.69(3H，s)，3.58(2H，m)，3.57(3H，s)，3.41(3H，s)，2.67(3H，s)实施例26将化合物1(50mg)悬浮于二氯甲烷(5.0ml)中，加入TEA(15μl，由Wako Pure Chemical Iudstries生产)和氯甲基甲基醚(13μl)后，在室温下搅拌2小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用10％柠檬酸水溶液、2％碳酸氢钠水溶液和水(每种2×10ml)来洗反应混合物。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩；所得剩余物经过硅胶柱色谱(5.0ml)纯化，用己烷/丙酮(70∶30、60∶40和50∶50)洗脱；收集该洗脱液后浓缩到干，得到化合物35(33mg)黄色粉末。
1NMR，CDCl3，δppm； 12.86(1H，s)，7.18(1H，s)，5.32(1H，d，J＝5.8Hz)，5.26(1H，d，J＝5.8Hz)，4.08(3H，s)，3.79(1H，d，J＝17.7Hz)，3.65(1H，d，J＝17.7Hz)，3.46(3H，s)，2.64(3H，s)实施例27将化合物35(25mg)溶于吡啶(1.0ml)，加入乙酸酐(1.0ml)后，溶液在室温下静置1小时。浓缩反应混合物后，加入乙酸乙酯(30ml)，再用0.01M盐酸(5×20ml)和水(2×20ml)来洗该混合物。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩到干，得到化合物36(30mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；7.49(1H，s)，5.22(2H，d，J＝10.7Hz)，4.03(3H，s)，3.56(2H，s)，3.41(3H，s)，2.68(3H，s)，2.47(3H，s)，2.42(3H，s)实施例28将化合物36(20mg)溶于5％ TFA的二氯甲烷溶液(2.0ml)，在室温下静置该溶液1小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，水(5×20ml)洗该反应混合物。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相70％(V/V)乙腈-10mM磷酸缓冲剂(pH3.0)，流速10ml/min]纯化，得到60-80ml级分，收集该级分并减压浓缩以除去乙腈，随后，调节浓缩液的pH为3.0再用乙酸乙酯(30ml)提取。将有机层用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物37(18mg)白色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；7.90(1H，s)，3.92(3H，s)，3.49(2H，m)，2.67(3H，s)，2.43(3H，s)，2.39(3H，s)实施例29将化合物36(5.5mg)溶于TFA(100μl)，在室温下静置该溶液30分钟。加入乙酸乙酯(30ml)后，水(3×10ml)洗该反应混合物。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS AM-324，流动相70％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速3.0ml/min]纯化而得到42-48ml级分，收集该级分减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(20ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物38(3.1mg)黄色粉末.
1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.62(1H，s)，7.95(1H，s)，3.95(3H，s)，3.51(2H，m)，2.62(3H，s)，2.40(3H，s)实施例30将化合物1(15mg)溶于DMF(1.0ml)，在用冰冷却的条件下，加入N-溴丁二酰亚胺(5.8g，由Wako Pure CHemical Industries生产)后，在0℃搅拌20分钟。将该反应混合物用乙酸乙酯(20ml)稀释后，用0.1M盐酸(10ml)和水(3×10ml)洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化，得到10ml级分。合并级分33至37后减压浓缩得到化合物39(14mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.99(1H，s)，3.91(3H，s)；3.56(2H，br s)，2.59(3H，s)实施例31将化合物1(12mg)溶于DMF(1.5ml)，加入碘(7.3mg，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌2小时，再加碘(10mg)后，在室温下搅拌1小时。将反应混合物用乙酸乙酯(15ml)稀释后，用2％硫代硫酸钠水溶液(10ml)、水(2×10ml)和盐水(10ml)来洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相75％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化，得到10ml级分。合并级分21和22后减压浓缩，得到化合物40(11mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm 13.10(1H，brs)，3.90(3H，s)，3.52(2H，br s)，2.60(3H，s)实施例32将化合物1(12mg)溶于甲酸(2.9ml)，加入30％过氧化氢水溶液)(0.15ml，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，在60℃搅拌2小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相50％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化得到10ml级分。合并级分17至19后减压浓缩，得到化合物41(11mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.05(1H，s)，6.99(1H，s)，4.55(2H，s)，3.85(3H，s)，2.58(3H，s)实施例33将化合物33(27mg)溶于二氯甲烷(2.7ml)，加入三乙胺(17μl)和氯甲基甲基醚(15μl)后，在室温下搅拌1.5小时。加入0.1M磷酸缓冲剂(pH3.0)(10ml)后，用乙酸乙酯(30ml)萃取反应混合物再用水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗有机层。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相68％(V/V)乙腈-0.01M磷酸缓冲剂(pH3.0)，流速10ml/min]纯化得到10ml级分。合并级分27至32后减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(10ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，然后，减压浓缩，得到化合物42(22mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.87(1H，s)， 9.06(1H，br)，7.19(1H，s)，5.72(1H，d，J＝5.8Hz)，5.56(1H，d，J＝5.8Hz)，5.32(1H，d，J＝5.8Hz)，5.27(1H，d，J＝5.8Hz)，3.80(1H，d，J＝17.8Hz)，3.67(1H，d，J＝17.8Hz)，3.63(3H，s)，3.46(3H，s)，2.65(3H，s)实施例34将化合物42(16mg)溶于THF(1.5ml)，在用冰冷却的条件下，加入1.0M氢氧化钠水溶液后，在0℃搅拌30分钟。加入0.1M磷酸缓冲剂(pH3.0)(10ml)后，用乙酸乙酯(30ml)萃取反应混合物；用水(10ml)和盐水(5ml)来洗有机层。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈-0.02磷酸缓冲剂(pH3.0)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分15至18后减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(10ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物43(13mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.07(1H，s)，7.03(1H，s)，5.55(1H，d，J＝5.8Hz)，5.44(1H，d，J＝5.8Hz)，3.59(2H，s)，3.51(3H，s)，2.57(3H，s)实施例35将化合物33(15mg)溶于10％盐酸-甲醇(3.0ml)后，在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相55％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min ]纯化而得到10ml级分。合并级分22至24后减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×10ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物44(13mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.17(1H，s)，7.00(1H，s)，3.60(2H，s)，3.55(3H，s)，2.57(3H，s)实施例36将化合物33(15mg)悬浮于乙醇(1.0ml)，加入10％(V/V)浓硫酸-乙醇(10μl)后，回流1小时。将反应混合物减压浓缩后，溶于乙酸乙酯(15ml)，并用盐水(2×5ml)来洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化得到10ml级分。合并级分21至23后减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×10ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物45(14mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.18(1H，s)，7.01(1H，s)，3.99(2H，q，J＝7.1Hz)，3.59(2H，s)，2.58(3H，s)，1.08(3H，t，J＝7.1Hz)实施例37将化合物33(40mg)溶于DMF(2.0ml)，加入三乙胺(25μl)和乙基碘(由Wako Pure Chemical Industries生产)(145μl)后，在室温下搅拌13小时。将反应混合物溶于乙酸乙酯(30ml)后，用10％柠檬酸水溶液(2×5ml)、水(3×5ml)和盐水(5ml)来洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分26至29后减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×10ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物47(10mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.09(1H，s)，7.02(1H，s)，4.40(2H，m)，3.60(1H，d，J＝14.5Hz)，3.53(1H，d，J＝1 4.5Hz)，2.57(3H，s)，1.35(3H，t，J＝7.1Hz)合并级分55至65后减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物；将有机层用水(2×10ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物46(13mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm； 12.94(1H，s)，9.23(1H，brs)，7.17(1H，s)，4.58(2H，m)，4.22(2H，q，J＝7.2Hz)，3.72(1H，d，J＝17.6Hz)，3.59(1H，d，J＝17.6Hz)，2.64(3H，s)，1.45(3H，t，J＝7.2Hz)，1.27(3H，t，J＝7.2Hz)实施例38将化合物1(50mg)溶于DMF(5.0ml)，加入碳酸钾(15mg)和苄基溴(17μl，由Waki Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌11小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用10％柠檬酸水溶液、2％碳酸氢钠水溶液和水(每种2×10ml)来洗反应混合物。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相75％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到250-320ml级分，收集该级分后减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物48(22mg)黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.87(1H，s)，9.05(1H，br s)，7.32(5H，m)，7.15(1H，s)，5.20(1H，d，J＝12.1Hz)，5.14(1H，d，J＝12.1Hz)，4.06(3H，s)，3.77(1H，d，J＝17.4Hz)，3.62(1H，d，J＝17.4Hz)，2.65(3H，s)实施例39将化合物48(15mg)溶于DMF(2.0ml)，加入碳酸钾(11mg)和氯甲基甲基醚(6.2μl)后，在室温下搅拌4小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用10％柠檬酸水溶液、2％碳酸氢钠水溶液和水(每种2×10ml)来洗反应混合物。接着，在将有机层用无水硫酸钠干燥后浓缩到干，得到化合物49(17mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；7.17(5H，m)，7.16(1H，s)，5.34(2H，s)，5.19(2H，d，J＝14.4Hz)，5.02(2H，s)，4.02(3H，s)，3.69(3H，s)，3.52(5H，s)，2.69(3H，s)实施例40将化合物49(15mg)溶于甲醇(20ml)，加入10％钯-活性炭(5.0mg，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，室温下在1atm氢气中搅拌1小时。从反应混合物中滤除催化剂后，浓缩滤液。将剩余物再次溶于甲醇(20ml)，加入10％钯-活性炭(5.0mg)后，室温下在1atm氢气中搅拌2小时。从反应混合物中滤除催化剂后，减压浓缩滤液。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相73％(V/V)乙腈-20mM磷酸缓冲剂，(pH3.0)，流速10ml/min]纯化而得到115-145ml和145-170ml级分，分别收集级分后减压浓缩以除去乙腈。用乙酸乙酯(30ml)萃取这些提浓物。将每个有机层分别用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物50(4.4mg)和化合物51(2.6mg)黄色粉末。化合物501H NMR，CDCl3，δppm；7.31(1H，s)，5.42(2H，s)，5.20(2H，br s)，4.04(3H，s)，3.69(3H，s)，3.59(2H，s)，3.55(3H，s)，2.67(3H，s)化合物511H NMR，CDCl3，δppm；12.84(1H，br s)，7.36(1H，s)，5.44(2H，s)，4.06(3H，s)，3.59(2H，s)，3.56(3H，s)，2.65(3H，s)实施例41将化合物1(15mg)溶于吡啶(0.5ml)，加入乙酸酐(0.1ml)后，在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，将剩余物溶于氯仿(1.5ml)，加入间-氯过苯甲酸(8.1mg)后，在室温下搅拌1小时。减压将反应混合物浓缩到干后，将剩余物悬浮于70％(V/V)的含水乙腈(15ml)，而后在室温下搅拌15小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相50％(V/V)含水乙腈(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分14至16后减压浓缩，得到化合物52(13mg)白色粉末。
1NMR，DMSO-d6，δppm；12.67(1H，br)，7.04(1H，s)，4.10(2H，s)，3.81(3H，s)，2.64(3H，s)，2.41(3H，s)实施例42将化合物27(19mg)溶于乙酸(3.61ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.19ml)后，在60℃搅拌45分钟。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相55％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而到10ml级分。合并级分22和23后减压浓缩，得到化合物53(10mg)棕色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；6.99(1H，s)，4.09(2H，s)，3.79(3H，s)，2.74(2H，m)，2.643(3H，s)，1.23(3H，t，J＝7.3Hz)实施例43将化合物40(15mg)悬浮于乙酸(2.85ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.15ml)后，在60℃搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相75％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分20至23后减压浓缩，得到化合物54(13mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm 13.38(1H，s)，4.12(1H，d)，J＝14.4Hz)，3.96(1H，d，J＝14.4Hz)，3.80(3H，s)，2.58(3H，s)实施例44将化合物40(40mg)溶于吡啶(4.0ml)，加入丙酸酐(26μl)后，在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物到干后，将剩余物溶于80％(V/V)乙腈水溶液(40ml)，而后在室温下搅拌15小时。浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相75％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分25至27后减压浓缩，得到化合物55(33mg)白色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；3.87(3H，s)，3.55(2H，s)，2.74(2H，q，J＝7.5Hz)，2.65(3H，s)，1.23(3H，t，J＝7.5Hz)实施例45将化合物55(16mg)悬浮于乙酸(3.04ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.16ml)后，在50℃搅拌2小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相75％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分20至24后减压浓缩，得到化合物56(15mg)白色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；4.11(2H，s)，3.79(3H，s)，2.74(2H，m)，2.65(3H，s)， 1.23(3H，t，J＝7.3Hz)实施例46将化合物11(15mg)溶于二氯甲烷(1.5ml)，加入三乙胺(7.7μl)和氯甲酸苯酯(4.1μl，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用乙酸乙酯(10ml)稀释后用0.1M盐酸(3ml)和水(2×3ml)来洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。将剩余物溶于TFA(1.5ml)并在室温下静置20分钟，而后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-PackODS SH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分21至24后减压浓缩，用乙酸乙酯(10ml)萃取所得的悬浮液(10ml)，当有机层用水(2×5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物57(16mg)白色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；7.52(2H，t，J＝7.9Hz)，7.39(3H，m)，7.01(1H，s)，3.91(3H，s)，3.54(2H，s)，2.67(3H，s)实施例47将化合物11(15mg)溶于二氯甲烷(1.5ml)，加入三乙胺(7.7μl)和氯甲酸甲酯(4.2μl，由Wake Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用乙酸乙酯(10ml)稀释后，用0.1M盐酸(3ml)和水(2×3ml)来洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将剩余物溶于TFA(1.5ml)并在室温下静置20分钟后，减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分14至16后减压浓缩，用乙酸乙酯(120ml)萃取所得的悬浮液(10ml)。将有机层用水(2×5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物58(13mg)白色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；7.02(1H，s)，3.89(3H，s)，3.86(3H，s)，3.53(2H，m)，2.65(3H，s)实施例48将化合物17(265mg)悬浮于二恶烷(50ml)，加入1M硫酸(50ml)后，在100℃搅拌8小时。浓缩反应混合物以除去二恶烷后，加入乙酸乙酯(100ml)；用水(4×50ml)洗该混合物。减压浓缩有机层，所得剩余物经过硅胶柱色谱(25ml)纯化和用氯仿/TEA(100∶2，80ml)洗后，用氯仿/甲醇/TEA洗脱并分级(100∶2∶2，10×10ml，级分1-10；100∶5∶2，10×10ml，级分11-20；50∶50∶5，5×20ml，级分21-25)。分别合并浓缩级分2-8和22-24。浓缩级分2-8到干后，将该提浓物溶于吡啶(30ml)并静置12小时。接着，将该溶液浓缩，与级分22-24的浓缩剩余物混合后，再溶于乙酸乙酯(80ml)。将所得的乙酸乙酯溶液用0.02M盐酸和水(每种2×40ml)来洗后，用无水硫酸钠干燥，再浓缩到干，得到化合物59(175m)浅黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；7.31(2H，s)，4.06(6H，s)，2.46(6H，s)实施例49将化合物59(10mg)悬浮于DMF(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg，由Wake Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.02M盐酸和水(每种2×10ml)来洗该混合物，随后将有机层用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相70％(V/V)含水乙腈(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到170-250ml级分。收集这些级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物60(6.9mg)黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.84(1H，s)，7.18(1H，s)，4.09(3H，s)，2.64(3H，s)实施例50将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(5.0mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入α-溴-对-甲苯甲酸(8.1mg，由Aldrich Chemical Company，Inc.生产)后，在室温下搅拌反应混合物2小时。将反应混合物浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)；再用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水来洗，而后将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到210-255ml级分，收集这些级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物61(6.5mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；8.37(2H，d，J＝8.1Hz)，7.59(2H，d，J＝8.1Hz)，7.25(1H，s)，4.58(1H，d，J＝12.5Hz)，4.42(1H，d，J＝12.5Hz)，4.13(3H，s)，2.47(3H，s)实施例51将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入8-溴辛酸(11mg，由AldrichChemical Company，Inc.生产)后，在室温下搅拌反应混合物1小时。将该反应混合物浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)，而后用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)来洗，跟着将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-PackODS SH-343-5，流动相70％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到280-330ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物62(7.0mg)黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.89(1H，s)，7.20(1H，s)，4.07(3H，s)，2.77(2H，t，J＝7.5Hz)，2.64(3H，s)，2.34(2H，t，J＝7.4Hz)，1.60(4H，m)，1.33(6H，m)实施例52将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入2-溴辛酸(8.7μl，由Wako PureChemical Industries生产)后，在室温下搅拌该反应混合物1小时。将该反应混合物减压浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)，再用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)来洗。将所得有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，而后所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-PackODS SH-343-5，流动相80％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到220-250ml级分，收集这些级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物63(7.5mg)黄色粉末。1H NMR，吡啶-d5，δppm；7.25(0.5H，s)，7.24(0.5H，s)，4.57(1H，m)，4.22(1.5H，s)，4.19(1.5H，s)，2.47(3H，s)，2.32(1H，m)，2.19(1H，m)，1.72(2H，m)，1.33(2H，m)，1.20(4H，m)，0.77(3H，t，J＝6.6Hz)实施例53将化合物59(15mg)悬浮于吡啶(3.0ml)，加入硼氢化钠(15mg)后，在室温下搅拌30分钟。在该悬浮液中，加入如参考实施例3中所制的N-Boc-2-溴乙胺(21mg)，而后在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)后用0.1M磷酸缓冲剂(pH3.0)(2×10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗。接着，将所得有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相82％(V/V)乙腈0.02M磷酸缓冲剂(pH3.0)，流速10ml/min ]纯化而得到10ml级分。合并级分17至22后减压浓缩以除去乙腈，然后用乙酸乙酯(15ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×5ml)和盐水(3ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩。将所得剩余物溶于4 N氢氯-乙酸乙酯溶液(由Kokusan Kagaku生产)，而后在室温下搅拌30分钟。减压浓缩反应混合物，得到化合物64(13mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.99(1H，s)，7.90(3H，br s)，7.25(1H，s)，3.95(3H，s)，3.02(2H，m)，2.85(2H，m)，2.58(3H，s)实施例54将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。在该悬浮液中，加入3-溴丙酸(由Wake Pure Chemical Industries生产)(10mg)后，再在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)中后用0.02盐酸(2×10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩；所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分26至29后减压浓缩以除去乙腈，随后用乙酸乙酯(15ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×5ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得化合物65(7.6mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.03(1H，s)，7.07(1H，s)，3.90(3H，s)，2.99(2H，m)，2.57(3H，s)，2.41(2H，m)实施例55
将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。在该悬浮液中，加入乙基碘(5μl)后，再在室温下搅拌45分钟。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)中，用0.02M盐酸(2×10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩；所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相75％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分26至29后减压浓缩以除去乙腈，然后，用乙酸乙酯(15ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×5ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物66(8.1mg)浅黄色粉末。
1NMR，CDCl3，δppm；12.90(1H，s)，7.80(1H，br)，7.21(1H，s)，4.08(3H，s)，2.83(2H，m)，2.64(3H，s)，1.24(3H，t，J＝7.4Hz)实施例56将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。在该悬浮液中，加入1-溴丙烷(由Wako Pure Checmial Industries生产)(12μl)后，再在室温下搅拌6小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)中后用0.02M盐酸(2×10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)洗；将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩；所得剩余物经过高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相85％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分19和20后减压浓缩以除去乙腈，然后用乙酸乙酯(15ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×5ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物67(5.7mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.90(1H，s)，7.79(1H，br)，7.20(1H，ds)，4.08(3H，s)，2.77(2H，m)，2.64(3H，s)，1.61(2H，m)，1.00(3H，t，J＝7.3Hz)实施例57将化合物59(20mg)悬浮于吡啶(4.0ml)，加入硼氢化钠(20mg)后，在室温下搅拌30分钟。在该反应混合物中，加入溴代乙腈(3.5μl，由Tokyo Kasei生产)后，再在室温下搅拌1小时。浓缩反应混合物后，加入乙酸乙酯(30ml)；用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)洗该混合物后，将有机层用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到170-230ml级分；收集这些级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物68(13mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；7.21(1H，s)，4.45(1H，d，J＝16.8Hz)，4.32(1H，d，J＝16.8Hz)，4.20(3H，s)，2.48(3H，s)实施例58将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入2-溴乙烷磺酸钠(11mg，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌该反应混合物2小时。浓缩反应混合物以蒸除吡啶后，加入0.02M盐酸(30ml)，再用乙酸乙酯(3×30ml)萃取该提浓物。减压浓缩有机层，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相45％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到120-180ml级分，收集这些级分并减压浓缩以除去乙腈后，用乙酸乙酯(3×30ml)萃取该提浓物。用2％碳酸氢钠水溶液(3×20ml)萃取该有机层，然后，浓缩所得的水层并将pH值校正到8.0。该水层经过柱色谱用Diaion HP-20(3.0ml)纯化并用水(9.0ml)洗，随后，用80％甲醇水溶液(9.0ml)洗脱。浓缩洗脱液后冷冻干燥，得到化合物69(7.8mg)黄色粉末。
1H NMR，D2O，δppm；6.52(1H，s)，4.07(3H，s)，3.10(4H，br s)，2.22(3H，s)实施例59将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入α-溴代苯乙酸(11mg，由AldrichChemcial Company，Inc生产)后，在室温下搅拌1小时。将该反应混合物浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)，再用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)来洗；然后，将所得有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相67％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到190-230ml级分，收集这些分并减压浓缩以除去乙腈后，用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物70(7.1mg)黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.88(0.7H，s)，12.84(0.3H，s)，7.40(5H，m)，7.14(0.7H，s)，7.04(0.3H，s)，5.20(0.7H，s)，4.99(0.3H，s)，4.06(0.9H，s)，4.02(2.1H，s)，2.65(3H，s)实施例60将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入2-溴丙酸(由Wako Pure ChemicalIndustries生产)(6μl)后，在室温下搅拌反应混合物30分钟。减压浓缩该反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)中并用0.02M盐酸(2×10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，而后减压浓缩，所得残余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODSSH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分21和22并减压浓缩以除去乙腈，然后，用乙酸乙酯(15ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×5ml)和盐水(3ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物71(3.9mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.06(0.5H，s)，13.05(0.5H，s)，7.05(0.5H，s)，7.03(0.5H，s)，4.02-3.85(4H，m)，2.58(3H，s)，1.34-1.22(3H，m)实施例61将化合物68(13mg)溶于DMF(2.0ml)，加入叠氮化钠(3.8g，由Wako Pure Chemical Industries生产)和氯化铵(3.1mg)后，于127℃搅拌13小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.01M盐酸和盐水(每种2×10ml)来洗反应混合物。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-DOS-5YMC(由YMC生产)，流动相52％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到220-320ml级分，收集这些级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物72(10mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；7.12(1H，s)，4.93(1H，d，J＝14.9Hz)，4.79(1H，d，J＝14.9Hz)，4.07(3H，s)，2.47(3H，s)实施例62将化合物59(20mg)悬浮于吡啶(1.0ml)，加入硼氢化钠(20mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入α-溴代-邻-甲苯基氰(20mg，由Aldrich Chemical Company，Inc.生产)后，在室温下搅拌反应混合物1小时。将该反应混合物浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)；再用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)来洗，随后将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相72％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到180-260ml级分，收集该级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物73(20mg)黄色粉末1H NMR，CDCl3，δppm；12.87(1H，s)，7.70(1H，dd，J＝8.8，2.1Hz)，7.40(2H，m)，7.14(1H，dd，J＝8.6，1.7Hz)，7.06(1H，s)，4.19(2H，m)，4.09(3H，s)，2.65(3H，s)实施例63将化合物59(20mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(20mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入3-(溴甲基)苯甲酸甲酯(23mg，由Lancaster Synthesis Ltd.生产)后，在室温下搅拌反应混合物1小时。将该反应混合物浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)，再用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)来洗；然后，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相72％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到290-370级分，收集该级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(50ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×20ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物74(19mg)黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.90(1H，s)，7.94(1H，dt，J＝7.5，1.5Hz)，7.84(1H，br t，J＝1.5Hz)，7.28(2H，m)，7.01(1H，s)，4.11(3H，s)，4.05(1H，d，J＝12.5Hz)，3.99(1H，d，J＝12.5Hz)，3.88(3H，s)，2.66(3H，s)实施例64将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入(±)-溴代丁二酸(9.8mg，由Aldrich Chemical Company，Inc.生产)后，在室温下搅拌反应混合物16小时。再次在反应混合物中加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌20分钟，此后再加入(±)-溴代丁二酸(5.0mg)后，在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)，再用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)来洗；此后，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相52％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到220-240ml级分，收集该级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取该提浓物。将有机层用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得化合物75(2.3mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；7.233(1H，s)，5.10(1H，m)，4.20(1.5H，s)，4.15(1.5H，s)，3.72(1H，m)，3.48(1H，m)，2.48(3H，s)实施例65将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。在反应混合物中，加入如参考实施例4中所制的2-溴乙胺-N-苯磺酰胺(17mg)后，在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)，用0.02M盐酸(2×10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗该混合物。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相75％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分20和21并减压浓缩以除去乙腈，而后，用乙酸乙酯(15ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×5ml)和盐水(3ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物76(13mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；12.80(1H，s)，7.88-7.81(2H，ms)，7.57-7.43(3H，m)，7.17(1H，s)，5.53(1H，m)，4.08(3H，s)，3.24-2.83(4H，m)，2.64(3H，s)实施例66将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌30分钟。在反应混合物中，加入如参考实施例5所制的α-溴乙胺-N-甲磺酰胺(14mg)后，在室温下搅拌30分钟。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)中；用0.02M盐酸(2×10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗该混合物。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相55％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分43至49并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(15ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×5ml)和盐水(3ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物77(10mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.00(1H，s)，7.08(1H，s)，7.05(1H，m)，3.93(3H，s)，3.08-2.90(4H，m)，2.86(3H，s)，2.57(3H，s)实施例67将化合物59(10mg)悬浮于DMF(1.0ml)，加入硼氢化钠(4.0mg)后，在室温下搅拌15分钟。加入2-羟基-5-硝基苄基溴(4.6mg，由Tokyo Kasei生产)后，在室温下搅拌反应混合物30分钟。再向反应混合物中加入硼氢化钠(2.0mg)后，在室温下搅拌30分钟。接着，再加入2-羟基-5-硝基苄基溴(46mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.02盐酸(3×10ml)来洗该混合物，而后，用2％碳酸氢钠(2×15ml)萃取有机层。将所得水层的pH值校正到2.0后，再用乙酸乙酯(30ml)萃取；将该有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相62％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到295-325ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物78(3.0mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；8.36(1H，d，J＝2.8Hz)，8.12(1H，dd，J＝8.9，2.8Hz)，7.26(1H，s)，7.07(1H，d，J＝8.9Hz)，4.69(1H，d，J＝12.7Hz)，4.56(1H，d，J＝12.7Hz)，4.11(3H，s)，2.46(3H，s)实施例68将化合物59(10mg)悬浮于DMF(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌15分钟。加入α，3，5-三溴-2-羟基甲苯(20mg，由Tokyo Kasei生产)后，在室温下搅拌反应混合物30分钟。向该反应混合物中，再加入α，3，5-三溴-2-羟基甲苯(100mg)后，在室温下搅拌15分钟。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)来洗该混合物；将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相77％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]纯化而得到250-290ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(20ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物79(3.7mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；7.70(1H，d，J＝2.4Hz)，7.40(1H，d，J＝2.4Hz)，7.20(1H，s)，4.62(1H，d，J＝12.6Hz)，4.46(1H，d，J＝12.6Hz)，4.13(3H，s)，2.47(3H，s)实施例69将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌15分钟。加入如参考实施例6中所制的α-氯代-α-脱氧曲酸(12mg)后，在室温下搅拌反应混合物1.5小时。将反应混合物浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)，再用0.02M盐酸(3×10ml)和盐水(2×10ml)来洗，接着将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相52％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]纯化而得到250-300ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后，用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物80(6.0mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；8.20(1H，s)，7.20(1H，s)，6.53(1H，s)，4.35(1H，d，J＝14.0Hz)，4.14(1H，d，J＝14.0Hz)，4.13(3H，s)，2.48(3H，s)实施例70将化合物73(5.0mg)悬浮于75％硫酸(2.5ml)，在110℃搅拌1小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用水(3×10ml)洗反应混合物，然后，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，得到化合物81(5.0mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.22(1H，s)，7.66(1H，br s)，7.44(1H，br s)，7.41(1H，m)，7.28(3H，m)，7.00(1H，s)，4.28(2H，s)，2.59(3H，s)实施例71将化合物81(2.0mg)悬浮于乙酸乙酯(2.5ml)，加入甲醇(200μl)和2.0M(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(由Tokyo Kasei生产)的己烷溶液(300μl)后，在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过硅胶柱色谱(4.0ml)纯化和用氯仿洗后，用氯仿/甲醇(100∶1)洗脱；收集被洗脱的级分后浓缩到干，得到化合物82(2.0mg)浅黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5+D2O，δppm；7.72(1H，d，J＝7.7Hz)，7.43(1H，d，J＝7.7Hz)，7.36(1H，t，J＝7.7Hz)，7.29(1H，s)，7.22(1H，t，J＝7.7Hz)，4.97(1H，d，J＝12.9Hz)，4.67(1H，d，J＝12.9Hz)，4.11(3H，s)，4.07(3H，s)，2.57(3H，s)实施例72将化合物59(15mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(15mg)后，在室温下搅拌30分钟。加入如参考实施例7所制的5-(2-溴甲基)苯基四唑(20mg)后，在室温搅拌反应混合物1小时。浓缩该反应混合物，在剩余物中加入乙酸乙酯(30ml)；再用0.02M盐酸(2×10ml)洗反应混合物，然后，用2％碳酸氢钠水溶液(2×15ml)萃取有机层。调节所得水层的pH到2.0后，再用乙酸乙酯(30ml)萃取；将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相67％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到220-270ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后，用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物83(3.0mg)黄色粉末。1H NMR，吡啶-d5+D2O，δppm；8.26(1H，d，J＝7.2Hz)，7.59(1H，d，J＝7.2Hz)，7.41(2H，m)，7.26(1H，s)，5.12(1H，d，J＝12.0Hz)，4.84(1H，d，J＝12.0Hz)，4.01(3H，s)，2.48(3H，s)实施例73将化合物59(10mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(10mg)后，在室温下搅拌15分钟。加入如参考实施例8所制的3-(溴甲基)苯甲酸甲氧基甲酯(13mg)，在室温下搅拌反应混合物1小时。将反应混合物浓缩后，加入乙酸乙酯(30ml)，再用0.02M盐酸(2×10ml)来洗；接着，用2％碳酸氢钠水溶液(2×10ml)萃取有机层。将所得水层的pH值校正到2.0后，再用乙酸乙酯(20ml)萃取；将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]纯化而得到190-240ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物84(2.3mg)黄色粉末。1H NMR，吡啶-d5，δppm，8.51(1H，s)，8.28(1H，d，J＝7.6Hz)，7.67(1H，d，J＝7.6Hz)，7.43(1H，t，J＝7.6Hz)，7.24(1H，s)，4.62(1H，d，J＝12.5Hz)，4.43(1H，d，J＝12.5Hz)，4.16(3H，s)，2.46(3H，s)实施例74将化合物59(15mg)悬浮于吡啶(2.0ml)，加入硼氢化钠(15mg)后，在室温下搅拌15分钟。加入如参考实施例9所制的2-(溴甲基)苯甲酸甲氧基甲酯(19mg)后，在室温下搅拌反应混合物2小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.02M盐酸(2×10ml)和盐水(2×10ml)洗反应混合物，接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相70％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]纯化而得到150-210ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物85(12mg)黄色粉末。1H NMR，吡啶-d5+D2O，δppm；8.31(1H，dd，J＝7.0，2.0Hz)，7.42(1H，dd，J＝7.0，2.0Hz)，7.37(1H，dt，J＝2.0，7.0Hz)，7.35(1H，s)，7.32(1H，dt，J＝2.0，7.0Hz)，5.19(1H，d，J＝12.5Hz)，5.09(1H，d，J＝12.5Hz)，4.00(3H，s)，2.50(3H，s)实施例75将化合物59(10mg)溶于吡啶(1.0ml)，加入硼氢化钠(4.7mg)后，在室温下搅拌30分钟，再加入2-吡啶甲基氯盐酸盐(10.2mg，由Tokyo Kasei生产)后，再搅拌30分钟。减压浓缩反应混合物，将剩余物悬浮于乙酸乙酯(20ml)；用0.1M盐酸(10ml)和水(3×10ml)洗该悬浮液。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相55％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分16和17后减压浓缩；用乙酸乙酯(20ml)萃取所得悬浮液(8ml)。将有机层用水(2×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物86(6.5mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.00(1H，s)，8.46(1H，br d，J＝4.4Hz)，7.77(1H，dt，J＝1.6，7.6Hz)，7.29(2H，m)，7.07(1H，s)，4.23(1H，d，J＝13.3Hz)，4.17(1H，d，J＝13.3Hz)，3.76(3H，s)，2.58(3H，s)实施例76将化合物1(20mg)悬浮于二氯甲烷(2.0ml)，加入WSC(17mg)、4-二甲氨基吡啶(12mg)和苯磺酰胺(由Wako Pure ChemicalIndustries生产)(16mg)后，在室温下搅拌15小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)后，用0.02M盐酸(10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-PackODS SH-343-5，流动相70％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分22至25并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(15ml)萃取该提浓物。将有机层用水(3×5ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物87(15mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.99(1H，s)，12.30(1H，br)，7.88(2H，m)，7.70-7.52(3H，m)，7.03(1H，s)，3.86(3H，s)，3.68-3.51(2H，m)，2.58(3H，s)实施例77将化合物1(20mg)悬浮于二氯甲烷(2.0ml)，加入WSC(18mg)、4-二甲氨基吡啶(13mg)和甲磺酰胺(由Wako Pure ChemicalIndustries生产)(43mg)后，回流2小时。将反应混合物溶于乙酸乙酯(30ml)后，用0.02M盐酸(10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相70％(V/V)乙腈水溶液(含0.05TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。减压浓缩级分16以除去乙腈后，用乙酸乙酯(15ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×5ml)和盐水(5ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物88(6.6mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.99(1H，s)，7.07(1H，s)，3.92(3H，s)，3.64(1H，d，J＝14.4Hz)，3.58(1H，d，J＝14.4Hz)，3.19(3H，s)，2.58(3H，s)实施例78将化合物1(15mg)悬浮于二氯甲烷(2.0ml)，加入WSC(9.2mg)、4-二甲氨基吡啶(6.0mg)和对-甲苯磺酰胺(8.2mg，由Wako Pure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌2.5小时后，再40℃搅拌2小时。在该悬浮液中，加入对-甲苯磺酰胺(4.1mg)后，在40℃搅拌2小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.01M盐酸和水(每种2×10ml)来洗反应混合物，然后，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相72％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速；10ml/min]纯化而得到150-200ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物89(5.8mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；8.30(2H，d，J＝8.2Hz)，7.13(2H，d，J＝8.2Hz)，7.11(1H，s)，4.20(1H，d，J＝14.6Hz)，4.13(3H，s)，4.03(1H，d，J＝14.6Hz)，2.48(3H，s)，2.10(3H，s)实施例79将化合物1(15mg)悬浮于二氯甲烷(3.0ml)，加入WSC(14mg)、4-二甲氨基吡啶(9.2mg)和萘-2-磺酰胺(17mg，由Lancaster Synthesis，Ltd.生产)后，在40℃搅拌15小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.01M盐酸和盐水(每种2×10ml)洗反应混合物；然后，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱D-ODS-5YMC，流动相70％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到230-300ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物90(16mg)黄色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；12.72(1H，s)，8.54(1H，s)，7.92(1H，dd，J＝7.0，2.1Hz)，7.80(3H，m)，7.55(2H，m)，6.59(1H，s)，4.05(3H，s)，3.75(1H，d，J＝15.8Hz)，3.57(1H，d，J＝15.8Hz)，2.64(3H，s)实施例80将化合物1(15mg)悬浮于二氯甲烷(3.0ml)，加入WSC(14mg)、4-二甲氨基吡啶(9.2mg)和4-氯苯磺酰胺(16mg，由Aldrich Chemical Company，Inc.生产)后，在40℃搅拌15小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.01M盐酸和盐水(每种2×10ml)洗反应混合物；然后，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱Pack D-ODS-5 YMC，流动相70％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]纯化而得到230-300ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物91(15mg)黄色粉末。1H NMR，吡啶-d5，δppm；8.35(2H，d，J＝8.6Hz)，7.38(2H，d，J＝8.6Hz)，7.13(1H，s)，4.21(1H，d，J＝14.9Hz)，4.11(3H，s)，4.07(1H，d，J＝14.9Hz)，2.48(3H，s)实施例81将化合物1(15mg)悬浮于二氯甲烷(3.0ml)。加入WSC(14mg)、4-二甲氨基吡啶(9.2mg)和4-硝基苯磺酰胺(17mg，由Aldrich Chemical Industries Company，Inc.生产)后，在室温下搅拌4小时。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.02M盐酸和盐水(每种2×10ml)洗反应混合物；而后将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱Pack D-ODS-5 YMC，流动相65％乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到230-290ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物92(17mg)黄色粉末。1H NMR，吡啶-d5，δppm；8.59(2H，d，J＝8.8Hz)，8.20(2H，d，J＝8.8Hz)，7.16(1H，s)，4.15(1H，d，J＝15.7Hz)，4.09(3H，s)，4.07(1H，d，J＝15.7Hz)，2.48(3H，s)实施例82将化合物1(15mg)悬浮于二氯甲烷(3.0ml)，加入WSC(14mg)、4-二甲氨基吡啶(9.2mg)和三氟甲磺酰胺(13mg，由TokyoKasei生产)后，在室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯(30ml)后，用0.01M盐酸和盐水(每种2×10ml)洗反应混合物；然后，将有机层用无水硫酸钠干后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱PackD-ODS-5YMC，流动相70％乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]纯化而得到100-180ml级分，收集级分并减压浓缩以除去乙腈，而后，用乙酸乙酯(30ml)萃取提浓物。将有机层用水(3×10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得到化合物93(8.9mg)黄色粉末。
1H NMR，吡啶-d5，δppm；7.16(1H，s)，4.26(1H，d，J＝14.5Hz)，4.03(1H，d，J＝14.5Hz)，4.01(3H，s)，2.48(3H，s)实施例83将化合物1(15mg)溶于DMF(1.5ml)，加入WSC(9.4mg)后，在室温下搅拌1小时；再加入硫酸羟铵(4.0mg，由Wako PureChemcial Industries生产)后，在室温下搅拌16小时。将反应混合物用乙酸乙酯(10ml)稀释后，用0.1M盐酸(5ml)和水(2×5ml)来洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱Pack ODS SH-343-5YMC，流动相60％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分20至24并减压浓缩，得到化合物94(12mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.01(1H，s)，12.49(1H，br)，10.65(1H，s)，9.00(1H，br)，7.09(1H，s)，3.91(3H，s)，3.44(2H，s)，2.59(3H，s)实施例84将化合物1(15mg)溶于DMF(1.5ml)，加入WSC(9.4mg)后，在室温下搅拌1小时；再加入氯化O-甲基羟铵(4.1mg，由Wake Pure Chemical Industies生产)后，在室温下搅拌16小时。将以应混合物用乙酸乙酯(10ml)稀释后，用0.1M盐酸(5ml)和水(2×5ml)洗。接着，将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODS SH-343-5，流动相65％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分22至25并减压浓缩，得到化合物95(14mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm13.03(1H，s)，12.40(1H，br)，11.16(1H，br)，7.06(1H，s)，3.90(3H，s)，3.55(3H，s)，3.37(2H，s)，2.58(3H，s)实施例85将化合物5(50mg)悬浮于乙酸(9.5ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.5ml)后，在50℃搅拌45分钟。浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物96(52mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，60℃，δppm；12.96(1H，br s)，7.01(1H，s)，4.47-4.36(1H，m)，3.85(3H，s)，3.70-3.07(2H，m)，2.58(3H，s)SI-MS谱(M+Na)+m/z 527实施例86将化合物5(50mg)悬浮于甲酸(4.75ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.25ml)后，在60℃搅拌2小时。浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物97(44mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，60℃，δppm；12.91(1H，brs)，7.09(1H，s)，4.48-4.41(1H，m)，3.89(3H，s)，3.88-3.68(2H，m)，2.58(3H，s)SI-MS谱(M+Na)+m/z 543实施例87将化合物5(100mg)溶于DMF(10ml)，加入碳酸钾(564mg)和甲基碘(254μl)后，在室温下搅拌7小时。以与实施例38-样的方法纯化反应混合物，得到化合物98(88mg)白色粉末。1H NMR，CDCl3，50℃，δppm，6.99(1H，s)，4.30(1H，br)，4.09(3H，s)，4.07(3H，s)，3.95(3H，s)，3.76(1H，br)，3.71(3H，s)，3.30(1H，dd，J＝14.0，3.5Hz)，3.12(1H，br)，2.65(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 531实施例88将化合物98(17mg)溶于甲酸(1.5ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.075ml)后，在室温下搅拌3小时。浓缩反应混合物，将所得剩余物通过硅胶柱色谱纯化，得到化合物99(17mg)白色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δpp；7.54(1H，s)，5.90(1H，m)，4.46(1H，m)，4.13(3H，s)，3.88(3H，s)，3.83(3H，s)，3.77(2H，m)，3.63(3H，s)，2.62(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 563实施例89将化合物5(100mg)溶于乙醇(10ml)，加入浓硫酸(40μl)后，在室温下搅拌5小时。浓缩反应混合物后，将所得剩余物溶于乙酸乙酯(30ml)后用水(2×20ml)洗。浓缩有机层后，将其通过制备高效液相色谱纯化，得到化合物100(98mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.03(1H，s)，7.05(1H，s)，4.20-4.03(3H，m)，3.91(3H，s)，3.19-2.93(2H，m)，2.56(3H，s)，1.18(3H，m)SI-MS谱(M+H)+m/z 517实施例90将化合物98(20mg)溶于吡啶(1.0ml)，加入乙酸酐(0.1ml)后，在室温下搅拌2小时。浓缩反应混合物后，所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物101(16mg)白色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；7.37(1H，s)，4.87(1H，m)，4.08(3H，s)，3.88(3H，s)，3.83(3H，s)，3.64(3H，br s)，3.30-3.10(2H，m)，2.62(3H，s)，1.96(1.5H，br s)，1.94(1.5H，br s)SI-MS谱(M+H)+m/z 573实施例91将化合物100(20mg)溶于DMF(2.0ml)，加入碳酸氢钠(33mg)和氯甲基甲基醚(8.8μl)后，在室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯(20ml)后，用0.1M盐酸和水洗反应混合物，然后，浓缩有机层。所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物102(19mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm12.88(1H，s)，7.43(1H，s)，5.78(1H，m)，5.59×(2H，s)，4.22-4.02(3H，m)，3.92(3H，s)，3.50(3H，s)，3.22-2.59(2H，m)，2.60(3H，s)，1.16(3H，t，J＝7.2Hz)SI-MS谱(M+H)+m/z 561实施例92将化合物5(30mg)溶于DMF(3.0ml)，加入碳酸氢钠(52mg)和氯甲基甲基醚(14μl)后，在室温下搅拌1小时。以与实施例91一样的方式纯化反应混合物，得到化合物103(30mg)浅黄色粉末1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.89(1H，s)，7.44(1H，s)，5.88(1H，m)，5.59×2H，s)，5.27-5.15(2H，m)，4.28-4.18(1H，m)，3.93(3H，s)，3.50(3H，s)，3.35(3H，s)，3.25-2.98)(2H，m)，2.60(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 577实施例93将化合物1(50mg)悬浮于乙酸(5.0ml)，加入硝酸钠(由WakoPure Chemical Industries生产)(11mg)后，在90℃搅拌2小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(50ml)后，用盐水(3×20ml)洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩；所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱Pack D-ODS-5 YMC，流动相58％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)流速10ml/min]纯化而得到黄色粉末。将该粉末进一步用硅胶柱色谱(用氯仿/甲醇/甲酸洗脱)纯化，得到化合物104(6.3mg)黄色粉末。1H NMR，CD3OD，δppm；3.99(3H，s)，2.63(3H，s)FAB-MS谱(M-H)-m/z 492实施例94将化合物103(15mg)溶于吡啶(1.0ml)，加入乙酸酐(0.2ml)后，在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物得到双乙酸酯白色粉末(16mg)。将该粉末溶于TFA(1.0ml)并在室温下静置30分钟。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物105(14mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.05(1H，s)，12.85(1H，br)，7.06(0.5H，s)，7.05(0.5H，s)，4.75(1H，m)，3.88(1.5H，s)，3.87(1.5H，s)，3.40-3.10(2H，m)，2.58(3H，s)，1.95(1.5H，s)，1.91(1.5H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 531实施例95采用化合物59(100mg)、吡啶(10ml)、硼氢化钠(47mg)和甲基碘(39μl)，以与实施例55一样的方法得到化合物106(93mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.04(1H，s)，12.29(1H，br)，7.06(1H，s)，3.92(3H，s)，2.57(3H，s)，2.32(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 415实施例96将化合物106(12mg)悬浮于乙酸(1.2ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.06ml)后，在室温下搅拌4小时。减压浓缩反应混合物，得到化合物107(12mg)浅黄色粉末。1NMR，DMSO-d6，δppm；13.01(1H，s)，7.02(1H，s)，3.85(3H，s)，2.94(3H，s)，2.58(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 431实施例97将化合物106(20mg)悬浮于甲酸(2.0ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.1ml)后，在60℃搅拌3小时。减压浓缩反应混合物，所得剩余物通过制备高效液相色谱纯化，得到化合物108(19mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.99(1H，s)，7.07(1H，s)，3.87(3H，s)，3.33(3H，s)，2.58(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 447实施例98将化合物106(20mg)溶于DMF(2.0ml)，加入碳酸钾(67mg)和甲基碘(30ml)后，在室温下搅拌8小时。加入乙酸乙酯(20ml)后，用水洗反应混合物；再减压浓缩有机层。
接着，将所得剩余物悬浮于甲酸(2.0ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.1ml)后，在室温下搅拌2小时。减压浓缩反应混合物；所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物109(21mg)白色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；7.14(1H，s)，4.15(3H，s)，4.09(3H，s)，3.94(3H，s)，3.27(3H，s)，2.66(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 475实施例99将化合物1(70mg)悬浮于乙醇(7.0ml)，加入浓硫酸(70μl)后，在80℃搅拌4小时。浓缩反应混合物后，将所得剩余物溶于氯仿(20ml)后，用水(2×10ml)洗。浓缩有机层后，将其用制备高效液相色谱纯化，得到化合物110(56mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.01(1H，s)，7.06(1H，s)，3.98(2H，q，J＝7.1Hz)，3.90(3H，s)，3.63(1H，d，J＝13.8Hz)，3.56(1H，d，J＝13.8Hz)，2.58(3H，s)，1.06(3H，t，J＝7.1Hz)SI-MS谱(M+H)+m/z 487实施例100将化合物1(100mg)溶于DMF(10ml)，加入碳酸钾(300mg)和新戊酸氯甲酯(313ml，由Wako Pure Chemical Industr-es生产)后，在室温下搅拌3小时。以与实施例91一样的方式处理反应混合物，得到化合物111(78mg)浅黄色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；12.85(1H，s)，8.72(1H，br)，7.18(1H，s)，5.79(1H，d，J＝5.4Hz)，5.76(1H，d，J＝5.4Hz)，4.07(3H，s)，3.76(1H，d，J＝17.4Hz)，3.62(1H，d，J＝17.4Hz)，2.64(3H，s)，1.19(9H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 573实施例101将化合物59(100mg)悬浮于氯仿(10ml)，加入二硫赤藓糖醇(39mg)，由Wako Pure Chemical Industries生产)和三乙胺(35μl)后，在室温下搅拌30分钟。加入溴代丙酮酸乙酯(125μl，由WakoPure Chemical Industries生产)后，在室温下搅拌反应混合物30分钟。用0.1M盐酸和水洗反应混合物后，将所得有机层浓缩后通过制备高效液相色谱纯化得到化合物112(111mg)浅黄色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；12.84(0.7H，s)，12.83(0.3H，s)，8.50(0.3H，br s)，7.18(1H，s)，4.82(0.7H，br s)，4.41(1.4H，q，J＝7.2Hz)，4.34(0.6H，q，J＝7.2Hz)，4.27(0.3H，d，J＝18.0Hz)，4.17(0.3H，d，J＝18.0Hz)，4.08(0.9H，s)，4.07(2.1H，s)，3.44(0.7H，d，J＝13.5Hz)，3.13(0.7H，d，J＝13.5Hz)，2.64(3H，s)，1.40(2.1H，t，J＝7.2Hz)，1.36(0.9H，t，J＝7.2Hz)SI-MS谱(M+H)+m/z 515实施例102将化合物112(30mg)悬浮于甲醇(5.0ml)，加入乙酸铵(450mg)和乙酸(300μl)后，在室温下搅拌2小时；然后，加入氰基硼氢钠(5.5mg，由Aldrich Chemical Company，Inc.生产)，接着搅拌2小时。减压浓缩反应混合物，将剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)后，用水(3×20ml)洗。减压浓缩有机层，所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物113(23mg)浅黄色粉末。
1H NMR，CDCl3，δppm；13.00(1H，br)，7.03(1H，s)，4.22(2H，q，J＝7.1Hz)，4.08(1.2H，s)，4.07(1.8H，s)，3.58(1H，m)，3.34(1H，m)，2.90(1H，m)，2.63(3H，s)，1.29(1.2H，t，J＝7.1Hz)，1.28(1.8H，t，J＝7.1Hz)SI-MS谱(M+H)+m/z 516实施例103将化合物113(15mg)悬浮于乙醇(3.0ml)，加入0.2M氢氧化钠水溶液(0.87ml)后，在室温下搅拌3小时。加入1.0M盐酸(117μl)后，减压浓缩反应混合物，将剩余物经过制备高效液相色谱纯化。减压浓缩洗脱的级分以除去乙腈，而后，将提浓物的pH值调至5.0并通过柱色谱用Diaion HP-20(10ml)脱盐，得到化合物114(12mg)浅黄色粉末。
1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.94(1H，br)，6.34(0.5H，s)，6.30(0.5H，s)，3.87(1.5H，s)，3.86(1.5H，s)，2.94(2H，br s)，2.54(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 488实施例104将化合物1(30mg)悬浮于二氯甲烷(4.0ml)，加入WSC(28mg)、4-二甲氨基吡啶(18mg)和4-甲氧基苯磺酰胺(由LancasterSynthesis，Ltd.，生产)(16mg)后，在室温下搅拌13小时。用以与实施例76一样的方法纯化反应混合物，得到化合物115(26mg)黄色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；12.74(1H，s)，7.89(2H，d，J＝8.9Hz)，6.95(1H，s)，6.90(2H，d，J＝8.9Hz)，4.06(3H，s)，3.84(3H，s)，3.72(1H，d，J＝16.4Hz)，3.56(1H，d，J＝16.4Hz)，2.61(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 628实施例105将乙酸钯(II)(由Wako Pure Chemical Industries生产)(6.4mg)和三(2-甲苯基)膦(由Tokyo Kasei生产)(17.2mg)溶于1，2-二甲氧基乙烷(由Wako Pure Chemical Industries)(1.0ml)。将0.1ml该溶液加入到化合物40(30mg)的1，2-二甲氧基乙烷(2.7ml)溶液中，而后在室温下氩气中搅拌15分钟。向该溶液中，加入1.0M氢氧化钠水溶液(0.26ml)和苯基硼酸(由AldrichChemical Company，Inc生产)(10mg)后，在氩气中回流3小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物悬浮于乙酸乙酯(30ml)后，用0.05M盐酸(10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗。将有机层用无水流酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物116(13mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；12.92(1H，s)，7.56-7.40(5H，m)，3.95(3H，s)，3.61(2H，s)，2.49(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 535实施例106至111以与实施例105一样的方式，通过化合物40与苯硼酸衍生物的偶合反应，得到化合物117至121和124。表13

</tables>1H NMR，DMSO-d6，δppm；化合物11712.93(1H，s)，7.42(2H，d，J＝8.1Hz)，7.31(2H，d，J＝8.1Hz)，3.95(3H，s)，3.61(2H，s)，2.50(3H，s)，2.41(3H，s)化合物11812.89(1H，s)，8.07(2H，d，J＝8.3Hz)，7.66(2H，d，J＝8.3Hz)，3.96(3H，s)，3.61(2H，s)，2.49(3H，s)化合物11912.93(1H，s)，8.12(1H，br s)，8.03(1H，d，J＝8.5Hz)，7.98(2H，m)，7.66(1H，dd，J＝8.5，1.6Hz)，7.58(2H，m)，3.96(3H，s)，3.64(2H，s)，2.46(3H，s)化合物12012.90(1H，s)，7.57(4H，m)，3.95(3H，s)，3.60(2H，s)，2.50(3H，s)化合物12112.92(1H，s)，7.46(2H，d，J＝8.5Hz)，7.06(2H，d，J＝8.5Hz)，3.94(3H，s)，3.84(3H，s)，3.61(2H，s)，2.50(3H，s)化合物12413.20(1H，br)，7.28(1H，m)，6.95(2H，m)，6.87(1H，m)，3.92(3H，s)，3.52(2H，s)，2.50(3H，s)实施例112将化合物96(102mg)悬浮于1.4-二噁烷(由Wako PureChemical Industries生产)(10ml)，加入四丁基高碘酸铵(由AldrichChemical Company，Inc.生产)(96mg)后，回流3小时。再加入10％硫代硫酸钠水溶液(2ml)后，将反应混合物浓缩后用乙酸乙酯(100ml)萃取。将有机层用水(3×25ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱[柱YMC-Pack ODSSH-343-5，流动相55％(V/V)乙腈水溶液(含0.05％ TFA)，流速10ml/min]纯化而得到10ml级分。合并级分19至24并减压浓缩以除去乙腈，而后用乙酸乙酯(50ml)萃取提浓物。将有机层用水(2×20ml)和盐水(10ml)洗后，用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩。加入二氯甲烷(50ml)后，用1.0-0.4％碘化钠水溶液(3×50ml)(由Wako Pure Chemical Industries生产)萃取所得剩余物。用二氯甲烷(3×50ml)和乙酸乙酯(50ml)洗水层，将得到的水层浓缩并将pH值校正到5，而后经过柱色谱用Diaion HP-20(100-200mesh，20ml)纯化并用水(80ml)和50％甲醇水溶液(20ml)来洗，然后，用50％甲醇水溶液(80ml)和80％甲醇水溶液(40ml)洗脱。将洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到化合物122(18mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.12(1H，s)，12.19(1H，br s)，7.13(1H，s)，3.81(3H，s)，2.57(3H，s)SI-MS谱(M+Na)+m/z 493实施例113将化合物59(30mg)悬浮于DMF(3.0ml)，加入硼氢化钠(由Wako Pure Chemical Industries生产)(9mg)后，在室温下搅拌30分钟。在该悬浮液中，加入3-溴-2-(溴甲基)丙酸(由AldrichChemical Company，Inc.生产)(39mg)后，在室温下搅拌1小时。加入乙酸乙酯(50ml)后，用0.05M盐酸(15m)、水(2×15ml)和盐水(10ml)洗该反应混合物。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物123(27mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.01(1H，s)，7.06(1H，s)，5.87(1H，s)，5.26(1H，s)，3.83(3H，s)，3.73(1H，d，J＝13.2Hz)，3.64(1H，d，J＝13.2Hz)，2.55(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 485实施例114将化合物111(12mg)悬浮于乙酸(2.4ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.12ml)后，在50℃搅拌40分钟。减压浓缩反应混合物，所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物133(12mg)浅黄色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；12.64(1H，s)，11.53(1H，br)，7.13(1H，s)，5.88(1H，d，J＝5.5Hz)，5.84(1H，d，J＝5.5Hz)，4.30(1H，d，J＝14.2Hz)，4.19(1H，d，J＝14.2Hz)，4.04(3H，s)，2.66(3H，s)，1.22(9H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 589实施例115将化合物40(40mg)悬浮于乙酸(5.0ml)，加入亚硝酸钠(由Wako Pure Chemical Industries生产)(9.4mg)后，在40℃搅拌1.5小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物溶于乙酸乙酯(30ml)后，用盐水(2×10ml)来洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩；所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化而得到黄色粉末。将该粉末再用硅胶色谱纯化(用氯仿/甲醇/甲酸洗脱)，得到化合物132(21mg)黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.59(1H，s)，3.85(3H，s)，3.59(1H，d，J＝14.7Hz)，3.51(1H，d，J＝14.7Hz)，2.54(3H，s)，SI-MS谱(M+H)+m/z 504实施例116将化合物1(30mg)和按照文献[The Journal of Antibiotics，第40卷，第87页(1987)]的方法制备的碳酸环己基·1-碘乙酯(200mg)悬浮于二氯甲烷(3.0ml)；在冰冷却的条件下，加入三乙胺(20μl)，而后回流1小时。减压浓缩反应混合物，将所得剩余物溶于乙酸乙酯(30ml)后，用0.05M盐酸(10ml)、5％硫代硫酸钠水溶液(10ml)、水(2×10ml)和盐水(5ml)来洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩；所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物134(27mg)浅黄色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；12.86(1H，s)，8.79(1H，br)，7.17(1H，s)，6.74(1H，q，J＝5.4Hz)，4.62(1H，m)，4.07(3H，m)，3.72(1H，m)，3.58(1H，m)，2.64(3H，s)，2.01-1.16(10H，m)，1.51(3H，m)SI-MS谱(M+H)+m/z 629实施例117将化合物132(10mg)悬浮于乙酸(1.9ml)，加入30％过氧化氢水溶液(0.1ml)，而后在50℃搅拌2小时。浓缩反应混合物，所得剩余物经过硅胶色谱纯化(用氯仿/甲醇/甲酸洗脱)，得到化合物135(7.6mg)黄色粉末。1H NMR，CD3OD，50℃，δppm；4.25(1H，d，J＝14.6Hz)，4.11(1H，d，J＝14.6Hz)，3.92(3H，br s)，2.60(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 520实施例118以与实施例114同样的方式，氧化化合物72(75mg)，得到化合物136(35mg)黄色粉末1H NMR，DMSO-d6，50℃，δppm；12.29(1H，s)，6.97(1H，s)，4.89(1H，d，J＝13.7Hz)，4.79(1H，d，J＝13.7Hz)，3.73(3H，s)，2.59(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 499实施例119以与实施例114同样的方式，氧化化合物88(75mg)，得到化合物137(54mg)黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，50℃，δppm；12.95(1H，s)，7.03(1H，s)，4.28(1H，d，J＝14.2Hz)，4.17(1H，d，J＝14.2Hz)，3.86(3H，s)，3.25(3H，s)，2.59(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 552实施例120以与实施例114同样的方式，氧化化合物134(70mg)，得到化合物138(71mg)浅黄色粉末。1H NMR，CDCl3，δppm；12.64(1H，s)，7.11(1H，m)，6.85(1H，q，J＝5.4Hz)，4.65(1H，m)，4.30(1H，m)，4.15(1H，m)，4.04(3H，m)，2.65(3H，s)，2.02-1.16(10H，m)，1.58(3H，m)SI-MS谱(M+H)+m/z 645实施例121将化合物40(30mg)溶于DMF(3ml)，加入乙酸钯(II)(0.6mg)和三(2-甲苯基)膦(1.9mg)后，在室温下氩气中搅拌15分钟。在该溶液中，加入磷酸钾n-水合物(由Wako Pure ChemicalIndustries生产)(57mg)和在参考实施例10所制的2-噻吩硼酸丙二醇酯(18mg)后，在100℃氩气中搅拌反应混合物5小时。将该反应混合物悬浮于乙酸乙酯(30ml)中，用0.1M盐酸(2×10ml)、(3×10ml)和盐水(5ml)来洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后减压浓缩。所得剩余物经过制备高效液相色谱纯化，得到化合物126(9.6mg)浅黄色粉末。1H NMR，DMSO-d6，δppm；13.00(1H，s)，7.76(1H，d，J＝5.1Hz)，7.73(1H，d，J＝3.7Hz)，7.24(1H，dd，J＝5.1，3.7Hz)，3.94(3H，s)，3.60(2H，s)，2.53(3H，s)SI-MS谱(M+H)+m/z 541实施例122表达共刺激分子的CHO细胞的建立a)B7-1在CHO细胞中的表达使用直径10cm的培养皿，在含10％胎牛血清的αMEM培养基中，培养1×105中国仓鼠卵巢(CHO)细胞24小时。在这些细胞中，通过磷酸钙方法引入参考实施例1所制的B7-1 cDNA表达质粒pME-B7-1(10μg)和新霉素抗性表达质粒pME-neo(10μg)。48小时后，加入GENETICIN(G418硫酸盐，GIBCO)并使其最终浓度为0.5mg/ml，选出获得新霉素抗性的细胞。通过流式细胞术(EPICSELITE，COULTER)检测出所选出的细胞的B7-1表达，得到显示出B7-1高表达的细胞。通过有限稀释法克隆这些细胞而得到稳定表达高量B7-1的细胞系B7-1-CHO-22。b)CD28在CHO细胞的表达使用直径10cm的培养皿，在含有10％胎牛血清的αMEM培养基中，培养1×105二氢叶酸还原酶缺乏(DHFR-)CHO细胞24小时。通过磷酸钙方法，将在参考实施例1所制的CD28 cDNA表达质粒pAKKO-CD28(10μg)引入这些细胞。48小时后，用含10％渗析了的胎牛血清的αMEM培养基(不含核酸)替代该培养基，选出在染色体中掺入了质粒的细胞。通过流式细胞术(EPICS ELITE，COULTER)检测出这些选出细胞中CD28的表达，从而得到表现出高CD28表达的细胞。通过有限稀释法克隆这些细胞得到稳定表达高CD28量的细胞系CD28-CHO-11。c)产生可溶的B7-1-Ig的CHO细胞的建立使用直径10cm的培养皿，在含10％胎牛血清的αMEM培养基中，培养1×105二氢叶酸还原酶缺乏(DHFR-)CHO细胞24小时。通过磷酸钙方法，将10μg在参考实施例2所制的编码可溶B7-1-Ig的表达质粒引入这些细胞。48小时后，用含10％渗析了的胎牛血清的αMEM培养基(不含核酸)替代该培养基，选择在染色体中掺入质粒的细胞。通过EIA测出这些选出的细胞在培养上清液中制得的可溶性B7-1-Ig的量，从而得到表现出高生产力的细胞。通过有限稀释法克隆这些细胞，得到能稳定产生可溶性B7-1-Ig的细胞系sSB7-1-Ig-CHO-20。d)可溶性B7-1-Ig的制备使用直径15cm的培养皿，在含10％胎牛血清的αMEM培养基中培养在上述c)项中所得的产生可溶性B7-1-Ig的CHO细胞(sB7-1-Ig-CHO-20)，得到5l培养上清液。将该培养上清液用蛋白质G柱(Chromatop Superprotein G，20cm，I.D.×10cm，NGKInsulators，Ltd.)粗纯化后用凝胶过滤色谱(TSKgel G3000SW，21.5cm I.D.×600cm，Tosoh)再纯化，得到20mg纯化的标准制品。试验实施例1用可溶性B7-1-Ig的结合抑制试验将在实施例122中所得的表达CD28的CHO细胞悬浮于含10％渗析了的胎牛血清的αMEM培养基(不含核酸)，接种入96-孔微量培养板(平底)至3×104细胞/孔，而后在37℃，5％CO2存在下培养48小时。通过抽吸从细胞粘附的每一培养板上除去培养物上清液，而后加入含0.5％多聚甲醛的磷酸缓冲盐水(PBS)以固定该细胞。将该培养板用含10％Block Ace(Snow Brand Milk Products)的PBS洗两遍后，在每一孔中加入10μg/ml可溶性B7-1-Ig和试样。通过将培养板在室温下静置30分钟以进行结合反应。反应后，用含10％ BlockAce(Snow Brand Milk Products)的PBC洗培养板两遍，而后加入过氧化物酶-标记的抗-人IgG(Cappel)，再反应2小时。再将培养板用含10％Block Ace(Snow Brand Milk Proucts)的PBS洗两遍后，将100μl含6.5mg/ml邻苯二胺二盐酸盐(Wako Pure Chemical Industries)和0.06％过氧化氢的0.1M的柠檬酸缓冲剂加入每一孔。20分钟后，用2N硫酸结束显色反应，用培养板记数器(BIO--RAD Model1450)测定在492nm的吸收。一些化合物的IC50值(50％结合抑制的浓度)如表14所示。p

实验例2对人外周血液T细胞产生的白介素2(IL-2)的抑制实验将从健康普通人体内收集的血铺涂在淋巴细胞分离介质(LSM，Organon Teknica，Co.)上，在室温下以2000rpm离心20分钟，得到人外周血液单核细胞。将这些单核细胞施加到尼龙羊毛柱(Wako PureChemical Industries)并在37℃培育40分钟，而后收集未吸附的细胞以富集T细胞。在涂布有抗-CD3抗体(OKT3，Ortho DiagnosticSystems)的96-孔微量培养板(平底)上，以5×104细胞/孔的密度接种这些T细胞，然后，加入在实施例122中得到的表达B7-1的CHO细胞至1×104细胞/孔，并在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5％CO2存在下培养48小时。用HUMAN INTERLEUKIN-2 EIA KIT(Cayman Chemical Co.)对在培养物上清液中生成的IL-2进行定量。测得TAN-2421 A1的IC50值(抑制50％白介素-2产生的浓度)为10μg/ml。制剂实施例1使用TAN-2421 A1(化合物No.1)，将下述配方所示所有成分混合后填入胶囊，制成每粒含30mgTAN-2421 A1的胶囊制剂。
TAN-2421 A130mg乳糖 100mg玉米淀粉 40mg硬酯酸镁 10mg共计 180mg配方实施例2用可溶性淀粉水溶液，将TAN-2421A1和硬酯酸镁粒化。将该颗粒干燥后，与乳糖和玉米淀粉混合。将该混合物压制成下述配方所示的片剂。
TAN-2421 A1 30mg乳糖65mg玉米淀粉30mg可溶性淀粉35mg硬酯酸镁20mg共计180mg配方实施例3将TAN-2421 A1溶于含30％(W/V)聚乙二醇400的生理盐水溶液，制得0.005％的TAN-2421 A1溶液。在灭菌的条件下过滤该溶液，然后，将30ml每份该溶液注入一小瓶，制成每瓶含15mg TAN-2421 A1的静脉注射液。配方实施例4将TAN-2421 A1(40mg)和甘露糖醇(50g)溶于含聚乙二醇400(30％ W/W)的灭菌了的蒸馏水(1升)。在灭菌的条件下过滤该溶液，然后，将1ml该溶液注入1安瓿，制成每瓶含40μg TAN-2421 A1的静脉注射液。毒性实验当以400mg/kg TAN-2421 A1对小鼠腹膜内给药时，无小鼠死去。
序列表关于SEQ ID NO1的信息(I)序列特征(A)长度663(B)类型核苷酸(C)链双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGCTCAGGC TGCTCTTGGC TCTCAACTTA TTCCCTTCAA TTCAAGTAAC AGGAAACAAG60ATTTTGGTGA AGCAGTCGCC CATGCTTGTA GCGTACGACA ATGCGGTCAA CCTTAGCTGC120AAGTATTCCT ACAATCTCTT CTCAAGGGAG TTCCGGGCAT CCCTTCACAA AGGACTGGAT180AGTGCTGTGG AAGTCTGTGT TGTATATGGG AATTACTCCC AGCAGCTTCA GGTTTACTCA240AAAACGGGGT TCAACTGTGA TGGGAAATTG GGCAATGAAT CAGTGACATT CTACCTCCAG300AATTTGTATG TTAACCAAAC AGATATTTAC TTCTGCAAAA TTGAAGTTAT GTATCCTCCT360CCTTACCTAG ACAATGAGAA GAGCAATGGA ACCATTATCC ATGTGAAAGG GAAACACCTT420TGTCCAAGTC CCCTATTTCC CGGACCTTCT AAGCCCTTTT GGGTGCTGGT GGTGGTTGGT480GGAGTCCTGG CTTGCTATAG CTTGCTAGTA ACAGTGGCCT TTATTATTTT CTGGGTGAGG540AGTAAGAGGA GCAGGCTCCT GCACAGTGAC TACATGAACA TGACTCCCCG CCGCCCCGGG600CCCACCCGCA AGCATTACCA GCCCTATGCC CCACCACGCG ACTTCGCAGC CTATCGCTCC660关于SEQ ID NO2的信息(I)序列特征(A)长度867(B)类型核苷酸(C)链双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2ATGGGCCACA CACGGAGGCA GGGAACATCA CCATCCAAGT GTCCATACCT CAATTTCTTT 60CAGCTCTTGG TGCTGGCTGG TCTTTCTCAC TTCTGTTCAG GTGTTATCCA CGTGACCAAG 120GAAGTCAAAG AAGTGGCAAC GCTGTCCTGT GGTCACAATG TTTCTGTTGA AGAGCTGGCA 180CAAACTCGCA TCTACTGGCA AAAGGAGAAG AAAATGGTGC TGACTATGAT GTCTGGGGAC240ATGAATATAT GGCCCGAGTA CAAGAACCGG ACCATCTTTG ATATCACTAA TAACCTCTCC300ATTGTGATCC TGGCTCTGCG CCCATCTGAC GAGGGCACAT ACGAGTGTGT TGTTCTGAAG360TATGAAAAAG ACGCTTTCAA GCGGGAACAC CTGGCTGAAG TGACGTTATC AGTCAAAGCT420GACTTCCCTA CACCTAGTAT ATCTGACTTT GAAATTCCAA CTTCTAATAT TAGAAGGATA480ATTTGCTCAA CCTCTGGAGG TTTTCCAGAG CCTCACCTCT CCTGGTTGGA AAATGGAGAA540GAATTAAATG CCATCAACAC AACAGTTTCC CAAGATCCTG AAACTGAGCT CTATGCTGTT600AGCAGCAAAC TGGATTTCAA TATGACAACC AACCACAGCT TCATGTGTCT CATCAAGTAT660GGACATTTAA GAGTGAATCA GACCTTCAAC TGGAATACAA CCAAGCAAGA GCATTTTCCT720GATAACCTGC TCCCATCCTG GGCCATTACC TTAATCTCAG TAAATGGAAT TTTTGTGATA780TGCTGCCTGA CCTACTGCTT TGCCCCAAGA TGCAGAGAGA GAAGGAGGAA TGAGAGATTG840AGAAGGGAAA GTGTACGCCC TGTATAA867关于SEQ ID NO3的信息(I)序列特征(A)长度1428(B)类型核苷酸(C)链双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGGGCCACA CACGGAGGCA GGGAACATCA CCATCCAAGT GTCCATACCT CAATTTCTTT60CAGCTCTTGG TGCTGGCTGG TCTTTCTCAC TTCTGTTCAG GTGTTATCCA CGTGACCAAG120GAAGTCAAAG AAGTGGCAAC GCTGTCCTGT GGTCACAATG TTTCTGTTGA AGAGCTGGCA180CAAACTCGCA TCTACTGGCA AAAGGAGAAG AAAATGGTGC TGACTATGAT GTCTGGGGAC240ATGAATATAT GGCCCGAGTA CAAGAACCGG ACCATCTTTG ATATCACTAA TAACCTCTCC300ATTGTGATCC TGGCTCTGCG CCCATCTGAC GAGGGCACAT ACGAGTGTGT TGTTCTGAAG360TATGAAAAAG ACGCTTTCAA GCGGGAACAC CTGGCTGAAG TGACGTTATC AGTCAAAGCT420GACTTCCCTA CACCTAGTAT ATCTGACTTT GAAATTCCAA CTTCTAATAT TAGAAGGATA480ATTTGCTCAA CCTCTGGAGG TTTTCCAGAG CCTCACCTCT CCTGGTTGGA AAATGGAGAA540GAATTAAATG CCATCAACAC AACAGTTTCC CAAGATCCTG AAACTGAGCT CTATGCTGTT600AGCAGCAAAC TGGATTTCAA TATGACAACC AACCACAGCT TCATGTGTCT CATCAAGTAT660GGACATTTAA GAGTGAATCA GACCTTCAAC TGGAATACAA CCAAGCAAGA GCATTTTCCT 720GATCATCAGG AGCCCAAATC TTCTGACAAA ACTCACACGT CTCCACCGTC CCCGGCGCCT 780GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA CACCCTCATG 840ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG GTGGTGGACG TGAGCCACGA AGACCCTGAG 900GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG 960GAGGAGCAGT ACAACAGCAC GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC 1020TGGCTGAATG GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC 1080GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA CACCCTGCCC 1140CCATCCCGGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC 1200TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG 1260ACCACGCCTC CCGTGCTGGA CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTATAGCAA GCTCACCGTG 1320GACAAGAGCA GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1380CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCCCCGG GTAAATGA1428关于SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(A)长度(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核苷酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4TGGATCCATG GGCCACACAC GGAGGCAGGG AAC33关于SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(A)长度(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核苷酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5TGGATCCTTA TACAGGGCGT ACACTTTCCC TTCTC34关于SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(A)长度(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核苷酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6TCTCGAGGTC GACATGCTCA GGCTGCTCTT GGCTC35关于SEQ ID NO7的信息(I)序列特征(A)长度(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核苷酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO7AACTAGTTCA GGAGCGATAG GCTGCGAAG 29关于SEQ ID NO8的信息(I)序列特征(A)长度(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核苷酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8CTTTGATATC ACTAATAACC TC22关于SEQ ID NO9的信息(I)序列特征
(A)长度(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核苷酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9GGTGATCAGG AAAATGCTCT TGCTTGGTTG 30关于SEQ ID NO10的信息(I)序列特征(A)长度(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核苷酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GGTGATCAGG AGCCCAAATC TTCTGACAAA ACTCACACGT CTCCACCGTC CCCGGCGCCT60GAACTCCTG69关于SEQ ID NO11的信息(I)序列特征(A)长度(B)类型核苷酸(C)链单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核苷酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11CCCTGCAGTC TAGATCATTT ACCCGGGGAC AGGGAG 3权利要求
1.如下通式表示的化合物或其盐
其中R1为可被酯化或酰胺化的羧基；R2为氢原子，羟基或可被取代的烃基；R3和R4相同或不同，并且为可被取代的羟基；R5和R6相同或不同，并且为氢原子或卤原子；R7为氢原子，硝基，卤原子，可被取代的烃基，可被取代的杂环基或可被取代的酰基；n为0-2的整数；Y为氧原子或两个氢原子；并且当n为0，R2可为下式表示的基团
其中符号的含义同上。
2.根据权利要求1的化合物，其中R7为氢原子或卤原子。
3.根据权利要求1的化合物，其中R2为-CH2(CHOH)m-R2’表示的基团，其中m为0或1，并且R2’为可被酯化或酰胺化的羧基或可被取代的羟基甲基；R7为氢原子；并且Y为氧原子。
4.根据权利要求1的化合物，其中R2为(i)氢原子，(ii)羟基或(iii)可被选自下列基团的取代基取代的C1-19烃基，所述取代基选自(a)C1-8烷氧羰基羰基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1- 6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(i)硝基，(j)卤素和(j)氧代；R3和R4可相同或不同，并且为可被下列基团取代的羟基(a)酰基或(b)可被取代的C1-10烷基；R7为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)可被选自下列基团的取代基取代的C1-19烃基，所述取代基选自(a)可被酯化或酰胺化的羧基，(b)可被酰化的羟基，(c)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(d)C1-6烷氧基，(e)氰基，(f)磺基，(g)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(h)硝基，(i)卤素和(j)氧代，(v)可被选自下列基团的取代基取代的5或6元杂环基(a)C1-6烷基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)硝基，(i)卤素和(j)氧代，或(vi)可被选自下列基团的取代基取代的酰基，所述取代基选自(a)C1-6烷基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-10烷基，C1-6链烷酰基，C1-6烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被C1-6烷基，C1-6烷氧基，硝基，氰基，氨基，卤素，羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(i)硝基，(j)卤素和(k)氧代，或稠合的此杂环基团。
5.根据权利要求1的化合物，其中R1为可被酯化的羧基；R2为(i)氢原子，(ii)羟基，(iii)可被选自下列基团的取代基取代的C1-10烷基，所述取代基选自(a)C1-8烷氧羰基羰基，(b)可酯化或酰胺化的羧基，(c)可被酰化的羟基，(d)可被C1-4烷基磺酰基或C6-14芳基磺酰基取代的氨基，(e)C1-6烷氧基，(f)氰基，(g)磺基，(h)可被羟基或氧代取代的5或6元杂环基，(iv)可被羧基取代的C2-8链烯基，(v)可被选自下列基团的取代基取代的C7-19芳基烷基，所述取代基选自(a)氰基，(b)可被酯化或酰胺化的羧基，(c)羟基，(d)硝基，(e)卤素和(f)5或6元含氮杂环基；R3和R4为(i)可被C1-7酰基取代的羟基或(ii)可被C1-6烷氧基取代的C1-10烷氧基；R7为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)C1-10烷基，(v)可被选自下列基团的取代基取代的C6-14芳基(a)C1-6烷基，(b)羧基，(c)C1-6烷氧基，(d)氨基，(e)硝基和(f)卤素，(vi)C1-6链烷酰基，或(vii)除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的5或6元杂环基或它与苯环稠合的杂环基。
6.根据权利要求1的化合物，其中R1为-COOR28表示的基团，其中R28为氢原子或可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基；R2为(i)氢原子，(ii)羟基；(iii)式-CH2(CHORb)m1COOR29表示的基团，其中m1为0或1，Rb为氢原子或C1-6链烷酰基，R29为氢原子或可被C1-6烷氧基，C1-6氧基或C4-7环烷氧基羰氧基取代的C1-8烷基，(iv)式-CH2(CHOH)m2CONR30R31表示的基团，其中m2为0或1，R30和R31相同或不同，为氢原子或可被羧基、C1-6烷氧基或C2-5烷氧羰基取代的C1-8烷基，(v)式-CH2(CHOH)m3CONHS(＝0)2R32表示的基团，其中m3为0或1，R32为可被1-3个卤原子取代的C1-4烷基或可被C1-6烷基，硝基，C1-6烷氧基或卤素取代的C6-14芳基，(vi)式-CH2(CHOH)m4CONHOR33表示的基团，其中m4为0或1，R33为氢原子或C1-4烷基，(vii)式-CH2(CHOH)m5R34表示的基团，其中m5为0或1，R34为除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基，它可被羟基或氧代所取代，(viii)式-CH2(CHOH)m6-CH2OR35表示的基团，其中m6为0或1，R35为氢原子，C1-8烷基或C1-6链烷酰基，(ix)式-CH2(CHOH)m7-COCOOR36表示的基团，其中m7为0或1，R36为氢原子或C1-8烷基，(x)可被羧基取代的C2-8烷基，或(xi)可被如下基团取代的C7-19芳烷基羧基，氰基，卤素，硝基，羟基，氨基甲酰基，C2-5烷氧羰基或除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基；R3为式-OR37表示的基团，其中R37为氢原子，可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基或C1-6链烷酰基；R4为(i)式-OR38表示的基团，其中R38为(a)氢原子，(b)可被C1-6烷氧基取代的C1-8烷基，(c)C1-6链烷酰基或(d)C7-11芳酰基；或(ii)式-OCOOR39表示的基团，其中R39为C1-6烷基或C6 -14芳基；以及R7为(i)氢原子，(ii)硝基，(iii)卤原子，(iv)C1-8烷基，(v)可被卤素、羧基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氨基或硝基取代的C6-14芳基，(vi)C1-6链烷酰基或(vii)除了碳原子外还含有1-4个选自氮、氧和硫原子的杂原子的3-8元杂环基或它与6-8元碳环基或6-8元杂环基稠合的杂环基。
7.根据权利要求1的化合物，其中R2为式-CH2COOR40表示的基团，其中R40为氢原子或可被C1-6烷氧基、C1-6链烷酰基氧基或C4-7环烷氧基羰氧基取代的C1-4烷基；R3和R4为羟基；R5和R6为氯原子；和R7为氢原子，硝基，溴原子或碘原子。
8.根据权利要求1的化合物，其中n为0或1。
9.根据权利要求1的化合物，其中Y为氧原子。
10.根据权利要求1的化合物，它用下式表示
其中R51和R61相同或不同，为氢原子或氯原子。
11.根据权利要求1的化合物，它用下式表示
其中R52和R62相同或不同，为氢原子或氯原子。
12.根据权利要求1的化合物，其中化合物为(1)2-(羧基甲基亚磺酰基)-5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(2)2-(羧基甲基亚磺酰基)-5，7-二氯-3，8-二羟基-4-碘-6-甲基-9-氧代-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(3)5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-2-(新戊酰氧基甲氧基羰基甲硫基)-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，(4)5，7-二氯-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-2-(新戊酰氧基甲氧基羰基甲基亚磺酰基)-9H-呫吨-1-羧酸甲酯，或(5)5，7-二氯-2-[1-(环己氧基羰氧基)乙氧羰基甲硫基]-3，8-二羟基-6-甲基-9-氧代-9H-呫吨-1-羧酸甲酯。
13.制备根据权利要求10或11的化合物或其盐的方法，包括在介质中培养属于曲霉属的并且能够产生该化合物的微生物，产生化合物使其聚集在培养物中，然后收集化合物。
14.能够产生权利要求10或11的化合物的微生物即土曲霉属FL-67283菌株。
15.一种药物组合物，含有权利要求1的化合物或其盐。
16.抑制T-细胞信号转导的组合物，含有权利要求1的化合物或其盐。
17.根据权利要求15的药物组合物，为免疫调节剂。
18.根据权利要求17的药物组合物，其中免疫调节剂为移植物排斥抑制剂，或治疗变应性疾病、类风湿性关节炎、自身免疫疾病、肾炎或糖尿病的组合物。
19.制备权利要求1的化合物或其盐的方法，所述化合物用如下通式表示
其中R2为氢原子或可被取代的烃基，R1为可被酯化或酰胺化的羧基；R3和R4相同或不同，为可被取代的羟基；R5和R6相同或不同，为氢原子或卤原子；R7为氢原子，硝基，卤原子，可被取代的烃基，可被取代的杂环基或可被取代的酰基；Y为氧原子或两个氢原子；方法包括使如下通式表示的化合物或其盐进行还原反应
其中各符号同上，如果需要的话，接着进行引入烃基的反应。
20.一种抑制哺乳动物的T-细胞的信号转导的方法，包括给哺乳动物施用有效量的权利要求1的化合物或其盐。
21.哺乳动物免疫调节的方法，包括给哺乳动物施用有效量的权利要求1的化合物或其盐。
22.治疗或预防哺乳动物的移植物排斥、变应性疾病、类风湿关节炎、自身免疫疾病、肾炎或糖尿病的方法，包括给哺乳动物施用有效量的权利要求1的化合物或其盐。
23.权利要求1的化合物或其盐用于制备T-细胞信号转导抑制剂的用途。
24.权利要求1的化合物或其盐用于制备免疫调节剂的用途。
25.权利要求1的化合物或其盐用于制备移植物排斥抑制剂或治疗变应性疾病、类风湿关节炎、自身免疫疾病、肾炎或糖尿病的药物组合物的用途。
26.一种筛选具有抑制或增强CD28与B7-1结合的活性的化合物或其盐的方法，包括将(1)当含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性的B7-1-Ig接触时，所得的CD28和B7-1-Ig之间的结合的量与(2)当含有CD28的CHO-细胞或其细胞膜部分与可溶性的B7-1-Ig和试验化合物接触时，所得的CD28和B7-1-Ig之间的结合的量进行比较。
27.一种筛选具有抑制IL-2产生的活性的化合物或其盐的方法，包括将(1)当含有B7-1的CHO-细胞或其细胞膜部分与T-细胞接触时，产生IL-2的量与(2)当含有B7-1的CHO-细胞或其细胞膜部分与T-细胞和试验化合物接触时，产生IL-2的量进行比较。
28.具有抑制或增强CD28与B7-1结合的活性的化合物或其盐，它是通过使用权利要求26的筛选方法得到的。
29.具有抑制IL-2产生的活性的化合物或其盐，它是通过使用权利要求27的筛选方法得到的。
30.用CD28-CHO-11(FERM BP-5431)表示的CHO细胞，用B7-1-CHO-22(FERM BP-5430)表示的CHO细胞或用sB7-1-Ig-CHO-20(FERM BP-5432)表示的CHO细胞。
全文摘要
如下通式表示的呫吨衍生物或其盐:其中各符号的含义同说明书,上述化合物能抑制B7－1与CD28的结合,防止T细胞的B7－1依赖性活化以及抑制由T细胞产生IL－2,从而用作免疫调节剂如移植物排斥抑制剂,或治疗变应性疾病、类风湿关节炎、自身免疫疾病、肾炎或糖尿病等的药物组合物。
文档编号C12N1/15GK1171400SQ9710953
公开日1998年1月28日 申请日期1997年3月4日 优先权日1996年3月5日
发明者飞田恒明, 服部正彦, 黑川勉, 中西淳 申请人:武田药品工业株式会社