非－m、非－o、hiv－1毒株、片段及应用的制作方法

专利名称：非－m、非－o、hiv－1毒株、片段及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及非-M、非-O HIV-1族的逆转录病毒毒株，尤其涉及一种称为YBF30的毒株，涉及其片段及其作为诊断试剂和免疫原性制剂的应用。
人类获得性免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2是逆转录慢病毒，这类病毒存在于许多非洲灵长类中。所有的这些病毒看来有一个共同的祖先；然而，要预先判断这些不同的病毒是在什么时期从这个前体分离是非常困难的。更为远缘但属于同族的其它病毒，存在于其它哺乳动物中(有蹄动物和猫科动物)。
所有这些病毒与长期感染有关；在天然感染的猴中症状的缺乏是普遍规律。
由于其与Sooty Mangabey(西部非洲)病毒很强的同源性，HIV-2的起源看来是较明确的，但在猴中没有发现与HIV-1密切关联的病毒。关系最为密切的病毒是在两只黑猩猩中发现的病毒(CPZGABSIV，ANT SIV)。
业已发现所有的慢病毒都显示出很大的遗传变异性，对这些获自许多不同地理位置的变种进行的种系发生学研究，已使得HIV-1的8个亚型(分化枝)得到区别分类，它们各自之间都是等距的。分化枝仅是一种变异性表达的数字表示；基于氨基酸而不是核酸的表型学分析得出了不同的结果(Korber等人，1994)。
亚型的证实与一项种系发生学分析是一致的，到目前为止，种系发生学分析还没有任何病理生理学交联，但相反，却有地理对应性。这是因为每一种亚型主要见于一个特定的地理区域。B亚型主要见于欧洲和美国，而两种亚型即E和B，见于泰国，且传染方式(事实上与特定人群相对应)与所发现的亚型之间有很强的相关性。在非洲发现的所有分化枝及其在世界其它地区的分布，反映了沉溺于高危险行为的人们之间相互交流的可能性。主要的分化枝是分化枝A，之所以它是主要的，是因为在非洲的大部分地区都存在。在某些非洲国家已发现了很大程度的变异性(G.Myers，1994；P.M.Sharp等人，1994)。在西中部非洲国家如中非共和国(Murphy等人，1993)和喀麦隆(Nkengasong等人，1994)，某些亚型的特征已得以表征。
最后，携带HIV-1的病毒变种的病人已得到表征，对在法国市场销售的特定试剂盒来说，他们的血清已提出了检测问题，而且他们的确证性Western印迹是不典型的(Loussert-Ajaka等人，1994；Simon等人，1994；PCT国际申请WO 96/27013)。
对这些变种的分析证实了这样一个事实，即1型HIV病毒应被分为两个族，即M(主要)族和O(外围层)族，后者包括这些分离株，正如Charneau等人1994年提出的那样。对已知的O族病毒序列进行的同义突变/非同义突变比率分析表明，这一新族也是古老的，即使不比M族更为古老(Loussert-Ajaka等人，1995)。到目前为止，它的低流行率-即在喀麦隆被HIV-1感染病人的8％(Zekeng等人，1994)以及在法国确定的18例，被认为是由于纯粹的流行病学因素。
HIV-1的这两个族形成了一株形状象双星形骨针的树(图9-19)。两个分离株-即从加蓬的一只黑猩猩身上得到的CPZGAB SIV(Huet等人，1990)以及从Antwerp动物园的一只黑猩猩身上得到的CPZANT SIV，具有的序列和遗传结构与HIV-1有非常密切的关联，但它们并不属于这两个族中的任何一族，且在进化系统树上形成两个新枝。
对于开发用于检测HIV感染的足够敏感和特异的试剂，也就是说不会产生假阴性或假阳性结果的试剂，以及对于开发对既不属于M族、也不属于O族的亚型有保护作用的组合物，新亚型的证实是非常重要的。
因此，申请者自己制定了一个目标，即提供一种非-M、非-O毒株，以及来源于该毒株的序列，后者适用于检测非-M、非-OHIV变种，而且不会产生假阴性或假阳性结果。为了达到这个目的，发明者特地建立了一个规则系统，用于区别并确证M族和O族HIV-1感染，据此使他们能够选择非-M、非-O变种。
本发明涉及一种非-M、非-O HIV-1毒株，它显示也一种逆转录病毒的形态和免疫学特征，该逆转录病毒已于1996年7月2日保藏在国立微生物保藏中心，保藏号I-1753(命名为YBF30)，由巴斯德研究所保管。
非-M、非-O变种被认为是指一种1型HIV，从血清学和分子方面不能将其识别归属于这些族中的任何一族。
本发明还涉及以上定义的毒株(SEQ ID No.1)的完整核苷酸序列，以及涉及源自该毒株的、大小至少为10个核苷酸的核酸片段。
可能会提到的该类型的片段是-YBF 30 LTR(SEQ ID No.2)-YBF 30 GAG(SEQ ID No.3)(gag基因)-YBF 30 POL(SEQ ID No.5)(pol基因)-YBF 30 VIF(SEQ ID No.7)(vif基因)-YBF 30 VPR(SEQ ID No.9)(vpr基因)-YBF 30 VPU(SEQ ID No.11)(vpu基因)-YBF 30 TAT(SEQ ID No.13)(tat基因)-YBF 30 REV(SEQ ID No.15)(rev基因)-YBF 30 ENV gp160(SEQ ID No.17)(env基因)-YBF 30 NEF(SEQ ID No.19)(nef基因)-SEQ ID Nos.21-57，也被分别命名，YLG、LPBS.1、GAG YAS1.1、GAG Y AS1、GAG 6、GAG Y S1、GAG Y S1.1、GAG YS1.2、YRT AS1.3、YRT AS1.2、YRT AS1.1、YRT 2、YRT AS1、YRT 2.1、YRT2.2、YRT2.3、YRT2.4、4481-1、4481-2、4235.1、4235.2、4235.3、4235.4、SK69.6、SK69.5、SK69.4、SK69.3、SK69.2、SK69.1、SK68.1、SK68.2、SK68.3、LAI AS1.3、LSIAS1.2、LSI AS1.1、LSI A1、YLPA以及与以上核苷酸序列之一不同，或与这些序列之一不互补，但能够与来自一种非-M、非-OHIV-1病毒的核酸序列特异性杂交的任何序列。
这样的序列可被用于非-M、非-O HIV-1的特异性鉴别，且作为诊断试剂或单独或与其它试剂合在一起，用于任何HIV-1的特异性鉴别。
这些序列尤其可作为引物或探针用于诊断试验，包括或是与待测病毒序列的直接杂交，或是该病毒序列的扩增，这些试验应用一种包含至少10个核苷酸的寡核苷酸，后者包括在以上序列中的任何一个序列中，尤其是上述序列之一SEQ ID No.21-57。
本发明还涉及HIV-1病毒，其特征在于它们与M族和O族都不相同，而且显示以下特征*对M和O族的蛋白质几乎没有或没有血清学反应性，而对源自YBF30毒株或CPZGABSIV毒株的蛋白质却有很强的血清学反应性；*当应用来自M和O族HIV-1病毒env和gag区的引物时，无基因组扩增；*当来自以上定义的YBF30毒株的引物存在时，基因组扩增；以及*相对于YBF30毒株，包膜基因产物的同源性大于70％。
本发明还涉及上述序列的应用，以提供HIV-1型核酸序列的杂交和/或基因扩增的一种方法，这些方法可用于体外诊断非-M、非-OHIV-1型病毒在一个体的潜在感染。
这种体外诊断方法是应用一种生物样本(血清或循环淋巴细胞)进行的，它包括●提取待测核酸的步骤，核酸属于病毒的基因组，该病毒有可能存在于生物样本中，以及，在适当的时候，应用一种逆转录酶处理核酸的步骤，如果该核酸为RNA形式的话。
●至少一个循环，包括以下步骤使核酸变性，与至少一个根据本发明的序列杂交，以及，在适当的时候，延伸杂交物，后者是在适当的试剂(聚合剂，如DNA聚合酶和dNTP)存在时形成的，以及●检测属于非-M、非-O HIV-1族型病毒的基因组核酸的可能存在的步骤。
应用以下条件用于利用来源于YBF30毒株的引物进行PCR-根据酚/氯仿技术提取淋巴细胞DNA，在260nm波长用分光度法对其定量。所有的扩增都是应用Perkin Elmer 2400热循环仪进行的。
-长片段(9kb)PCR的进行应用了XL PCR试剂盒(PerkinElmer)按照生产商的条件、以及应用了dNTP、提供的缓冲液以及Perkin Elmer的“热启动(hot start)”，这一长片段PCR的扩增循环是●94℃，变性2分钟一个循环，●然后16个循环94℃15秒钟，55℃15秒钟，68℃8分钟，●然后24个循环94℃15秒钟，55℃15秒钟，68℃8分钟，每个循环另外增加15秒钟(加长)。
-对长片段PCR的扩增产物进行巢式PCR。进行巢式PCR的条件如下●“扩展高度精确PCR系统(Expand High Fidelity PCRsystem)”Tag聚合酶缓冲液和酶来自Boehringer Mannheim，按照生产商的说明进行，dNTP和“热启动”来自Perkin Elmer，●每dNTP各200μmol，根据本发明的每种引物各20pmol，DNA 5μl，10×PCR缓冲液10μl，以及Tag聚合酶2.6单位，体积为100μl，●扩增94℃2分钟一个循环，随后38个循环94℃15秒钟，55℃15秒钟，72℃延伸一段时间-根据待扩增PCR产物的大小，时间长短不一(从30秒至2分钟)，以及最后的延伸循环，72℃10分钟。
扩增产物优选应用直接测序检测。
本发明还涉及一种肽或一种肽片段，其特征在于它能被一种非-M、非-O HIV-1毒株表达，或应用一种上述核苷酸序列而被表达，而且它能够(1)被上述非-M、非-O HIV-1病毒、尤其是YBF30毒株或该毒株的变种诱导产生的抗体所识别，这些抗体存在于用非-M、非-O HIV-1毒株感染后获得的生物标本中，和/或(2)诱导抗非-M、非-O HIV-1抗体的产生。
可能会提到的这种类型的肽，尤其是来自YBF30毒株的肽，有gag基因表达的肽(SEQ ID No.4)、pol基因表达的肽(SEQ IDNo.6)、vif基因表达的肽(SEQ ID No.8)、vpr基因表达的肽(SEQID No.10)、vpu基因表达的肽(SEQ ID No.12)、tat基因表达的肽(SEQ ID No.14)、rev基因表达的肽(SEQ ID No.16)、env基因表达的肽(SEQ ID No.18)或其片段之一如V3环区的一个片段，即CTRPGNNTGGQVQIGPAMTFYNIEKIVGDIRQAYC (SEQ IDNo.58)，以及nef基因表达的肽(SEQ ID No.20)，或者能够识别上述非-M、非-O HIV-1感染期间产生的抗体的这些多肽的一个片段。
本发明还涉及免疫原性组合物，其包括根据本发明的核苷酸序列的一个或多个翻译产物，和/或上述、尤其是通过合成方法获得的肽中的一个。
本发明还涉及针对上述一个或多个肽的抗体，以及它们在提供用于在体外，尤其是特异性诊断HIV-1型病毒在一个体的感染的方法的用途，利用的方法是本领域熟练的技术人员所熟知的。
本发明包括所有的、能被从获自非-M、非-O HIV-1毒株感染后的感染血清中分离的抗体所识别的肽，以及能够被根据本发明的一种抗体所识别的肽。
本发明进一步涉及一种在体外诊断非-M、非-O HIV-1病毒的方法，该方法的特征在于它包括使一种取自病人的生物标本接触根据权利要求10的抗体，其可能会与抗-CPZGAB SIV抗体结合，以及检测可能存在于该生物样本中的HIV-1抗原与该抗体之间形成的免疫复合物。
本发明还涉及一种用于诊断HIV-1的试剂盒，该试剂盒的特征在于它包括至少一种根据本发明的试剂。
除上述条款外，本发明还包括其它条款，这在以下描述中物是显而易见的，以下描述提及实施作为本发明之主题的方法的实例，并提及附图，其中
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图1-7显示了不同的引物在YBF30毒株基因组上的位置；-图8显示了YBF30毒株的基因组结构；-图9-16描绘了与M族HIV-1和O族HIV-1相比，YBF30毒株不同基因的系统发生学分析(图91tr基因，图10gag基因，图11tat基因，图12rev基因，图13vif基因，图14env gp120基因，图15env gp41基因，图16nef基因，图17pol基因，图18vpr基因，图19vpu基因，)；-图20显示了YBF30与HIV-1/GPZGAB SIV之间的百分比遗传距离。
不过，理所当然应予理解的是，这些实施例只是以说明本发明的主题方式提供的，它们绝不对本发明构成限制。
实施例获得根据本发明的非-M、非-O HIV-1变种(YBF30)及其应用联系到在喀麦隆的对人类免疫缺陷病毒(HIV)感染进行的流行病学研究，这尤其是可能的，其流行病学是特别似非而是的。在这个国家，毒株的多样性非常突出，目前已知的HIV-1病毒M(主要)族的大多数亚型都有报道。O族(O代表外围层)高度多样性的HIV-1病毒的感染病例已有报道，几乎仅见于喀麦隆血统的病人。HIV-2、HTLV-1和HTLV-2亚型A和B感染病例也有报道。
以先前的血清学和基因型评估结果为基础，本发明者建立了一种区分并确证M族和O族HIV-1病毒感染的规则系统，以选择非-M、非-O变种。
这些方法被用到送至雅温得国家参比实验室检测HIV感染的标本上，使之有可能鉴定出一种高度多样性的HIV分离株，并明确用于鉴定一种新的HIV-1族的工具，其中将观察到的这种人类毒株YBF30与猿毒株CPZGABSIV之间的同源性考虑在内。I-在流行病学研究中从血清学上鉴定YBF30变种的方法
1)采集标本研究了1994年和1995年送至雅温得参比实验室以检测或确证HIV感染的全部成年病人血清(n＝8831)。
2)从血清学上区别M族和O族HIV-1，并选择变种如果抗-HIV抗体检测为阳性(Genelvia Mixt间接混合HIV-1和HIV-2 EIA，Sanofi-Pasteur，巴黎，法国)，那么，根据与M族特异性抗原竞争的原理，将其与EIA试验结合(Wellcozyme Rec HIV-1，Murex，Dartford，英国)。
如果竞争Wellcozyme Rec HIV-1试验是阳性的，以光密度(OD)的反应性与阈值或截断值(CO)相比的比率大于5(CO/OD＞5)，那么，这份血清就被认为是HIV-1阳性，这一结果应在一种新标本上予以确证。
选择反应性比率大于5作为竞争试验是确证感染HIV-1的试验，是基于Bichat医院病毒实验室得到的经验反应的比率＞5的全部7200份样本都产生了强阳性HIV-1 Western印迹(WB，New Lav Blot 1，SDP，Marnes 1a Coquette)。除了HIV-1血清转换的病例外，确证为HIV阳性、而Wellcozyme比率＜5的标本，相应于HIV-2感染或者O族HIV-1或其它HIV-1变种感染。
为了在进行混合EIA检测时消除假阳性反应，CO/OD比率＜5的样本用第三代混合HIV-1/HIV-2 EIA(Enzygnost Plus，Marburg，德国)的系统测试，包括M和O HIV-1族的抗原(MVP 5180毒株的重组gp41)。如果这项试验是阳性的，然后再进行一种区别HIV-1与HIV-2的快速试验(Multispot，SDP，Mrnes Ia Coquette)以及一种Western印迹(WB，New Lav Blot 1或2，SDP)。
3)从血清学上确证O族HIV-1与HIV-1变种感染所有CO/DO比率＜5、且被WB区别为阳性(阳性标准2ENV+/-POL+/-GAG或1 ENV+POL+/-GAG)和HIV-1的样本，都接受应用V3和跨膜区肽抗原的斑点印迹试验测试(InnoLia，Innogenetics，Ghent，比利时)。
4)O族和变种毒株的逆转录病毒分离在喀麦隆用Ficoll-Hypaque梯度分离血清阳性病人的外周血单核细胞(PMBC)，然后收集在液氮中保存并运往巴黎。
病人的PBMC在解冻后与血清阴性高加索供血者的淋巴细胞共同培养。在为期一个月的时间内，通过检测逆转录酶活性以及进行检测P24抗原的试验(Elavia P24 Polyclonal，SDP)，以证实培养上清中的病毒复制。
5)序列根据片段大小在1～1.4％浓度的琼脂糖凝胶上显现PCR产物，在3M乙酸钠(1∶10)和3体积的纯乙醇中沉淀，在-80℃孵育30分钟，然后13,000转/分离心20分钟。将沉淀干燥，然后溶于10μl蒸馏水(Sigma)中。根据生产商的说明，用“Qiauick凝胶提取试剂盒”(Qiagen)进行纯化；根据以往的描述(Loussert-Ajakat等人，1995)，应用Applied Biosystem Dye Terminator试剂盒，在自动DNA测序仪上对产物进行测序；在Sequence Navigator软件(AppliedBiosystem)上分析核苷酸序列，应用GeneWorks软件(IntelligeneticsInc.)进行序列对比。
6)系统发生学分析应用CLUSTAL软件对序列进行多重对比，并将生物学和理论生物物理学实验室(Los Alamos，New Mexico，87545，美国)拥有的HIV序列汇集的序列对比作为参比模板。
应用PHYLIP软件进行系统发生学分析；首先应用DNADIST计算距离，然后应用NEIGBOR JOINTING或FITCH进行系统发生学分析最后，应用DRAWTREE画系统树(图9～19)。图20还显示了遗传距离百分比。
首先应用SEQBOOT进行“引导程序(bootstrapping)”分析，随后DNADIST与NEIGHBOR JOINTING或FITCH。最后，应用CONSENS获得引导程序值。II-检测O族和变种HIV病毒的研究结果在筛查中发现为阳性的3193份样本中，有174份样本被认为是有异常血清学反应的O族或M族，或被认为是变种。III-显示异常血清学反应的非-O族和非-M族样本的检测WB(蛋白质印迹)为HIV-1阳性、但在竞争EIA中反应性CO/CD比率＜5的174份血清，应用来自M族、O族和CPZGAB SIV的V3肽，通过鉴别LIA斑点印迹进行了测试-7份没有与任何代表性肽(M，O或CPZGAB SIV)起反应。细胞收集的缺乏不能允许得出任何结论。
-82份与至少一种对应于O族毒株V3环的肽产生反应性。交叉反应的频率低，而且限于对应于共有V3区(11％)和CPZGAB SIV V3区(43％)的表位。
-84份血清没有与O族表位起反应。这些样本中的大多数获自表现艾滋病综合症的病人(75/84)。
-1份获自一位喀麦隆病人(NJ)的血清只与CPZGAB SIV肽起反应。这种与CPZAB SIV抗原的孤立反应性以往从未有描述。因为已从该病人身上取到淋巴细胞，所以有可能继续对这一被称为YBF30的毒株进行病毒学表征。
IV-对取自该病人的第一批标本(1995年5月)进行血清学和病毒学检测的结果(血清号95-6295)1)商品化ELISA试验(光密度/阈值)阳性标准OD/CO＞1Genelavia＝＞15Wellcozyme CO/OD＝1.55Abbott Plus＝＞15Behring Plus＝4.22) Western印迹
New Lav 1 Oasteur WB160++，120++，68++，55+，41+，40+/-，34++，24++，18+3)Inngenetics LIA斑点印迹除CPZGAB SIV V3外，全部O族和B族条带均为阴性。
4)对M族和O族特异性肽进行的探索性血清学检查结果对TOURS CHU病毒实验室Francis Barin教授开创的技术进行了修改(Barin F等人，1996)；应用了合成的跨膜区肽(Biom*rieux)以建立一种区别M族和O族的试验。这项技术是以O族和M族跨膜gp41肽之间的抗体结合竞争为基础的，肽沉淀在固相，O族或是M族的gp41跨膜肽以更高的浓度存在于高渗性液体的反应相。结果如下表I所示，其中CP孔相当于100％抑制对照，CSP孔相当于0％抑制对照。
表I6295份血清的族间O族M鉴别结果
这些结果证实，与固相肽(CSP)有很强的结合，以及由于M和O肽(CP)的联合加入而造成明显抑制，但无论是M肽还是O肽，都无明确的区别。因此这一血清学证据表明，感染毒株既不属于M族、也不属于O族。
考虑到InnoLia斑点印迹中CPZGAB SIV V3抗原的孤立反应性，同样依据肽之间的竞争，通过将gp41 M、gp41 O和gp41 CPZGABSIV肽与其竞争，对该血清进行了研究。
取自名为‘Amandine’的黑猩猩的血清(M.Petters惠赠，他分离出了CPZGAB SIV毒株，AIDS 1992)之应用，初步使该技术得到证实。表II中，最低值(OD)表示与抗原的最高度结合。
表II应用Amandine黑猩猩血清和6295份血清进行族间O-族M-CPZGAB SIV鉴别的结果
“Amandine”血清的反应性证实了根据本发明的试验及其正确性，并且显示，尽管该病人的血清同样与M和CPZGAB SIV肽起反应，但它与O肽并无交叉反应。
这些结果表明，M族gp41和CPZGAB SIV gp41肽对该病人血清有相似的抑制作用。感染毒株的抗原因此产生了抗体，后者以相似的方式识别M族和CPZBAG SIV gp41肽。
5)从淋巴细胞分离(1995年5月采样)中得出的结果应用标准技术从1995年5月22日采集的淋巴细胞中分离了一种逆转录病毒。应用MT2细胞系培养，显示YBF30毒株没有形成任何合胞体(NSI)。V-对第二份血液标本(1995年11月)(血清号95-3371)进行的血清学检查结果1)Innogenetics LIA斑点印迹除了CPZGAB SIV V3外，全部条带均为阴性。
2)对M族和O族特异性肽进行的探索性血清学检查结果表III显示了应用3371份血清进行族间O-族M-CPZGAB SIVgp41鉴别的结果。
表III应用3371份血清进行族间O-族M-CPZGAB SIV gp41鉴别的结果
对此新的血液标本(取自处于疾病终末期的同一病人)研究的结果证实，CPZGAB SIV gp41肽显著抑制该病人的血清。
感染毒株的抗原因此诱导产生了优选地识别CPZGAB gp41肽的抗体。
3.淋巴细胞分离的结果(血样于95年11月采集(95-3371-YBF31))应用标准技术从1995年11月采样的淋巴细胞中分离出一种逆转录病毒，命名为YBF31；其序列成分与YBF30相同。VI-基因组扩增与YBF30的序列用于全部PCR操作的DNA是从阳性培养结束时获得的细胞中提取的。
应用O族HIV-1引物进行的PCR在检测的不同区(gap、pol、env)都是阴性的。同样，应用M族HIV-1特异性引物进行的PCR也是阴性的。
O族PCR的扩增和杂交条件同Loussert-Ajaka，1995描述的一样。M族PCR的扩增和杂交条件同下文作者引用的一样。
这些M族引物的定位根据以下HIV-1 HXB2序列-在env gp120ED3/ED12(位置5956-5985；7822-7792)；ED5/ED14(6556-6581；7960-7931)；ED5/ED12；ED3/ED14；ES7/ES8(7001-7020；7667-7647)(Delwart等人，科学(Science)1993；2621257-1261)。
-在env gp41先是PCR、ED3/M29，随后是巢式PCR，M28/M29(7785-7808；8099-8124)；M28/M29具有以下序列M28CGGTTCTT(AG)GGAGCAGC(ACT)GGAAGCA，M29T(CT)T(ACGT)TCCCA(CT)T(AT)(CT)A(AGT)CCA(AGT)GTCAT；SK68/SK69(Ou等人，科学，1988；239295-297)。
-在gagAmplicor Roche诊断系统；巢式gag引物(Loussert-Ajaka等人，柳叶刀(Lancet)1995346912-913)；SK38/SK39(Ou等人，科学，1988；239295-297)。
-在polA/NE1(Boucher等人，柳叶刀，1990；336585-590)；pol3/pol4(Laure等人，柳叶刀，1988；ii，538-541)。
只有应用H pol引物(4235/4538)进行的PCR是阳性的，随之应用引物4327/4481(Fransen等人，分子与细胞探针(Molecular andCellular Probes)1994；8317-322)进行了巢式PCR。这一位于整合酶(260 bp)中的H pol片段已被测序。由于病毒过量使之可以利用HPOL引物扩增。这是因为应用的DNA是从强阳性培养(逆转录酶＞100,000cpm)结束时的细胞中提取的。对未经共同培养的新鲜细胞中提取的DNA进行扩增是不可能的，这是因为在HPOL引物(尤其是在3′区)与YBF30分离株的序列之间存在大量错配。该3′末端的保守对于Tag聚合酶的延伸活性是非常重要的。
1-pol基因序列非常简并引物通过RT-PCR用于扩增从阳性培养上清中提取的RNA，产生了阳性扩增。这些引物是所有逆转录病毒共有的(Donehowert等人，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)1990；2833-46)，位于pol基因的逆转录酶区。测序后的片段分析使之有可能从YBF30分离株中产生一种特异性引物，即YRT2(SEQID No.32)，并应用Hpol 4481引物(Fransen等人，1994，loc.cit.)作为反义引物，以扩增pol基因。通过按照所产生的每一片段所需来合成特异性引物，对片段进行测序(图1)。
2-env基因序列第二个步骤是进行长片段PCR(XL-PCR，Perkin Elmer)，以此扩增整个病毒(9000 bp)，应用的引物位于LTRLPBS1(SEQ ID No.22)；LsiGi，随后应用YRT2(SEQ IDNo.32)/SK69进行6000bp巢式PCR，并按照相同步骤测序整个包膜。gp41区的测序应用巢式PCR，使用引物SK 68/LSiGi。
3-gag基因序列巢式PCR的应用是通过长片段PCR(LPBS1/LSiGi)进行的，使用的引物Gag5和Gag11i，按照需要由这种特异性引物产生，以便沿病毒基因组走行。
VII-测序结果对YBF30毒株进行了全部测序(见序列表)。对1995年11月的YBF31毒株进行了部分测序，显著变异的缺乏证实了YBF30序列的正确性。
VIII-合成YBF30毒株V3环区的肽研究V3环区的序列使之有可能合成相应的肽，并对YBF30毒株V3环区的氨基酸与其它M亚型和O毒株的氨基酸进行比较。
这些肽的序列是YBF30 SEQ ID No.58CPZGAB SIVCHRPGNNTRGEVQIGPGMTFYNIENVYGDTRSAYC(SEQ ID No.59)O族 CIRPGNRTYRNLQIGPGMTFYNVEIATGDIRKAFC(ANT70)(SEQ ID No.60)M族 CTRPNNTRKSVRIGPGQAFYATGDIIGDIRQAHC(SS-A型) (SEQ ID No.61)从环的5′区的两个天冬酰胺开始合成肽，并根据以往描述的同一原理应用(见IV4)，那就是供其与M族、O族和CPZGAB SIV的肽竞争。表IV显示的结果证实了这一毒株的原始本质以及这些株的可能传播，因为血清学结果支持在喀麦隆有YBF30型的感染。此外，一项对从喀麦隆选择的200份HIV-1阳性血清的研究，提供了一例新病例的证据，该病例显示的特征与YBF30相似。
表IV 200份血清的反应性研究血清 起源V3AV3cpz V3YBF3 CPCSP0953371喀麦隆 1.66 0.381.39 0.39 1.64956295喀麦隆 1.72 0.371.16 0.51 1.73967321喀麦隆 0.07 0.170.5 0.05 0.27Amandine GABSIV 1.74 0.141.48 0.19 1.74NOA*ANTSIV 2.66 0.311.88 0.46 1.9*来自CPZ ANT SIV的血清血清953371和956295(与分离出YBF30毒株的病人相对应)与CPZ SIV肽的反应性在这一新试验中得到确证。与其自身V3抗原的反应性较低，在疾病的晚期是常见的。然而，这种反应性一直高于M肽引起的反应性。另一例喀麦隆病人(血清967321)显示出同样的肽反应性特征。
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从上文可以看出，本发明绝不限于刚刚清楚地予以描述的实施方案；相反，它包括所有的、技术人员可能想到的变化，而不背离本发明的内容或范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名INSTUTUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LATRCHERCHE MEDICALE-INSERM(B)街道101 rue DE TOLBIAC(C)城市巴黎(E)国家法国(F)邮政编码(ZIP)75654 CEDEX 13(A)姓名ASSISTANCE PUBLIQUE-HOPITAUS DE PARIS(B)街道3 avenue Victoria(C)城市巴黎(E)国家法国(F)邮政编码(ZIP)75100 RP(A)姓名INSTITUT PASTEUR(B)街道28 rue du Docteur Rous(C)城市巴黎(E)国家法国(F)邮政编码(ZIP)75724 Cedex 15(A)姓名MAUCLERE Philippe(B)街道2 rue Buhan(C)城市Bordeaux(E)国家法国(F)邮政编码(ZIP)33000(A)姓名LOUSSERT AJAKA Ibtissam(B)街道26 avenue de la Republique(C)城市SARTROUVILLE(E)国家法国(F)邮政编码(ZIP)78500(A)姓名STMON francois(B)街道8 rue Germain Pilon(C)城市巴黎(E)国家法国(F)邮政编码(ZIP)75018(A)姓名SARAGOSTI Sentob(B)街道69 bis rue do Billancourt(C)城市BOULOGNE BILLANCOURT(E)国家法国(F)邮政编码(ZIP)92100(A)姓名BARRE-SINOUSSL Francoise(B)街道104 le capricorne，50 rue d’Erevan(C)城市ISSY LES MOULINEAUX(E)国家法国(F)邮政编码(ZIP)92130(ii)发明名称非-M、非-O HIV-1毒株、片段及应用(iii)序列数目61(iv)计算机可读信息(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度9183个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)SEQ ID NO1的序列描述CTTCTCGCTT GTACTGGGTC TCTCTTGCTG GACCAGATTA GAGCCTGGGA GCTCTCTGGC60TAGCAGGGAA CCCACTGCTT AAGCCTCAAT AAAGCTTGCC TTGAGTGCTA AAGTGGTGTG 120TGCCCATCCA TTCGGTAACT CTGGTACCTA GAGATCCCTC AGACCATCTA GACTGAGTGA 180AAAATCTCTA GCAGTGGCGC CCGAACAGGG ACTTGAAAAC GAAAGTAGAA CCGGAGGCTG 240AATCTCTCGA CGCAGGACTC GGCTCGTTGG TGCACACAGC GAGAGGCGAG GCGGCGGAAG 300TGTGAGTACG CAATTTTGAC TGGCGGTGGC CAGAAAGTAG GAGAGAGGAT GGGTGCGAGA 360GCGTCAGTGT TAACAGGGGG AAAATTAGAT CAATGGGAAT CAATTTATTT GAGACCAGGG 420GGAAAGAAAA AATACAGAAT GAAACATTTA GTATGGGCAA GCAGGGAGCT GGAAAGATTC 480GCTTGTAACC CAGGTCTCAT GGACACAGCG GACGGCTGTG CCAAGTTACT AAATCAATTA 540GAACCAGCTC TCAAGACAGG GTCAGAAGAA CTGCGCTCTT TATATAACGC TCTAGCAGTT 600CTTTATTGTG TCCATAGTAG GATACAGATA CACAACACAC AGGAAGCTTT GGACAAGATA 660AAAGAGAAAC AGGAACAGCA CAAGCCCGAG CCAAAAAACC CAGAAGCAGG GGCAGCGGCA 720GCAACTGATA GCAATATCAG TAGGAATTAT CCTCTAGTCC AGACTGCTCA AGGACAAATG 780GTACATCAGC CGCTGACACC 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GCT ATC AGC TTG CTT AAT ACA ACA GCT ATT 2448Lys Glu Leu Arg Asp Ser Ala Ile Ser Leu Leu Asn Thr Thr Ala Ile925 930 935GTA GTA GCA GAA GGA ACA GAT AGG ATT ATA GAA TTA GCA CAA AGA ATA 2496Val Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Ile Ile Glu Leu Ala Gln Arg Ile940 945 950GGA AGG GGA ATA TTA CAC ATA CCT AGA AGA ATC AGA CAA GGC CTA GAA 2544Gly Arg Gly Ile Leu His Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu955 960 965 970
2559AGA GCA CTG ATA TAAArg Ala Leu Ile(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度852个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO18的序列描述Met Lys Val Met Gly Met Gln Ser Gly Trp Met Gly Met Lys Ser Gly1 5 10 15Trp Leu Leu Phe Tyr Leu Leu Val Ser Leu Ile Lys Val Ile Gly Ser20 25 30Glu Gln His Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Arg Glu35 40 45Ala Glu Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala His Ser Thr50 55 60Glu Ala His Asn Ile Trp Ala Thr Gln Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro65 70 75 80Asn Pro Gln Glu Val Leu Leu Pro Asn Val Thr Glu Lys Phe Asn Met85 90 95Trp Glu Asn Lys Met Ala Asp Gln Met Gln Glu Asp Ile Ile Ser Leu100 105 110Trp Glu Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val115 120 125Thr Met Leu Cys Asn Asp Ser Tyr Gly Glu Glu Arg Asn Asn Thr Asn130 135 140Met Thr Thr Arg Glu Pro Asp Ile Gly Tyr Lys Gln Met Lys Asn Cys145 150 155 160Ser Phe Asn Ala Thr Thr Glu Leu Thr Asp Lys Lys Lys Gln Val Tyr165 170 175Ser Leu Phe Tyr Val Glu Asp Val Val Pro Ile Asn Ala Tyr Asn Lys180 185 190Thr Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn Thr Thr Ala Val Thr Gln Ala Cys195 200 205Pro Lys Thr Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Pro210 215 220Gly Phe Ala Ile Met Lys Cys Asn Glu Gly Asn Phe Ser Gly Asn Gly225 230 235 240Ser Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Lys Pro245 250 255Val Ile Ser Thr Gln Leu Ile Leu Asn Gly Ser Leu Asn Thr Asp Gly260 265 270Ile Val Ile Arg Asn Asp Ser His Ser Asn Leu Leu Val Gln Trp Asn275 280 285Glu Thr Val Pro Ile Asn Cys Thr Arg Pro Gly Asn Asn Thr Gly Gly290 295 300Gln Val Gln Ile Gly Pro Ala Met Thr Phe Tyr Asn Ile Glu Lys Ile305 310 315 320Val Gly Asp Ile Arg Gln Ala Tyr Cys Asn Val Ser Lys Glu Leu Trp325 330 335Glu Pro Met Trp Asn Arg Thr Arg Glu Glu Ile Lys Lys Ile Leu Gly340 345 350Lys Asn Asn Ile Thr Phe Arg Ala Arg Glu Arg Asn Glu Gly Asp Leu355 360 365Glu Val Thr His Leu Met Phe Asn Cys Arg Gly Glu Phe Phe Tyr Cys370 375 380Asn Thr Ser Lys Leu Phe Asn Glu Glu Leu Leu Asn Glu Thr Gly Glu385 390 395 400Pro Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Arg Gln Ile Val Asn Leu Trp Thr405 410 415Arg Val Gly Lys Gly Ile Tyr Ala Pro Pro Ile Arg Gly Val Leu Asn420 425 430Cys Thr Ser Asn Ile Thr Gly Leu Val Leu Glu Tyr Ser Gly Gly Pro435 440 445Asp Thr Lys Glu Thr Ile Val Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Met Val Asn450 455 460Leu Trp Arg Gln Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Ser Ile Glu Pro465 470 475 480Ile Gly Val Ala Pro Gly Lys Ala Lys Arg Arg Thr Val Ser Arg Glu485 490 495Lys Arg Ala Ala Phe Gly Leu Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly500 505 510Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Ile Thr Leu Thr Val Gln515 520 525Ala Arg Thr Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Ile Leu Leu530 535 540Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Ser Ile Trp Gly545 550 555 560Ile Lys Gln Leu Gln Ala Lys Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Arg565 570 575Asp Gln Gln Ile Leu Ser Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Thr Ile Cys580 585 590Tyr Thr Thr Val Pro Trp Asn Glu Thr Trp Ser Asn Asn Thr Ser Tyr595 600 605Asp Thr Ile Trp Asn Asn Leu Thr Trp Gln Gln Trp Asp Glu Lys Val610 615 620Arg Asn Tyr Ser Gly Val Ile Phe Gly Leu Ile Glu Gln Ala Gln Glu625 630 635 640Gln Gln Asn Thr Asn Glu Lys Ser Leu Leu Glu Leu Asp Gln Trp Asp645 650 655Ser Leu Trp Ser Trp Phe Gly Ile Thr Lys Trp Leu Trp Tyr Ile Lys660 665 670Ile Ala Ile Met Ile Val Ala Gly Ile Val Gly Ile Arg Ile Ile Ser675 680 685Ile Val Ile Thr Ile Ile Ala Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu690 695 700Ser Leu Gln Thr Leu Ile Pro Thr Ala Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu705 710 715 720Glu Thr Glu Gly Gly Val Gly Glu Gln Asp Arg Gly Arg Ser Val Arg725 730 735Leu Val Ser Gly Phe Ser Ala Leu Val Trp Glu Asp Leu Arg Asn Leu740 745 750Leu Ile Phe Leu Tyr His Arg Leu Thr Asp Ser Leu Leu Ile Leu Arg755 760 765Arg Thr Leu Glu Leu Leu Gly Gln Ser Leu Ser Arg Gly Leu Gln Leu770 775 780Leu Asn Glu Leu Arg Thr His Leu Trp Gly Ile Leu Ala Tyr Trp Gly785 790 795 800Lys Glu Leu Arg Asp Ser Ala Ile Ser Leu Leu Asn Thr Thr Ala Ile805 810 815Val Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Ile Ile Glu Leu Ala Gln Arg Ile820 825 830Gly Arg Gly Ile Leu His Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu835 840 845Arg Ala Leu Ile850(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度639个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..636(xi)SEQ ID NO19的序列描述ATG GGA AAG ATT TGG TCA AAG AGC AGC CTA GTA GGA TGG CCA GAA ATC48Met Gly Lys Ile Trp Ser Lys Ser Ser Leu Val Gly Trp Pro Glu Ile855 860 865AGA GAA AGA ATG AGA AGA CAA ACG CAA GAA CCA GCA GTA GAG CCA GCA96Arg Glu Arg Met Arg Arg Gln Thr Gln Glu Pro Ala Val Glu Pro Ala870 875 880GTA GGA GCA GGA GCA GCT TCT CAA GAT CTA GCT AAT CGA GGG GCC ATC 144Val Gly Ala Gly Ala Ala Ser Gln Asp Leu Ala Asn Arg Gly Ala Ile885 890 895 900ACC ATA AGA AAT ACT AGA GAC AAT AAT GAA AGT ATA GCT TGG CTA GAA 192Thr Ile Arg Asn Thr Arg Asp Asn Asn Glu Ser Ile Ala Trp Leu Glu905 910 915GCA CAA GAA GAA GAA GAG GAA GTA GGC TTT CCA GTA CGC CCT CAG GTA 240Ala Gln Glu Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val920 925 930CCA TTA AGG CCA ATA ACC TAT AAA CAG GCT TTT GAT CTT TCC TTC TTT 288Pro Leu Arg Pro Ile Thr Tyr Lys Gln Ala Phe Asp Leu Ser Phe Phe935 940 945TTA AAA GAT AAG GGG GGA CTG GAA GGG CTA GTT TGG TCC AGA AAA AGG 336Leu Lys Asp Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Val Trp Ser Arg Lys Arg950 955 960CAA GAT ATT CTA GAC CTC TGG ATG TAT CAC ACA CAA GGC ATC CTC CCT 384Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Met Tyr His Thr Gln Gly Ile Leu Pro965 970 975 980GAC TGG CAT AAC TAC ACA CCA GGG CCA GGA ATT AGA TAC CCC GTA ACC 432Asp Trp His Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Val Thr985 990 995TTT GGA TGG TGC TTC AAA CTA GTA CCA TTG TCA GCT GAA GAA GTA GAA 480Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Leu Ser Ala Glu Glu Val Glu100010051010GAG GCT AAT GAA GGA GAC AAC AAT GCC CTC TTA CAC CCC ATA TGT CAA 528Glu Ala Asn Glu Gly Asp Asn Asn Ala Leu Leu His Pro Ile Cys Gln101510201025CAT GGA GCA GAT GAT GAT CAT AAA GAA GTG TTG GTG TGG CGA TTT GAC 576His Gly Ala Asp Asp Asp His Lys Glu Val Leu Val Trp Arg Phe Asp103010351040AGC TCC CTA GCA AGA AGA CAT GTA GCA AGA GAG CTG CAT CCG GAG TTT 624Ser Ser Leu Ala Arg Arg His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Phe1045105010551060TAC AAG AAC TGC TGA 639Tyr Lys Asn Cys(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度212个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO20的序列描述Met Gly Lys Ile Trp Ser Lys Ser Ser Leu Val Gly Trp Pro Glu Ile1 5 10 15Arg Glu Arg Met Arg Arg Gln Thr Gln Glu Pro Ala Val Glu Pro Ala20 25 30Val Gly Ala Gly Ala Ala Ser Gln Asp Leu Ala Asn Arg Gly Ala Ile35 40 45Thr Ile Arg Asn Thr Arg Asp Asn Asn Glu Ser Ile Ala Trp Leu Glu50 55 60Ala Gln Glu Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val65 70 75 80Pro Leu Arg Pro Ile Thr Tyr Lys Gln Ala Phe Asp Leu Ser Phe Phe85 90 95Leu Lys Asp Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Val Trp Ser Arg Lys Arg100 105 110Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Met Tyr His Thr Gln Gly Ile Leu Pro115 120 125Asp Trp His Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Val Thr130 135 140Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Leu Ser Ala Glu Glu Val Glu145 150 155 160Glu Ala Asn Glu Gly Asp Asn Asn Ala Leu Leu His Pro Ile Cys Gln165 170 175His Gly Ala Asp Asp Asp His Lys Glu Val Leu Val Trp Arg Phe Asp180 185 190Ser Ser Leu Ala Arg Arg His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Phe195 200 205Tyr Lys Asn Cys210(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO21的序列描述ATTGCGTACT CACACTTCCG 20(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO22的序列描述GGCAAGCAGG GAGCTGG 17(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO23的序列描述TCCTTGAGCA GTCTGGAC 18(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO24的序列描述GAACAGGAGG ATTAGCAG 18(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO25的序列描述AGCAGAGGCT ATGTCACA 18(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO26的序列描述TGTAAGGCCC CTAGAAGAG 19(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO27的序列描述ACAGAGAACT CTCTGTAC 18(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO28的序列描述AAGAAAAGCA GTTGGTAC 18(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO29的序列描述TTTCTTCCCT GTATGTC 17(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO30的序列描述GTTATATGGA TTCTCAGG 18(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO31的序列描述TGGCAGCACA TTATACTGG 19(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO32的序列描述ATCATTTACC AGTACATGGA CGA 23(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO33的序列描述TGTCAGGGGT CGTAAAGC18(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO34的序列描述TCCTCTGGAT GGGATATG 18(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO35的序列描述TCTATCCAGG AATCAGAG 18(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸
(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO36的序列描述AATGAGATCT GCCCATAC 18(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO37的序列描述TGACAGATAG GGGAAGAC 18(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO38的序列描述AACCGCCATT TGCACTGC 18(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO39的序列描述ACATGGACCG CCACAAGG 18(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO40的序列描述AGCAACAGAC ATACAGAC 18(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO41的序列描述
AAAGTAGTCC CACGTAGG18(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO42的序列描述ATATCCCAGT AGGTCAGG 18(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO43的序列描述TCTAGCACTA ACAGCCTG 18(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO44的序列描述ACTCTTACTG CTCTGAGG 18(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO45的序列描述CCATAGTACA CTGTTACC 18(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO46的序列描述CATAGCTATC GTTACAAAGC 20(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO47的序列描述TCATAATGGC AAAGCCTG 18(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO48的序列描述CTATTCCACA TTGGTTCC 18(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO49的序列描述ATTCTAGAAC CAGTCCAG 18(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO50的序列描述CCTTAGGGAT CAGCAAATCC 20(2)SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO51的序列描述TGGGACAGTC TGTGGAGC 18(2)SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO52的序列描述TTCTCAGCTC TTGTCTGG18(2)SEQ IDNO53的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO53的序列描述ATTAAGCAAG CTGATAGC 18(2)SEQ ID NO54的信息(i)序列特征(A)长度16个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO54的序列描述TGTGCTTCTA GCCAAG 16(2)SEQ ID NO55的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO55的序列描述GCTCCATGTT GACATATG18(2)SEQ ID NO56的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO56的序列描述AGAGAGACCC AGTACAAG18(2)SEQ ID NO57的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸
(A)描述/desc＝“引物”(xi)SEQ ID NO57的序列描述ATAAAAGCAG CCGCTTCTCG20(2)SEQ ID NO58的信息(i)序列特征(A)长度35个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型肽(xi)SEQ ID NO58的序列描述Cys Thr Arg Pro Gly Asn Asn Thr Gly Gly Gln Val Gln Ile Gly Pro1 5 10 15Ala Met Thr Phe Tyr Asn Ile Glu Lys Ile Val Gly Asp Ile Arg Gln20 25 30Ala Tyr Cys35(2)SEQ ID NO59的信息(i)序列特征(A)长度35个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型肽(xi)SEQ ID NO59的序列描述Cys His Arg Pro Gly Asn Asn Thr Arg Gly Glu Val Gln Ile Gly Pro1 5 10 15Gly Met Thr Phe Tyr Asn Ile Glu Asn Val Tyr Gly Asp Thr Arg Ser20 25 30Ala Tyr Cys35(2)SEQ ID NO60的信息(i)序列特征(A)长度35个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型肽(xi)SEQ ID NO60的序列描述Cys Ile Arg Pro Gly Asn Arg Thr Tyr Arg Asn Leu Gln Ile Gly Pro1 5 10 15Gly Met Thr Phe Tyr Asn Val Glu Ile Ala Thr Gly Asp Ile Arg Lys20 25 30Ala Phe Cys35(2)SEQ ID NO61的信息(i)序列特征(A)长度35个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型肽(xi)SEQ ID NO61的序列描述Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Val Arg Ile Gly Pro1 5 10 15Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln20 25 30Ala His Cys3权利要求
1.非-M、非-O HIV-1毒株，其显示了一种逆转录病毒的形态学和免疫学特征，这种逆转录病毒于1996年7月2日保藏在国立微生物保藏中心，保藏号为I-1753(命名为YBF30)，由巴斯德研究所保存。
2.核酸序列，其特征在于它们来源于根据权利要求1的毒株。
3.根据权利要求2的核酸序列，其特征在于它选自以下序列根据权利要求1的毒株的完整核苷酸序列(SEQ ID No.1)以及来源于该毒株的核酸片段(SEQ ID No.2)、(SEQ ID No.3)、(SEQ IDNo.5)、(SEQ ID No.7)、(SEQ ID No.9)、(SEQ ID No.11)、(SEQ ID No.13)、(SEQ ID No.15)、(SEQ ID No.17)、(SEQID No.19)及序列SEQ ID No.21-57，还有与上述核苷酸序列之一不相同的、或与这些序列之一不能互补的、但能够与来源于非-M、非-O HIV-1病毒的核酸序列杂交的任何序列。
4.寡核苷酸，其特征在于它是从序列SEQ ID No.21-57中选择出来的，特征在于它能够作为一种引物或探针用于检测根据权利要求1或权利要求5的HIV-1。
5.HIV-1病毒，其特征在于它们既不同于M族，也不同于O族，而且显示以下特征*与M族和O族的蛋白质几乎没有或没有血清学反应性，而与来源于根据权利要求1的YBF30毒株或CPZGAB SIV毒株的蛋白质却有很强的血清学反应性；*当应用来源于M族和O族HIV-1病毒env和gag区的引物时，无基因组扩增；*当来源于根据权利要求4的YBF30毒株的引物存在时，基因组扩增；以及*包膜基因产物的同源性与YBF30毒株相比大于70％。
6.通过杂交和/或基因扩增用于体外诊断非-M族、非-O族HIV-1病毒的方法，该方法是应用一种生物样本(血清或循环淋巴细胞)进行的，其特征在于它包括*提取属于病毒基因组的待测核酸的步骤，该病毒可能存在于生物样本中，及当适当的时候，应用一种逆转录酶处理核酸的步骤，如果这种核酸为RNA形式，*至少一个循环，其包括的步骤有变性核酸；与至少一个根据权利要求3或权利要求4的序列杂交；以及当适当的时候，在合适的试剂(聚合剂，如DNA聚合酶和dNTP)存在下，延伸已形成的杂交物，以及*检测属于非-M、非-O HIV-1族型病毒基因组的核酸之可能存在的步骤。
7.肽，其特征在于它能被一种根据权利要求1或权利要求5的非-M、非-O HIV-1毒株表达，或应用一种根据权利要求3的核苷酸序列而被表达，以及特征在于它能够(1)被根据权利要求1或权利要求5的非-M、非-O HIV-1病毒、或该病毒的变种诱导产生的抗体所识别，这些抗体存在于用非-M、非-O HIV-1毒株感染后采集的生物样本中，和/或(2)诱导抗非-M、非-O HIV-1抗体的产生。
8.根据权利要求7的肽，其特征在于它选自gag基因表达的肽(SEQ ID No.4)、pol基因表达的肽(SEQ ID No.6)、vif基因表达的肽(SEQ ID No.8)、vpr基因表达的肽(SEQ ID No.10)、vpu基因表达的肽(SEQ ID No.12)、tat基因表达的肽(SEQ ID No.14)、rev基因表达的肽(SEQ ID No.16)、env基因表达的肽(SEQ ID No.18)或其片段之一如V3环区的片段(SEQ ID No.58)、以及nef基因表达的肽(SEQ ID No.20)，或者能够识别用根据权利要求1或权利要求5的HIV-1病毒感染的期间产生的抗体的这些肽的一个片段。
9.免疫原性组合物，其包括根据权利要求3的核苷酸序列的一种或多种翻译产物，和/或根据权利要求7或权利要求8的肽中的一种或多种翻译产物。
10.针对根据权利要求7或权利要求8的一种或多种肽的抗体。
11.用于非-M、非-O HIV-1病毒体外诊断的方法，其特征在于它包括将一种取自病人的生物样本与根据权利要求10的抗体接触，其中可能会结合抗-CPZGAB SIV抗体，以及检测可能存在于该生物样本中的HIV-1抗原与该抗体之间形成的免疫复合物。
12.用于诊断非-M、非-O HIV-1病毒的试剂，其特征在于它包括一个根据权利要求3、4、7或8中任何一个的序列。
13.用于筛选和分型非-M、非-O HIV-1病毒的方法，其特征在于它包括将根据权利要求3或权利要求4的核苷酸片段中的任何一个接触待分型的病毒的核酸，以及检测形成的杂交物。
14.用于诊断非-M、非-O HIV-1病毒的试剂盒，其特征在于它包括至少一种根据权利要求12的试剂。
全文摘要
本发明涉及HIV－1非－M族非－O族的逆转录病毒毒株,尤其涉及一种称为YBF30的毒株、其片段及其作为诊断和免疫原性制剂的应用。与M族和O族不同的HIV－2具有以下特征:对M族和O族的蛋白质几乎没有或没有血清学反应,而对源于YBF30毒株或SIVCPZGAB毒株的蛋白质具有强烈的血清学反应;无M族和O族HIV－1的env和gag区引物引发的基因组扩增;源于YBF30毒株的引物存在时的基因组扩增;与YBF30毒株相比,包膜基因产物的同源性大于70%。
文档编号C12N7/00GK1244896SQ97181380
公开日2000年2月16日 申请日期1997年12月8日 优先权日1996年12月9日
发明者P·莫克勒, I·洛瑟特-阿加卡, F·西蒙, S·萨拉高斯特, F·巴里-斯诺斯 申请人:国家健康科学研究所, 公共救济事业局-巴黎医院, 巴斯德研究所