淀粉含量提高的转基因植物的制作方法

专利名称：淀粉含量提高的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及经过修饰的、产淀粉能力增强的植物，以及能够再生成这种植物的植物细胞。本发明还涉及用于质量增强淀粉的生产方法和用于植物转化的重组DNA分子。
淀粉是在高等植物中所发现的主要的贮存碳水化合物，并且因此是全球人类饮食中最大的单一能量来源。除其本身作为重要的粮食之外，淀粉的物理特性(形成凝胶和胶体)导致它主要作为加工食品的天然添加剂(增稠剂)。淀粉还有重要的非食品用途，在造纸和纺织工业中可作为胶粘剂的组分。在后一种情况下，淀粉的物理特性尤为重要。运用淀粉的其它工业有塑料工业和制药工业；在制药工业中淀粉例如可用作惰性载体。淀粉的物理特性部分取决于直链淀粉(长而直的聚糖链)与更高度分支的支链淀粉之比。在最近几年中，人们对用生物工程产业改变淀粉的质量和数量产生了很大兴趣。尤其是主要目的在于产生经过遗传修饰的、淀粉含量增加或所含淀粉的结构不同于自然界淀粉的植物。由于马铃薯易于应用转基因技术，所以到目前为止，大多数工作集中于马铃薯植物种上。
对淀粉质量的操作已取得了一些成功。例如，虽然对内源性淀粉生物合成酶的操作只微微影响产量，但所产淀粉的物理特性却常常大幅度改变(Müller-Rber等，1994)；这些变化从机械学方面尚无较好的理解。最近一种细菌淀粉分支酶在马铃薯的无直链淀粉变种中的表达，导致产生非常高度分支的支链淀粉(Kortstee等，1996)。目前产生的许多淀粉结构变异具有潜在的商业用途。
提高淀粉产量的方法只取得有限的成功。无论从马铃薯本身或其它物种，一些编码淀粉生物合成酶的基因的过量表达，尚未使块茎的淀粉含量提高(Müller-Rber等，1994)。通过编码非调节形式的ADP-葡萄糖焦磷酸酶的突变细菌基因的表达，使块茎的淀粉含量适度提高大约20％(Stark等，1992)，这是获取的有限进展。但是最近在较高产马铃薯变种中重复该方法的工作，无论在大田或温室条件下，并未表现出淀粉含量提高(Herbers等，1996)。总之，仍有相当大的余地来提高转基因马铃薯植物的块茎淀粉含量。
NAD-苹果酸酶(NAD-ME)是普遍存在于高等植物中的代谢酶，但对其功能目前有争议。它催化苹果酸的氧化脱羧
总体来说，该酶是NAD-联动(linked)的苹果酸脱氢酶(脱羧)(非OAA脱羧)，酶分类为EC 1.1.1.39。在此称为NAD-ME。
作为对三羧酸(TCA)循环(参见

图1)通量控制的一般性研究的一部分，分离了编码NAD-ME亚基的cDNA克隆。在马铃薯中，存在分别为62kDa和59kDa的两种NAD-ME亚基(Winning等，1994)。为了更好地了解NAD-ME的功能，产生了以反义方向表达编码59kDa亚基的cDNA克隆的转基因马铃薯植物，总目的在于降低植物中的NAD-ME活性，并确定代谢结果(Hill等，1996)。先前的研究表明，这些转基因植物中的NAD-ME活性已降低至野生型植物中NAD-ME活性的40％，但未显示明显的形态学表型或生长速率的改变。
现已发现，降低马铃薯植物中的NAD-ME活性，该植物块茎的淀粉含量显著提高。NAD-ME定位于线粒体中，因此在代谢方面不同于在马铃薯块茎的造粉体中进行的淀粉合成途径(参见图1)。观察到的淀粉合成效应通过一个或多个代谢物浓度而介导。这就为提高淀粉含量提供了新方法。如前所述，先前操纵淀粉合成的的努力集中在淀粉生物合成酶本身。一旦一种其浓度通过NAD-ME活性的降低而改变的代谢物得以鉴定，则有可能设计另一种策略来操纵该代谢物浓度、继而控制淀粉含量。事实上，已经表明3-磷酸甘油酸(3-PGA)含量的增加与淀粉含量的增加相关。预期这种情况也适用于其它代谢物。本领域技术人员能够鉴定更多代谢物并操纵其浓度。
因此本发明一方面提供产生淀粉的方法，有以下步骤a)提供一种植物，该植物经过修饰，以便因改变了为糖酵解和三羧酸循环的中间物的一个或多个代谢物的浓度，而使植物中的淀粉含量提高；并且b)从该植物收集含淀粉的材料。
另一方面，本发明提供经过修饰的植物，作为在糖酵解和三羧酸循环的中间物的一个或多个代谢物的浓度改变后的结果，该植物中的产淀粉能力增强，条件是排除通过反义技术降低NAD-ME活性的马铃薯植物；本发明还提供经过遗传修饰、以便能够再生成经过修饰的植物的植物细胞。
另一方面，本发明提供上述修饰植物的用途，即用于产生含淀粉材料；以及上述修饰细胞的用途，即再生成产生含淀粉材料的植物。
另一方面，本发明提供淀粉储存植物用于产生含淀粉材料的用途，该植物经过遗传修饰，因而可降低NAD-ME活性；并提供淀粉储存植物的植物细胞用于产生含淀粉材料的用途，该细胞经过遗传修饰，因而可降低从该植物细胞再生的植物的NAD-ME活性。
另一方面，本发明提供含有在植物中发挥功能的启动子的重组双链DNA分子，该启动子能够在植物的淀粉储存组织中优先发挥功能，该启动子操作性地连接于能够降低植物中NAD-ME活性的DNA序列上。
另一方面，本发明提供用所述重组DNA分子转化的植物细胞；并提供含有这种植物细胞的植物，其中NAD-ME活性在该植物的淀粉储存组织中优先降低。
在附图中
图1A表示糖酵解和三羧酸循环之间的互作，以及淀粉储存植物中的淀粉生物合成；图1B表示糖酵解的完整步骤；图2表示载有以反义方向编码59kDa NAD-ME亚基的cDNA的转基因马铃薯系中NAD-ME的活性，(A)在花椰菜花椰病毒35S启动子的控制之下；(B)在B33 patatin启动子控制下；图3表示转基因马铃薯植物块茎中的淀粉含量和淀粉合成通量，该转基因马铃薯植物在花椰菜花椰病毒35S启动子的控制下，表达以反义方向编码NAD-ME的cDNA；图4表示转基因马铃薯植物块茎中的淀粉含量，该转基因马铃薯植物在花椰菜花椰病毒35S启动子的控制下，表达以反义方向编码NAD-ME的cDNA；图5表示正发育的马铃薯块茎中NAD-ME活性和淀粉含量的关系；图6表示来自NAD-ME活性降低的正发育块茎的块茎圆盘的14C-葡萄糖代谢；以及图7表示在NAD-ME活性降低的野生型植物和转基因植物的正发育块茎中，NAD-ME活性和3-PGA含量、以及3-PGA含量和淀粉含量之间的关系。
图8表示编码马铃薯NAD-ME的59kDa和62kDa亚基的cDNA序列(Winning等，1994；数据库编号分别为Z23002和Z23023)。
在马铃薯的正发育块茎中，TCA循环和淀粉生物合成之间的互作示于图1A。NAD-ME催化TCA循环中苹果酸向丙酮酸的转化，该酶位于线粒体中。进入TCA循环的苹果酸和丙酮酸，均为糖酵解过程(图1B)的产物，参与己糖降解。在糖酵解过程链中早于苹果酸和丙酮酸的代谢物包括草酰乙酸(OAA)、磷酸(烯醇式)丙酮酸(PEP)和3-磷酸甘油酸(3-PGA)。已知这些代谢物中，PEP和3-PGA通过激活ADP-葡萄糖焦磷酸酶(AGP酶)而对淀粉合成产生正效应(Preiss，1988)。NAD-ME活性下降时，包括3-PGA在内的一个或多个这些代谢物的形成导致淀粉合成的增加。
为糖酵解和TCA循环中间物的代谢物，被认为是来自图1A和1B流程中果糖-6-磷酸直至TCA循环的所有代谢物，并包括在TCA循环中的代谢物。
参与马铃薯块茎糖酵解的代谢物和酶示于图1A中，其细节示于图1B中。这些相同的代谢物参与所有有机体的糖酵解(例如参见Dennis等，1996)。所涉及的酶类在它们催化相同的反应方面也相同，但是它们在每种有机体中的氨基酸序列不同(虽然有关)。因此来自不同有机体、催化相同反应的酶可描述为同功的。
类似地，在高等植物中参与TCA循环的代谢物和酶类相同(例如参见Hill等，1996)。
本发明涉及的植物可以是任何或长久或暂时储存淀粉的高等植物。通常，所述植物具有淀粉储存组织，可为诸如块茎、根、种子以及谷粒等器官。其它淀粉储存组织例如包括诸如玉米、草和苜蓿的饲料作物中的叶片和茎。淀粉储存组织包括暂时储存淀粉的组织，例如诸如种子的储油组织和储蛋白组织。因而根据发明的修饰植物对于生产淀粉是有用的，这种情况下可采集含淀粉材料，或在产生其它材料时有用，这种其它材料在存在修饰淀粉合成时其产量增加。该种其它材料例如包括分别来自诸如芸苔和亚麻的作物的油和纤维。
本发明涉及的植物包括下列植物组(i) 水果和蔬菜(例如马铃薯、番茄、香蕉)；(ii) 谷类(例如玉米(大谷粒谷物)、小麦、水稻和大麦(小谷粒谷物)；(iii) 含油种子(例如大豆、云苔、向日葵)。
还包括其它不在以上三组中任何一组的高等植物，例如诸如树和亚麻的纤维作物。
本发明涉及的植物可以是双子叶植物或单子叶植物。期望在其中能够提高淀粉合成的特殊组织包括玉米胚乳、水稻胚乳、豌豆胚乳、小麦胚乳、大豆子叶、马铃薯块茎和木薯块茎。本发明可提供商业用途的植物实例除马铃薯和其它块茎作物外，包括玉米、小麦、水稻、大麦、高粱、黍、芸苔、番茄、糖甜菜、木薯、薯蓣、芜菁、swede、胡萝卜、香蕉、以及诸如豌豆和大豆的豆科植物。每种这些植物的商业用途至少一部分取决于该植物的淀粉含量或产淀粉能力。
植物一般在称为质体的细胞器中合成淀粉，质体包括光合组织的叶绿体、以及非光合组织的造粉体。淀粉合成还发生于储油组织的白色体中。
或许将增加的淀粉含量优先定位于植物中的淀粉储存组织是有益的。这使得能够避免任何对光合作用的不利影响。“淀粉储存组织”表达在长期或短期的基础上，将包括长久地或暂时储存淀粉的组织。淀粉储存组织通常为非光合组织，因此排除例如叶片。然而某些淀粉储存组织在其发育中可具有光合阶段。例如，香蕉未成熟时是绿色的(光合作用)，并储存淀粉直至成熟，这时淀粉转化为糖。番茄未成熟时也进行光合作用；淀粉短期暂时储存，起缓冲糖份含量的作用。
植物中淀粉含量的增加通过遗传操作而获得，且最好作为遗传特征。最好是，该植物具有稳定整合到该植物基因组中的遗传物质，该遗传物质能够导致淀粉产量增强。在此处描述的本发明特定实施例中，用在启动子控制下、以反义方向相应于NAD-ME亚基基因的双链cDNA分子转化马铃薯植物细胞。结果表明，需要降低50％的NAD-ME活性来获得马铃薯中淀粉含量的显著提高。因此，可能最好降低至少50％的NAD-ME活性。该阈值可根据植物的特定物种和所涉及的特定组织而变化，可以通过试验直接决定。
插入植物细胞基因组中产生淀粉含量提高植物的双链DNA分子，可通过任何适合的方法导入该植物细胞中。人们熟知将基因转入植物中的适合载体。两种最广泛运用的转化植物细胞的方法是农杆菌介导的转化(在此处在实施例中使用)，以及通过微弹轰击(“基因枪”)或用碳化硅须晶进行的DNA直接转化。从转化植物细胞再生成植株的技术也为人们所熟知。其中导入的或异源的DNA变成以孟德尔方式表现的真正遗传的基因座，这常被称作“转基因”。
为了在植物细胞中表达异源DNA分子，需要适合的启动子。适合的启动子是在所涉及植物中发挥功能的启动子；本领域技术人员熟知适合的启动子。该启动子可为基本上组成型活性的启动子，例如花椰菜花椰病毒35S启动子、水稻肌动蛋白启动子、拟南芥遍在蛋白(UBQ3)启动子、或玉米遍在蛋白启动子；或可为条件型启动子，在特定条件下优先有活性。条件型启动子包括在特定组织中优先有活性的启动子，例如patatin启动子，它使马铃薯块茎的基因表达增强。patatin启动子也作用于番茄中，这时它是有效的果实专一性的。patatin启动子由糖诱导。其它块茎增强启动子包括马铃薯的GBSS/蜡质启动子。谷粒/种子增强启动子例如包括玉米的玉米醇溶蛋白(zen)启动子和来自淀粉生物合成基因的启动子。果实增强启动子包括番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)启动子。
将DNA分子导入细胞时，为了获得希望的效果(通常是转化细胞中该DNA的表达)，需要考虑诸多因素。转基因在细胞基因组中的定位将影响其表达，细胞基因组中存在的转基因拷贝数也影响其表达。不同的启动子会有不同的强度，因此转基因DNA转录为RNA的速率会变动。所以启动子强度影响转基因的表达。
另外，诸如转基因产物稳定性的因素需要考虑，特别是当异源DNA对于引入其的物种来说为非天然时。将该DNA导入的目的为蛋白表达时，可将DNA进行修饰，除去已知的mRNA不稳定基序和/或偶然剪接区；或采用该重组DNA欲插入的有机体的偏爱密码子，这样所述有机体中经修饰DNA的表达产生大致类似的蛋白，该蛋白的活性或功能与该有机体中由未修饰的重组DNA的表达而获得的大致相类似，其中该有机体中编码未修饰重组DNA组分的蛋白是内源性的。在运用反义技术或共抑制技术时，可采取适合的步骤来增强负责抑制希望降低活性的蛋白表达的RNA产物的稳定性。本领域专业人员能够设计适当的、顾及所有这些因素的遗传操作策略。
有关降低NAD-ME活性对于淀粉在马铃薯块茎中积累的影响，提出了四种假设，可排除其中三种假设。
1.碳重定向(redirection)。碳作为蔗糖进入正发育的块茎，蔗糖分解为磷酸己糖。然后这些磷酸己糖进入三种路径淀粉合成；细胞组分、主要是用于细胞扩增的纤维素及其它细胞壁组分的合成；以及进行呼吸作用，提供生物合成所需的ATP。该第一种假说认为NAD-ME活性降低抑制碳流向呼吸作用，因此“多余”的碳转向淀粉合成。排除这种假说的理由有两条第一，由于淀粉合成所需的ATP得自呼吸作用，因此呼吸速率的显著降低会导致淀粉合成速度的下降而非提高。第二，尚未检测到转基因操作对呼吸率的影响。
2.淀粉生物合成酶的诱导。这种假说认为，或许在接近NAD-ME的代谢物(例如在TCA循环中的中间体)中，代谢物含量的某些变化起着改变一个或多个淀粉生物合成酶编码基因表达的信号的作用。后一种改变似乎会导致淀粉生物合成速度的提高。通过测量六个淀粉合成专一步骤中的四个步骤的活性，对这种假说进行了检验。未发现磷酸葡萄糖变位酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、无机焦磷酸酶或可溶性淀粉合酶活性的显著升高。(参见图1)。
3.调节淀粉合成的代谢物浓度提高。植物中的淀粉合成由多个代谢物调节。这种调节的主要靶似乎是ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，它由多个糖酵解下端的代谢物、特别是3-磷酸甘油酸(3PGA)和磷酸(烯醇式)丙酮酸(PEP)进行调节(Preiss，1988)。这些分子是AGP酶的激活物，对无机磷酸有拮抗作用，磷酸是这种酶的负调节剂。NAD-苹果酸酶活性的降低有可能已导致苹果酸、草酰乙酸(OAA)、PEP和3PGA(参见图1)的生成，因为后两种代谢物的增加导致淀粉合成通量增加。通过测量转基因系中代谢物稳态含量，可轻易地检验这种假说。事实上，检测结果已表明，在NAD-ME活性降低的转基因马铃薯系中，3-PGA含量与淀粉含量相关。
4.1-磷酸葡萄糖的生成。1-磷酸葡萄糖是淀粉合成的底物，因此如果NAD苹果酸酶活性的下降引起全部糖酵解中间体的形成，则1-磷酸葡萄糖浓度的增加可仅仅通过底物供应效应而导致淀粉合成速率增加。这种假说看来不正确，因为细胞中的代谢物含量通常被严格缓冲。另外，在转基因系中检测不到1-磷酸葡萄糖水平的明显变化。
以下描述按照本发明增加储存器官中淀粉积累的各种替代策略。应该明确，以下只是举例来进一步描述本发明，而非施加任何限制。a.降低马铃薯中NAD-苹果酸酶活性的替代方法。
i. 62kDa亚基的反义降低，单独降低或与59kDa亚基共同降低。
ii.运用共抑制构成物降低活性。当编码序列或编码序列的片段被重导入分离它们的植物物种中时，所编码的酶的活性常常通过为共抑制现象而降低(例如参见Gottibo-McHugh等，1992和Davies等，1997)。因此，用编码NAD-苹果酸酶亚基的其中之一或二者的基因序列以反义方向转化马铃薯，就可以降低NAD-苹果酸酶活性。
iii.通过同源重组(如Kempin等1997)和切除/修复机制(如“Kimeroplasty”，May等，1997和Kimiec等1997)破坏靶基因。
iv. 内源性NAD-苹果酸酶基因表达的操纵。已分离出NAD-苹果酸酶两种亚基的基因组克隆，正在分析启动子的结构。对于参与NAD-苹果酸酶表达调节的任何特异性DNA结合蛋白，有可能通过反义抑制或共抑制对这些蛋白的水平进行操作，使NAD-苹果酸酶两种亚基的表达均降低。
v. NAD-苹果酸酶作为两种亚基的异二聚体而发挥功能。除了作为这种二聚体存在外，人们相信在体外还可发现四聚体和八聚体(Grover和Wedding，1984)。二聚体、四聚体和八聚体具有不同的动力学特性，提示聚集状态的变化可能与体内该酶的活性调节有关(Grover和Wedding，1984)，尽管尚无确定的证据支持这一观点。有可能在酵母中运用“双杂交”筛选步骤(Fields和Song，1989)来分离破坏59-62互作或四聚体或八聚体形成的多肽。将编码这些肽的DNA序列导入转基因植物中，这可以为降低NAD-苹果酸酶活性提供再一方法。
b.在淀粉储存物种中降低NAD-苹果酸酶活性的方法。
反义方法以及(a)中描述的替代方法能够同样好地应用于任何高等植物物种，前提为能够分离出编码NAD-苹果酸酶亚基的cDNA和基因组克隆，并可得到转化系统。从其它物种中分离编码NAD-苹果酸酶亚基的cDNA和基因组克隆是常规方法；PCR扩增、异源筛选、以及用现有或能以已知方法产生的抗体筛选表达文库，这些方法均预期可成功。对于许多有经济价值的物种，包括玉米和水稻，转化系统存在。将有可能为目前尚未得到转化系统的其它物种开发转化系统。一个重要要求是，存在驱动转基因在所需组织中表达的合适启动子；通常有可利用的适合启动子，在文献中有所描述。
c.增加储存器官中淀粉含量的选择性方法。
如以上所讨论的，NAD-苹果酸酶在代谢上远离淀粉合成路径，且对淀粉合成的效应通过一个或多个代谢物的浓度的改变来介导。可设计受影响代谢物浓度的替代操作策略。例如，如以上所表明，由于淀粉合成由3-PGA的增加而激活，则通过降低胞质中苹果酸脱氢酶、PEP羧化酶(PEPCase)、或丙酮酸激酶、或这些酶的任意组合，可获得相似的效应(参见图1)。另一方面，可以预期提高磷酸甘油酸激酶的活性可使3-PGA的浓度提高。将升高的磷酸甘油酸激酶活性与降低的NAD-ME、胞质苹果酸脱氢酶、PEPCase、或丙酮酸激酶的活性相组合，能够潜在性地获得更显著的改变。对磷酸甘油酸变位酶或烯醇化酶活性的操作也可有效。
由于在马铃薯块茎中观察到的伴随NAD-ME活性降低的淀粉合成增加，至少一部分应归因于3-PGA浓度的升高，因此按照本发明的植物和方法可以利用这种代谢物浓度的升高。在所有植物细胞胞质中发生的糖酵解顺序中，3-PGA是中间物(Dennis等，1996)。图1B表示该路径的简单代谢流程。产生3-PGA的酶是磷酸甘油酸激酶，将其用作底物的酶是磷酸甘油酸变位酶。理论上，在糖酵解顺序中，提高3-PGA之前任何酶(磷酸果糖激酶、焦磷酸6-磷酸果糖1-磷酸转移酶、醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸甘油酸激酶)的活性，或降低3-PGA之后任何酶(磷酸甘油酸变位酶、烯醇式酶、丙酮酸激酶、PEP羧化酶、胞质苹果酸脱氢酶)、以及线粒体中发现的酶(如NAN-苹果酸酶)的活性，就能够提高3-PGA的浓度。但是，可排除下列酶的操作来获得淀粉合成的增加。
1.磷酸果糖激酶Burrell等，(1994)制造了磷酸果糖激酶活性提高20倍的转基因马铃薯植物。在这些植物的块茎中，3-PGA的浓度大幅度升高，但淀粉合成未改变。对此最可能的解释是块茎中己糖磷酸浓度降低；特别是1-磷酸-葡萄糖浓度降低。这将导致淀粉合成速率降低，因为1-磷酸-葡萄糖是这条路径的低物。这些植物中淀粉合成速率的改变是由于1-磷酸-葡萄糖的降低和3-PGA的增加相互抵消的效应。
2.丙糖磷酸异构酶该酶活性超量存在，所催化的反应已十分接近平衡。因此，提高其活性不可能显著提高3-磷酸-甘油醛的浓度，这样3-PGA的浓度将保持不变。
不依靠任何降低NAD-苹果酸酶活性的操作而达到提高3-PGA浓度的优选途径，即为提高磷酸甘油酸激酶的活性。
除在胞质中发现糖酵解路径之外，还在质体中发现相当的反应顺序。在质体中未发现焦磷酸6-磷酸果糖1-磷酸转移酶和PEP羧化酶，但在大多数植物物种的质体中存在所有其它糖酵解酶的同功酶。由于提高3-PGA浓度的靶酶ADP葡萄糖焦磷酸化酶位于质体内，因此靶目标定为提高该细胞器中的3-PGA浓度可能是有益的。例如，特异性地提高质体中磷酸甘油酸激酶的活性即可达到此目的。
一般情况下，可将与上述3-PGA相类似的策略应用于任何代谢物。虽然极少努力将这些方法应用于植物系统，但对于通过操作酶活性提高代谢物浓度普遍存在的问题仍进行过理论思考(Small和Kacser，1994)。不愿运用这些方法的起因至少一部分是由于通常人们认为代谢物浓度在细胞内被精密调节，因而难于操作。本发明的证据表明与这些看法相反，对糖酵解和TCA循环中酶活性的操作可有效提高植物的淀粉含量。
现在以下列实施例来进一步描述本发明。
实施例实施例1用反义技术降低马铃薯植物中的NAD-ME活性按Hill等1996年描述的方法产生转基因马铃薯系(20个独立转化子)。简言之，用亲和纯化的抗体(该抗体以纯化的马铃薯NAD-ME制备)(Winning等，1994)，从马铃薯的cDNA表达文库中分离编码NAD-ME 59 kDa亚基的cDNA克隆。将该cDNA克隆进双元载体pBIN19中(Bevan，1984)。按照Hfgen和Willlmitzer(1988)的直接转化法将该双元载体导入农杆菌中。以农杆菌介导的基因转化法转化马铃薯茎外植体，该法沿用经Sheerman和Bevan(1988)修改的Twell和Ooms(1987)法。然后在将cDNA以反义方向重新导入马铃薯植物(cv.Desiree)中，位于35S花椰菜花椰病毒启动子的控制之下。
测量马铃薯块茎提取物中丙酮酸转化为苹果酸的速率，即可确定NAD-ME活性；丙酮酸浓度用分光光度法试验测定。通过测定用淀粉葡萄糖酶消化后所释放的葡萄糖量，确定马铃薯块茎提取物的淀粉含量；葡萄糖浓度用分光光度法试验测定。
为了测定淀粉合成速率，从储存的块茎中切取圆盘，在14C-葡萄糖存在下温育2小时。以淀粉葡萄糖酶消化淀粉后溶解的14评估淀粉合成速率。
结果示于图2至图4。图2A表示多种转基因系内的NAD-ME活性；对照组为野生型(WT)植物，即只含有载体DNA的非转化系或PA7系。图3表示(A)NAD-ME活性和块茎组织的淀粉含量之间的关系；以及(B)马铃薯块茎圆盘的NAD-ME活性和淀粉合成速率之间的关系。数值为平均值±SE(n＝3-5)。图4表示具有一定范围NAD-ME活性的转基因系的块茎中淀粉含量的重复测定。在图3和图4中，每个点代表一个独立的转基因系。总之这些结果表明，在几个独立转基因系中，淀粉含量提高和NAD-ME活性降低之间有良好的相关性；淀粉含量提高和碳向淀粉的流向之间有良好的相关性。产生图4结果的转基因植物与产生图3结果的转基因植物来自不同批次的植物。图4的结果证明，转基因操作引起NAD-ME活性降低，这反过来和块茎中淀粉含量的实质性(2倍)提高有关。
初步数据(未显示)表明，在这些转基因系的叶片中未发现淀粉增加。实施例2用patatin启动子以块茎-特异性方式降低NAD-ME活性如实施例1中所描述的，与产生所有组织中NAD-ME活性降低的植物相类似，产生含有由马铃薯B33 patatin启动子(Rocha-Sosa等，1989)控制的反义基因的转基因植物。图2B表示多种这些转基因的NAD-ME活性。如上所述测定该酶活性。在这些植物中观察到高的淀粉表型(数据未出示)。实施例3NAD-ME活性的降低按实施例1和例2的描述产生转基因马铃薯系，并确定正发育的块茎中NAD-苹果酸酶和淀粉含量之间的关系。图5表示一批典型温室植物的结果。图上的各点代表来自生长于相同时间的单批次植物的单个块茎(采集编号1)。通过线性回归拟合该线，相关系数示于表1。在其它单独生长的植物批次中已观察到这批植物所显示的显著相关性(表1)。表1.正发育的马铃薯块茎中NAD-苹果酸酶活性、3-磷酸甘油酸含量以及淀粉含量之间的相关性。测定来自NAD-苹果酸酶活性降低的多种转基因系和野生型植物的正发育块茎中的NAD-苹果酸酶活性、3-磷酸甘油酸含量和淀粉含量。通过线性回归测定相关系数，通过对相关系数的双尾显著性检定而确定相关性的显著性。标有星号的数值具有显著性(P＜0.05)，nd＝未确定。采集 样品 大小两者之间相比较的相关系数(r)(块茎编号)NAD-ME和淀粉 NAD-ME和3-PGA 3-PGA和淀粉1 400.345*0.358*0.744*2 200.314 0.453*0.454*3 260.510*0.411*0.539*4 19 nd nd 0.614*重复图3B中所示淀粉合成速率的初步测定。特别是，实施例1和实施例2中描述的试验用贮存的马铃薯块茎进行，而现在描述的数据适用于正发育块茎。给来自生长中块茎的组织圆盘提供放射性(14C)葡萄糖，并调查该葡萄糖的代谢结果。NAD-苹果酸酶活性最低的三个系和具有野生型NAD-苹果酸酶活性的转化系的结果示于图6中。块茎圆盘取自最近采集的生长中块茎，并在14C-葡萄糖存在下温育2小时。切割该组织，测定个组分中掺入的14C。数据以占代谢后总的14C的百分数表示，数值为三次重复的平均值。T15系具有与野生型相类似的NAD-苹果酸酶活性；20系、21系和22系的活性显著降低。淀粉的增加标示和蔗糖的降低标示与NAD-苹果酸酶活性降低的块茎组织中淀粉合成速率的显著升高相一致。实施例4马铃薯块茎中3-磷酸甘油酸的增加与淀粉含量提高相关测定实施例3中转基因马铃薯块茎的3-PGA含量。典型植物批次的结果示于图7中。各点代表来自生长于同一时间的单批植物的单个块茎(采集编号1)。通过线性回归拟合该线，相关系数示于表1。在NAD-苹果酸酶活性和3-PGA含量之间存在强的负相关；淀粉含量表示出与3-PGA含量之间强的正相关。在独立生长的植物批次中已经观察到NAD-苹果酸酶活性/3-PGA相关性，以及淀粉/3-PGA相关性(表1)。实施例5编码NAD-苹果酸酶的cDNA的分离(a)运用已发表的编码NAD-苹果酸酶亚基的两种马铃薯cDNA序列(Winning等，1994)，鉴别在两种亚基cDNA的两端(5’和3’)之间保守的序列。在多聚酶链式反应(PCR，例如参见Grof等，1995)中，将相应于这两种序列的合成寡核苷酸用作引物。
(b)从即将进行操作的目的物种的组织中分离mRNA，用以产生cDNA文库。采用来自靶组织的mRNA很重要，这样就能够分离到相应于NAD-苹果酸酶的正确的同功酶。
(c)用(a)中产生的引物扩增来自(b)中产生的文库的cDNA，该cDNA含有编码相应于NAD-苹果酸酶的DNA核苷酸序列。通过与马铃薯中的序列相比较(Winning等，1994)，得以确认对编码NAD-苹果酸酶的序列的鉴别。实施例6块茎中NAD-苹果酸酶活性被短的有义抑制的马铃薯植物的产生(a)将编码NAD-苹果酸酶59 kDa亚基的cDNA的50-100个核苷酸片段以有义方向亚克隆进修饰后的双元载体中。该cDNA片段正好插在B33 patatin启动子(Rocha-Sosa等，1989)的下游，这使块茎中该cDNA片段的表达增强。这种短有义基因的表达曾显示可导致靶酶的活性降低(Cameron和Jennings，1991；Que等，1997)。除cDNA和patatin启动子之外，该双元载体在T-DNA的两边界之间也含有编码磷酸甘露糖异构酶的cDNA。
(b)用Hfgen和Willmitizer(1988)的直接转化法，将(a)中产生的双元载体转化进根癌农杆菌(菌株LBA4404)中。
(c)按照Sheerman和Bevan(1988)修改的Twell和Ooms(1987)的共培养法，将来自农杆菌的T-DNA转化进马铃薯茎外植体中。
(d)存在甘露糖时，根据植物的生长能力鉴定转化植物。甘露糖一般对植物细胞有毒，但是转化植物由于存在磷酸甘露糖异构酶的序列而能够耐受。实施例7种子胚乳中NAD-苹果酸酶活性短有义抑制的玉米植物的产生(a)按以上实施例5的方法，获得来自玉米的编码NAD-苹果酸酶59 kDa亚基的cDNA的50-100个核苷酸片段，将其亚克隆进质粒中。将该cDNA片段正好插在玉米醇溶蛋白启动子(Schernthaner等，1988)的下游，这使胚乳中该cDNA片段的表达增强。这种短有义基因的表达曾显示可导致靶酶的活性降低(Cameron和Jennings，1991；Que等，1997)。除cDNA和玉米醇溶蛋白启动子之外，该质粒也含有编码由组成型CaMV 35S启动子驱动的草丁膦乙酰转移酶的cDNA。后一种基因赋子对草铵膦(glufosinate ammonium)的抗性。
(b)用碳化硅须晶转化方法(Frame等，1994)，将质粒转进胚发生玉米悬浮培养细胞中，并按Frame等(1994)的方法从悬浮培养细胞再生植株。
(c)在除草剂草铵膦存在的情况下，通过植物生长能力鉴别转基因植物。实施例8种子胚乳中NAD-苹果酸酶活性短有义抑制的云苔(Brassica napus)植物的产生(a)按以上实施例5的方法，获得来自芸苔的编码NAD-苹果酸酶59 kDa亚基cDNA的50-100个核苷酸的片段，将其以有义方向亚克隆进经修饰的双元质粒中。将该cDNA片段正好插在种子特异性的油质蛋白启动子(Keddie等，1994)下游，这使该cDNA片段在种子中的表达增强。这种短有义基因的表达曾显示可导致靶酶的活性降低(Cameron和Jennings，1991；Que等，1997)。除该cDNA和油质蛋白启动子之外，该双元载体在T-DNA的两边界之间也含有编码磷酸甘露糖异构酶的cDNA。
(b)用Hfgen和Willmitizer(1988)的直接转化法，将(a)中产生的双元载体转化进根癌农杆菌(菌株LBA4404)中。
(c)用共培养法，将来自农杆菌的T-DNA转移进叶圆盘中。
(d)存在甘露糖时，根据植物的生长能力鉴定转化植物。甘露糖一般对植物细胞有毒，但是转化植物由于存在磷酸甘露糖异构酶的序列而能够耐受。实施例9提高胞质中磷酸甘油酸激酶的活性从而提高马铃薯块茎中3-PGA的浓度(a)从马铃薯之外的植物种中获得编码磷酸甘油酸激酶的cDNA，将其以有义方向亚克隆进修饰后的双元载体中。已经分离出来自烟草的编码这种酶的cDNA(Bringloe等，1996)，并可随意使用。将该cDNA正好插入B33 patatin启动子(Rocha-Sosa等，1989)的下游，该启动子可使该cDNA在块茎中的表达增强。除该cDNA和patatin启动子之外，该双元载体在T-DNA的两边界之间也含有编码磷酸甘露糖异构酶的cDNA。
(b)用Hfgen和Willmitizer(1988)的直接转化法，将(a)中产生的双元载体转化进根癌农杆菌(菌株LBA4404)中。
(c)按照Sheerman和Bevan(1988)修改的Twell和Ooms(1987)的共培养法，将来自农杆菌的T-DNA转移进马铃薯的茎外植体中。
(d)存在甘露糖时，根据植物的生长能力鉴定转化植物。甘露糖一般对植物细胞有毒，但是转化植物由于存在磷酸甘露糖异构酶的序列而能够耐受。实施例10提高质体中磷酸甘油酸激酶的活性可提高马铃薯块茎造粉体中3-PGA的浓度(a)从马铃薯之外的植物种中获得编码磷酸甘油酸激酶的cDNA，将其以有义方向亚克隆进修饰后的双元载体中。已经分离出来自烟草的编码该酶质体同功酶的cDNA(Bringloe等，1996)，并可随意使用。将该cDNA正好插入B33 patatin启动子(Rocha-Sosa等，1989)的下游，该启动子可使块茎中该cDNA的表达增强。将来自烟草核酮糖二磷酸羧化酶的质体导向序列作为与该cDNA的翻译融合物插入该cDNA和启动子之间。这将保证马铃薯块茎中产生的烟草磷酸甘油酸激酶被引至造粉体中。除该cDNA和patatin启动子外，该双元载体在T-DNA的两边界之间也含有编码磷酸甘露糖异构酶的cDNA。
(b)用Hfgen和Willmitizer(1988)的直接转化法，将(a)中产生的双元载体转移进根癌农杆菌(菌株LBA4404)中。
(c)按照Sheerman和Bevan(1988)修改的Twell和Ooms(1987)的共培养法，将来自农杆菌的T-DNA转移进马铃薯的茎外植体中。
(d)存在甘露糖时，根据植物的生长能力鉴定转化植物。甘露糖一般对植物细胞有毒，但是转化植物由于存在磷酸甘露糖异构酶的序列而能够耐受。实施例11提高马铃薯块茎胞质中的3-PGA浓度，同时对糖酵解通量的影响甚微这种方法以Kacser和Acerrenza(1993)提出的理论方法为基础。为了减小对代谢通量的影响，将产生3-PGA、磷酸甘油酸激酶的酶活性提高；而将消耗它的磷酸甘油酸变位酶的酶活性降低。按实施例9所述使磷酸甘油酸激酶增加；而采用实施例6所述的类似方法，可以从马铃薯中获得编码烯醇式酶的cDNA后，使烯醇化酶活性降低。
参考文献Bevan，M.W.(1984)Nucl.Acids Res.12，8711-8721。Bringloe，D.H.，Rao，S.K.，Dyer，T.A.，Raines，C.A.和Bradbeer，J.W.(1996)烟草叶绿体和胞质中磷酸甘油酸激酶的差别基因表达。PlantMol.Biol.，30，637-640。Burrell，M.M.，Mooney，P.J.，Blundy，M.，Carter，D.，Wilson，F.，Green，J.，Blundy，K.S.和ap Rees，T.(1994)马铃薯块茎中6-磷酸果糖激酶的遗传操作。Planta，194，95-101。Cameron，F.H.和Jennings，P.A.(1991)短有义片段抑制基因表达。Nucl.Acid.Res.，19，469-475。Davies，G.J.，Sheikh，M.A.，Ratcliffe，O.J.，Coupland，G.和Furner，I.J.(1997)在拟南芥属中沉默的同源独立转基因的遗传学甲基化的作用。Plant J.，12，791-804。Dennis，D.T.，Huang，Y.和Negm，F.B.(1996)_糖酵解、戊糖磷酸路径和厌氧呼吸。Plant Metabolism(Dennis，D.T.，Turpin，D.H.，Lefebvre，D.D.和Layzell，D.B.编辑)。LondonAddison Wesley Longman，第105-123页。Fields，S.和Song，O.(1989)Nature 340，245-246。Frame，B.R.，Drayton，P.R.，Bagnall，S.V.，Lewnau，C.J.，Bullock，W.P.，Wilson，H.M.，Dunwell，J.M.，Thompson，J.A.和Wang，K.(1994)通过碳化硅须晶介导的转化产生可育的转基因玉米植物。Plant J.，6，941-948。Geigenberger，P.，Merlo，L.，Reimholz，R.和Stitt，M.(1994)Planta 193，486-493。Gottlob-McHugh，S.G.，Sangwan，R.S.，Blakely，S.D.，Vanlerberghe，G.C.，Ko，K.，Turpin，D.H.，Plaxton，W.C.，Miki，B.L.和Dennis，D.T.(1992)Plant Physiol.100，820-825。Grof，C.P.L.，Winning，B.M.，Scaysbrook，T.P.，Hill，S.A.和Leaver，C.J.(1995)线粒体丙酮酸脱氢酶Ela亚基的分子克隆和表达分析。PlantPhysiol.，108，1623-1629。Grover，S.D.和Wedding，R.T.(1984)Arch.Biochem.Biophys.234，418-425。Herbers，K.和Sonnewald，U.(1996)Trends Biotech.14，198-205。Hill，S.A.，Wining，B.M.Jenner，H.，Knorpp，C和Leaver，C.J.(1996)Biochem.Soc.Trans.24，734-746。Hill，S.A.(1996)线粒体中的碳代谢。Plant metabolism(Dennis，D.T.，Turpin，D.H.，Lefebvre，D.D.和Layzell，D.B.编辑)。LondonAddisonWesley Longman，第181-199页。Hfgen，R.和Willmitzer，L.(1988)用于农杆菌转化的感受态细胞的储存。Nucl.Acid Res.，16，9877-9877。Kacser，H.和Acerenza，L.(1993)使代谢物产量增加的通用方法。Eur.J.Biochem.，216，361-367。Keddie，J.S.，Tsiantis，M.，Piffanelli，P.，Cella，R.，Hatzopoulos，P.和Murphy，D.J.(1994)种子特异性芸苔油质蛋白启动子与G框特异性蛋白互作，并可以是双向的。Plant Mol.Biol.，24，327-340。Kempin等(1997)Nature 389，802-803。Kimiec等(1 997)Science。Kortstee，A.J.，Vermeesch，A.M.S.，de Vries，B.J.，Jacobsen，E.和Visser，R.G.F.(1996)Plant J.10，83-90。May等(1997)ISPMB Conference，Singapore。Müller-Rber，B和KoBmann，J.(1994)Plant Cell Environ.17，601-613。Preiss，J.(1988)The biochemistry of plants，第14卷(Preiss，J.编辑)，第181-254页，Academic Press。Que，Q.D.，Wang，H.Y.，English，J.J.和Jorgensen，R.A.(1997)由有义查尔酮合酶转基因引起的共抑制的频率和程度取决于转基因启动子的强度，并被转基因编码序列中成熟前无义密码子降低。Plant Cell，9，1357-1368。Rocha-Sosa，M.，Sonnewald，U.，Frommer，W.，Stratamnn，M.，Schell，J.和Willmitzer，L.(1989)发育信号和代谢信号均激活I类patatin基因的启动子。EMBO J.，8，23-29。Schernthaner，J.P.，Matzke，M.A.和Matzke，A.J.M.(1988)转基因烟草植物中玉米醇溶蛋白基因启动子的胚乳特异活性。EMBO J.，7，1249-1255。Sheerman，S.和Bevan，M.W.(1988)采用根癌农杆菌双元载体的(Solanum tuberosum)的快速转化方法。Plant Cell Rep.，7，13-16。Small，J.R.和Kacser，H.(1994)Eur.J.Biochem.226，649-656。Stark，D.M.，Timmerman，K.P.，Barry，G.F.，Preiss，J.and.Kishore，G.M.(1992)Science 258，287-292。Twell，D.和Ooms，G.(1987)patatin基因的5’邻接dna指导马铃薯中嵌合基因的块茎特异表达。Plant Mol.Biol.，9，345-375。Winning，B.M.，Bourguignon，J.和Leaver，C.J.(1994)植物线粒体依赖于NAD+的苹果酸酶。CDNA克隆、推导的59kDa和62kDa亚基的一级结构、输入基因复杂性和表达分析。J.Biol.Chem.，269，4780-4786。
权利要求
1.产生淀粉的方法，包括下列步骤a)提供一种植物，对该植物进行遗传修饰，改变一个或多个在植物糖酵解和TCA循环中为中间体的代谢物的浓度，从而使该植物淀粉含量提高；并b)从该植物采集含淀粉材料。
2.按照权利要求1的方法，其中所述一个或多个代谢物包括来自苹果酸、草酰乙酸、磷酸(烯醇式)丙酮酸和3-磷酸甘油酸的一个或多个代谢物。
3.按照权利要求2的方法，其中所述一个或多个代谢物包括3-磷酸甘油酸。
4.按照权利要求1-3中任一项的方法，其中修饰该植物使该植物的一个或多个酶的活性提高或降低，从而改变所述一个或多个代谢物的浓度。
5.按照权利要求4的方法，其中所述一个或多个酶包括如图1A所示参与糖酵解或TCA循环的酶。
6.按照权利要求4或5的方法，其中降低NAD-苹果酸酶(NAD-ME)的活性。
7.按照权利要求4-6中任一项的方法，其中该植物是转基因植物，在该转基因植物中异源DNA序列的表达影响所述酶活性的提高或降低。
8.按照权利要求1-7中任一项的方法，其中该植物是淀粉储存植物。
9.按照权利要求8的方法，其中该植物淀粉储存组织中的淀粉含量优先提高。
10.经过遗传修饰的植物，由于改变了在该植物糖酵解和TCA循环中为中间体的一个或多个代谢物的浓度，该植物的产淀粉能力增强；条件是排除通过反义技术使NAD-ME活性降低的马铃薯植物。
11.按照权利要求7的经修饰植物，其中所述一个或多个代谢物包括来自苹果酸、草酰乙酸、磷酸(烯醇式)丙酮酸和3-磷酸甘油酸的一个或多个代谢物。
12.按照权利要求10或11的经修饰植物，其中所述一个或多个代谢物包括3-磷酸甘油酸。
13.按照权利要求9-12中任一项的经修饰植物，其中该植物经过修饰，以提高或降低该植物一个或多个酶的活性，从而改变所述一个或多个代谢物的浓度。
14.按照权利要求13的经修饰植物，其中所述一个或多个酶包括如图1A所示参与糖酵解或TCA循环的酶。
15.按照权利要求13或14的经修饰植物，其中NAD-ME的活性被降低。
16.按照权利要求13-15中任一项的经修饰植物，其中该植物是转基因植物，在该转基因植物中异源DNA序列的表达影响所述酶活性的提高或降低。
17.按照权利要求9-16中任一项的经修饰植物，其中该植物是淀粉储存植物。
18.按照权利要求9-17中任一项的经修饰植物，其中该植物淀粉储存组织中的产淀粉能力优先提高。
19.一种植物细胞，该植物细胞经过遗传修饰，以便能够再生成按照权利要求8-18中任一项的经修饰植物。
20.按照权利要求8-18中任一项的经修饰植物的用途，即用于产生含淀粉材料。
21.按照权利要求19的经修饰植物细胞的用途，即用于再生成产生含淀粉材料的植物。
22.淀粉储存植物在产生含淀粉材料中的用途，该植物经过遗传修饰，以便降低NAD-ME活性。
23.淀粉储存植物的植物细胞在再生成产生含淀粉材料的植物中的用途；所述细胞经过遗传转化，以便降低从该植物细胞再生的植物中的NAD-ME活性。
24.重组的双链DNA分子，含有在植物中发挥功能的启动子，该启动子能够在淀粉储存组织中优先作用，所述启动子与能够降低植物中NAD-ME活性的DNA序列操作性连接。
25.重组的双链DNA分子，含有在植物中发挥功能启动子，该启动子与能够降低植物中NAD-ME活性的DNA序列操作性连接；条件是所述DNA序列非来源于马铃薯植物。
26.按照权利要求24或25的重组DNA分子，其中所述能够降低NAD-ME活性的DNA序列包括以反义方向编码NAD-ME亚基的序列。
27.按照权利要求24或25的重组DNA分子，其中所述启动子在马铃薯的块茎中优先有活性。
28.按照权利要求27的重组DNA分子，其中所述启动子为patatin启动子或来自patatin启动子。
29.按照权利要求24-28中任一项的重组DNA分子，包含在适合转化植物细胞的载体中。
30.用按照任何权利要求24-29中任一项的重组DNA分子转化的植物细胞。
31.含有按照权利要求30的植物细胞的植物，其中NAD-ME活性在该植物的淀粉储存组织中优先降低。
全文摘要
公开了经过修饰的植物,由于改变了参与植物糖酶解和TCA循环的一个或多个代谢物的浓度,该植物的产淀粉能力增强。这种效应例如可通过遗传修饰来降低NAD－苹果酸酶的活性而达到。
文档编号C12N15/82GK1245535SQ9718149
公开日2000年2月23日 申请日期1997年11月27日 优先权日1996年11月27日
发明者C·J·勒维, S·A·希尔, H·L·詹纳, B·M·温灵 申请人:埃西斯创新有限公司