专利名称：制备生物杀鼠剂的方法
技术领域：
本发明涉及杀生物剂领域，尤其是以工业规模获得可用于害鼠控制的微生物源杀鼠物质的方法及通过此方法得到的物质。
在世界各地害鼠引起严重的经济损失。它们不仅毁坏庄稼，食品和工业储备品，也是传染性疾病的携带者。
因此，对抗这些动物具有重要的经济价值，并且也在预防它们传播的疾病中起着重要的作用。
鼠害控制有不同的方法，但最常用的是机械的、化学的和生物的方法(微生物方法包括在后者中)。
以陷阱，诱饵等为基础的机械方法可成功地应用于小面积地区，但它们在大面积区域效果较差。
化学方法是以含不同类型毒药的诱饵的使用为基础的。上述的一些产品(例如磷化锌、单氟乙酸钠1080)具有很明显的作用，且摄入后会引起立即死亡，但由于必须使用高浓度的非选择性毒物，它们对其它品种毒性很高。
抗凝物质是经常使用的化学方法。第一代的上述物质出现在五十年代，其中最常用的是3-α-苄基丙酮基-4-羟香豆素(杀鼠灵)，杀鼠迷，氯鼠酮和敌鼠。当使用这些化合物时，鼠死亡发生在摄取之后5至7天，所以不出现对诱饵的排斥或反应。但为了更有效的控制，在处理地区保持大量诱饵是必要的，因为这些物质只在反复服药之后才能发挥其作用，并且鼠必须在几天之内摄取诱饵以达到致死剂量。
在六十年代中期，对传统抗凝剂的抗性问题开始出现。这导致了第二代抗凝剂的发展，如溴敌隆和溴鼠隆(klerat)。
通常，化学方法的缺点在其重复作用之后表现出来，鼠不能本能地摄取诱饵，这减低了产品的有效性。另一方面，这些产品对人，家畜和有益的动物群是有害的。
生物方法是以使用控制鼠种群的天敌为基础的。通常，它们基于用引起传染性疾病的微生物进行鼠类的人工感染，导致动物致死的流行病。这些方法中，特殊的有机物是对每个动物品种有用的。
为了得到抗鼠的单致病菌株，使用了不同的培养基，其中包括肉胨肉汤，面包和啤酒酵母，牛奶，豌豆，血液，水解血清(肉粉水解液和酵母肉汤水解液)，它们用于培养微生物接种物，上述接种物以后将用于生产主要培养物以得到谷粒制剂。
从谷粒得到的细菌制剂是在鼠中引起斑疹伤寒的细菌菌株培养物，其生长在不同的谷物上，其中包括小麦，大麦，大米、燕麦或黑麦。这种在固体培养基上的发酵比用液体培养基能得到较多的微生物生长量。
本发明的目的是提供制备用于害鼠控制的高效微生物杀鼠剂的方法。此方法使我们得到使用的较高滴度的病菌，其保证终产品的高有效性，以及制备时间的减少。本申请的另一目的是用此方法得到的杀鼠化合物。其对鼠类具有高的致病性和病毒性，可引起致命的动物流行病。
本发明为具杀生物活性的制剂的制备，有三个主要的成分1.肠炎沙门氏菌株。
2.增效的溶液。
3.发酵用培养基，完全由大米组成。
上述三个组成制剂的成分通过两个相当连贯的步骤而一体化；a.制备含增效物质的无菌大米基础底物并调节其pH。
b.得到肠炎沙门氏菌接种物并在a中接种。
通常，步骤开始时选择并洗涤将用作底物的大米。第一步是分离出在所选大米中的不纯物。将13％含水量的大米先于80℃的热水中洗近20分钟，并且排干洗涤用水。接着对此底物进行消毒步骤，于121℃，1.2巴压力，消毒35至45分钟。之后立即冷却底物并干燥直至其达含水量20至30％和温度37℃，然后与含0.9％氢氧化钠和0.1％杀鼠灵钠盐(3-α-苄基丙酮基-4-羟香豆素)的混合溶液混合，边摇晃边加入，需15分钟的时间，其用作制备物致死作用的增强剂。
此时，进行混合物的pH调节，其应在7.4至8之间。
之后立即用肠炎沙门氏菌肠道亚种1亚类，D组菌株(其保藏于这些微生物的可得到的保藏单位)接种得到的底物。此接种以这样的方式进行，使混合物中原始浓度为108菌群形成单位(CFU)/mL的微生物终浓度在以固体状态短暂发酵4小时之后变成109CFU/mL。
为了得到前述步骤的接种物，我们开始进行微生物的预培养，以待发酵体积1至1.5％的比率将其转移至100L含有营养肉汤的发酵器中，调节发酵条件为温度37℃，pH7.4至7.6，在400至600r.p.m.下振荡和在0.1至1.0v.v.m下通气。发酵时间3至5小时并且最终得到滴度在1至2×1010菌群形成单位(CFG)的接种物。
在5至9℃的温度下，我们最终得到一批杀鼠产品，待加以包装并储存；在这些条件下产品的稳定性能长时间保持。
上述产品是含用作诱饵的谷粒(小麦，大米、黑麦，燕麦，小米等)的杀鼠化合物。其也含用作增效剂的物质，增效剂由氢氧化钠和3-α苄基丙酮基-4-羟香豆素的混合溶液和滴度为106至109CFU的肠炎沙门氏菌肠道亚种，亚类1，D组菌株接种物组成。
随后将这样得到的物料包装并储存。
终产品的生物试验显示出100％致死率，死亡发生在鼠摄取之后4至12天，这表明了其有效性方面的生物性质明显增加，这主要是由于得到的产品的病毒性和致病性。
作为其主要的性质，所述的产品有较高的有效性，以及稳定性，可冷冻保存一年，5至15℃保存6个月，在室温保存30天。
由于本发明提供了为获得杀鼠化合物而能扩大至工业水平的方法，为了得到有合适质量和稳定性的大批量产品其方法限定了足够的操作和参数，因此，通过使用本领域已知的机械设备，可以实现上述工业水平的生产规模。
实施例
实施例1制备接种物将一微滴深度冷冻的肠炎沙门氏菌，肠道亚种，1亚类，D组菌株的培养物加入到富集液体培养基中，将其在180r.p.m.的筛机中于37℃培养4小时，由此培养得到1010CFU滴度的预培养物，之后将其转移至含营养肉汤的液体培养基发酵器中，肉汤组成是细菌学胨-5.0g/L营养提取物-1.0g/L酵母提取物-2.0g/LElna -5.0g/L实施例2杀鼠化合物的机械化制备作为诱饵和致病菌生长底物的大米是可以散装提供的，或袋装的清洁大米。
不纯物从大米中分离出来后，将大米放入储存干净大米的桶中，每个桶容积17M.T.。
如果大米以干净的袋包装提供，将其装在独轮车中送至货运电梯上，电梯将它们直接送至磨粉机漏斗，地窖中的散装大米也将用电梯和传送带送到那里。
定量的磨粉机漏斗能装入容量650kg的大米，控制和保证对所述方法必要的大米的重量，每批以每1小时和5小时交替着进行。
含水量13％的大米从定量的磨粉机漏斗卸到一个容器中，在该容器中将进行组成杀鼠化合物的不同组分的整个加工过程。
之后立即注入去矿物质的水并在80℃加热，直至水覆盖全部大米，保持35分钟。同时随着水的注入起动混合机械装置。
此机械作用使在20分钟内洗涤大米成为可能。然后排干用于洗涤的水。
再次保持真空5分钟，注入80℃的热水225L。在此期间混合机保持工作。同时，压力控制在1.2巴，温度在121℃，向所述的容器直接注入气体。当在容器中达到上述参数时，进行无菌处理45分钟。
然后冷却大米并干燥直到含水量27％至28％，温度37℃。
之后立即向容器注入含0.9％氢氧化钠和0.1％杀鼠灵钠盐的混合溶液。当注入所述的混合溶液282L时，继续此操作60分钟。继续用混合溶液对大米进行冷却处理直到温度37℃。然后调节混合物pH直至7.4到8。
之后，立即注入稀释的接种物141L，与前面用混合溶液处理的大米混合，直至混合物最终均一。此步骤结束时，样品送质检。
然后，装在容器内的产品送至填充机的磨粉机漏斗。全部上述循环必须在6小时内完成，使得到1125kg杀鼠化合物成为可能。
权利要求
1.使用谷物作为诱饵，活性成分是单致病微生物和抗凝剂的微生物杀鼠化合物的制备方法，其特征在于通过在液体营养培养基中发酵肠炎沙门氏菌，肠道亚种1亚类、D组得到高浓度接种物，接着将其用来接种事先与混合溶液混合的诱饵，混合溶液由氢氧化钠和杀鼠灵钠盐(3-α-苄基丙酮基-4-羟基香豆素)组成，混合溶液作为所述化合物的增强剂。
2.根据权利村要求1的方法，在37℃，pH7.4至7.6，以400至600r.p.m.振荡和0.1至1.0v.v.m.通气条件下，用适当的液体营养培养基发酵3至5小时，得到肠炎沙门氏菌株、肠道亚种、1亚类、D组的高浓度接种物。
3.根据权利要求1的方法，其中预先选择并用热水洗涤含水量13％的大米，于121℃和1.2巴下进行35至45分钟灭菌处理，冷却并干燥至含水量20至30％和温度37℃，之后，将大米与含0.9％氢氧化钠和0.1％杀鼠灵钠盐(3-α-苄基丙酮基-4-羟香豆素)混合溶液混合，边摇晃边加入混合溶液，混合进行15分钟。
4.根据权利要求3所述的方法，其中随后再次冷却混合物并干燥至含水量20至25％，温度近37℃，将其pH调节至7至8。
5.根据权利要求4的方法，其中以这样的方法接种底物使得在混合物中微生物的起始浓度是108CFU/mL的底物，在固体状态下短暂发酵4小时之后微生物的最终浓度成为109CFU/mL。
6.用在上述权利要求中所描述方法制备的杀鼠化合物，其中包括用作诱饵的含水量50至56％的约62.5％谷物，约12.5％的肠炎沙门氏菌肠道亚种、1亚类、D组接种物，将其稀释使在最终化合物中得到约109CFU的微生物浓度，和约25％含杀鼠灵钠盐作为增强剂的混合溶液。
全文摘要
本发明涉及杀生物剂领域,尤其是以工业规模制备微生物源杀鼠物质的方法。本发明提供的方法基于制备所用的物质,及其用肠炎沙门氏菌株发酵的方法标准化,上述菌株被用作控制鼠害的杀生物物质。本发明还使用增强所述微生物致死效果的抗凝剂化合物。
文档编号C12R1/42GK1194781SQ9711164
公开日1998年10月7日 申请日期1997年4月3日 优先权日1995年10月4日
发明者A·J·阿莱曼阿古斯逖, E·福斯特斯米利安, J·A·夫拉加卡斯特罗, R·艾斯皮诺莱里纳, J·G·伯诺特罗麦罗, O·蒙特斯迪奥卡希格勒 申请人:生物医药研究所