专利名称：新型肌醇六磷酸酶及编码该新型肌醇六磷酸酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种价格低廉，对于植酸有低的米氏常数(下文缩写为Km)的肌醇六磷酸酶，它可降解饲料中抗营养因子-植酸，由此提高饲料的营价值并可有效利用降解释放出的磷酸；本发明也涉及了编码此肌醇六磷酸酶的基因。
背景技术：
对于所有生物来说，磷是一种基本元素。用于喂养家畜的、植物来源的饲料中含有50-70％以植酸形式存在的磷。植酸是主要的贮存磷酸的物质，它大量存在于植物的种子之中。然而，在单胃动物如猪、鸡等，植酸不经过消化器官的消化和吸收就被排泄出来。也就是说，植酸是磷酸的贮存物质，然而其中的磷酸根本得不到利用。相应地，必需将磷酸加于单胃动物的饲料中以促进其生长。
饲料中添加的磷导致了排泄物中磷含量的增加。最近几年中，随着家畜饲养量的增加，动物的排泄物有很大的增加，由此导致了世界范围内的环境问题。特别是，排泄物中磷被认为是导致湖泊和沼泽中营养富集现象一个因素，因此排泄物中磷的量应受到调节，提出针对这一问题的措施迫在眉睫。
除了排泄物中磷这一问题，植酸能够螯合作为营养源的二价金属离子，如镁，钙，锌和铁，使得它难以被动物吸收而降低了饲料的营养价值。因此，植酸被认为是一种抗营养因子。
以前曾有人尝试通过用一种肌醇六磷酸酶处理饲料以降低排泄物中磷的含量，这种肌醇六磷酸酶能将一种植酸盐水解成肌醇和无机磷酸以利用植酸中释放出的磷酸而取代常规添加于饲料中的磷酸，也有人尝试通过降解抗营养因子植酸以提高饲料的营养价值[美国专利No.3297548(1967)；营养杂志101,1289-1294(1971)]。
已知的产生肌醇六磷酸酶的微生物包括细菌如枯草芽孢杆菌和假单孢菌属，酵母如啤酒糖酵母，丝状真菌如土曲霉(Aspergillusterreus),Aspergillus Ficcum和泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。
对于来源于Aspergillus Ficcum的肌醇六磷酸酶，其纯化及生化特征在[制备生物化学；18,443-458(1988)]中有所描述，其基因和氨基酸序列发表于[基因，127,87-94(1993)]。对于源自泡盛曲霉的肌醇六磷酸酶，其核苷酸序列和氨基酸序列在基因，133,55-62(1993)中有所描述。
迄今所知的肌醇六磷酸酶中，源于麸皮的肌醇六磷酸酶的米氏常数为0.57mM[农业生物化学26,794-803(1962)]，源于稻皮的肌醇六磷酸酶的Km值为0.17mM[农业生物化学53,1475-1483(1988)]，对于源于玉米(Zea mays)的肌醇六磷酸酶，其Km值为117mM，源于Aspergillus Ficcum的肌醇六磷酸酶Km值为250μM(WO91/05053)，米曲霉来源的肌醇六磷酸酶Km值为330μM，枯草芽孢杆菌来源的肌醇六磷酸酶Km值为150μM，源于纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)的肌醇六磷酸酶Km值为500μM，源于大肠杆菌的肌醇六磷酸酶Km值为130μM。
为了发挥某一种酶的作用，底物的浓度必须大于Km值，如果低Km值的与高Km值的酶具有相同的最大反应速率(Vmax)，与高Km值的酶相比，当底物浓度较低时，低Km值的酶反应速度不会降低。
也就是说，与高Km值的酶相比，低Km值的酶具有优势，因为即使底物浓度较低，也能达到最大反应速率，由此降低了剩余底物的量。
相应地，需要一种对于植酸有低的Km值，价格低廉的肌醇六磷酸酶，它可用于降解饲料中抗营养因子-植酸，由此提高饲料的营价值并可有效利用降解释放出的磷酸。
发明描述本文涉及一种肌醇六磷酸酶(下文称之为新型肌醇六磷酸酶)，当用植酸作底物时，其米氏常数为10-30μM，本发明也涉及了编码此肌醇六磷酸酶的DNA。包含有该DNA整合其中的重组DNA，携带该重组DNA的转化子，利用该转化子制备肌醇六磷酸酶的方法，一种利用该肌醇六磷酸酶制备的饲料。
以下将对本发明进行详细描述。
本发明新型肌醇六磷酸酶的特点包括一种具有下述下物理化学特性的肌醇六磷酸酶
<1>Km值10-30μM；<2>分子量(通过SDS-PAGE)用内切糖苷酶H处理后为60KDa；<3>最适pH值pH5.0-6.5；<4>最适温度45-65℃时，具最大活性<5>底物特异性可-作用的底物有，植酸，对硝基苯磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和ATP；及<6>等电聚焦pI4.7-5.4。
具有SEQ ID No.1或2所示氨基酸序列的一种肌醇六磷酸酶。
更进一步地，本发明包括一种新型肌醇六磷酸酶(如SEQ IDNO:3)所示，它的氨基酸序列在上述新型肌醇六磷酸酶上连接有分泌信号序列。
本发明进一步包括在SEQ ID No.1,2或3基础上替换、删除或添加一个或多个氨基酸所形成的氨基酸序列的一种肌醇六磷酸酶；它与SEQ ID NO:1,2或3的序列具有40％或更大的氨基酸序列同源性；当用植酸作为底物时，其米氏常数为10-30μM。优选地，该肌醇六磷酸酶具有60％或更大的同源性，更优选地，其同源性可达80％或更大。
氨基酸替换、删除或添加可根据下面杂志所述进行。核酸研究，10,6487(1982)，美国国家科学院院报79,6409(1982)美国国家科学院院报81,5662(1984)科学，224,1431(1984),PCTWO85/00817(1985)；自然，316,601(1985)，基因34,315(1985)，核酸研究，13,4431(1985)《现代分子生物学方法》，第八章，“克隆DNA的突变”John Wiley & Sons,Inc(1989)，等。
可以从任何产生此新型肌醇六磷酸酶的微生物中得到此酶。其中，优选的例子是属于曲霉属且具有产生该新型肌醇六磷酸酶能力的微生物，更优选的例子包括黑曲霉SK57(FERN BP-5473)或其突变株或由其衍生出的株系。黑曲霉SK92(FERN BP-5481)为源于黑曲霉SK57的突变株。
编码本发明的新型肌醇六磷酸酶的基因(后称之为新型肌醇六磷酸酶基因)可以是编码该新型肌醇六磷酸酶的任何基因例如，编码肌醇六磷酸酶的基因可具有SEQ ID NO:1,2或3的氨基酸序列的一个基因；或编码肌醇六磷酸酶的基因可具有SEQ ID NO:1,2或3的一个氨基酸序列，其中的一个或多个氨基酸替换、删除或添加，当用植酸作底物时，其米氏常数为10-30μM。此基因内可包含内含子。特别地，本发明的基因包含如SEQ ID NO:4所示的DNA，或SEQ ID NO:5所示的序列中包含内含子的DNA。
进一步地，本发明的新型肌醇六磷酸酶基因包括能够在严谨条件下与上述定义的DNA进行杂交，而且能够产生相应的肌醇六磷酸酶活性的DNA。
在此描述的术语“能够在严谨条件下杂交的DNA”指的是可用菌落杂交，噬斑杂交或Southern印迹杂交得到的DNA，其中包含于SEQID No.4或5的任何DNA序列可作为探针。其中的一个具体例子是通过将DNA与源于菌落或噬斑并固定于滤膜上的DNA在0.7-1.0M NaCl中于65℃杂交然后用65℃的0.1-2×SSC溶液洗膜(1×SSC溶液包含150mM氯化钠及15mM柠檬酸钠)。
杂交可受《分子克隆》实验手册中所描述的方法影响。《分子克隆》实验手册，第二版，Sambrook,Fritsch,Maniatis,Cold SpringHarbor laboratory Press(1989)(下文简写为“分子克隆，第二版”)。具体地，能够杂交的DNA包括与SEQ ID NO:4或5的序列有60％或更大，优选地，80％或更大，更优选地，95％或更大的同源性。
包含有新型肌醇六磷酸酶基因的DNA片段可以从具有产生此新型肌醇六磷酸酶能力的任何微生物中得到。尽管任何具有产生此新型肌醇六磷酸酶能力的微生物都可应用，优选的例子是属于曲霉属且具有产生该新型肌醇六磷酸酶能力的微生物，更优选的例子包括黑曲霉SK57或其突变株或由其衍生出的株系。黑曲霉SK92为源于黑曲霉SK57的突变株。
黑曲霉SK57和黑曲霉SK92分别在1996年3月22日和1996年3月12日以FERM BP-5473和FERM BP-5481保藏于国立生物科学和人类技术研究所，工业技术院，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，邮区305。
进一步地，本发明包括一种含有此新型肌醇六磷酸酶的动物饲料。
下文将描述从具有产生此新型肌醇六磷酸酶能力的微生物中获取编码该肌醇六磷酸酶基因的方法。
利用一种常规的DNA分离方法从具有产生该新型肌醇六磷酸酶能力的微生物中制备染色体DNA。例如，酚法[生物化学与生物物理学报72,619(1963)]，以合适的限制性内切酶切割得到的染色体DNA，将限制性内切酶切割得到的片段连入载体DNA从而构建来自这一微生物的基因组DNA文库。这个基因组DNA文库用以转化微生物宿主。用杂交的方法从上述转化子中筛选包含有新型肌醇六磷酸酶基因的转化子。从选择出的转化子中可得到包含目的基因的DNA。
上述一系列程序可依本领域已知的体外重组技术进行。(分子克隆，第二版)用以构建具有产生新型肌醇六磷酸酶能力的微生物基因组DNA文库的载体DNA可以是噬菌体载体，质粒载体等中的任何一种，它们可在大肠杆菌K12中自主复制。其中的例子包括，ZAP Express[策略5,58(1992)；Stratagene]；pBluescriptIISK(+)[核酸研究，17,9494(1989),Stratagene],λZapII(Stratagene),λgt10,λgt11[DNA克隆，实用方法1,49(1985)]LambdaBlueMid(Clonetech),λExCell(Pharmacia),pT7T318U(Pharmacia),pcD2[分子细胞生物学，3,280(1983)]和pUC18[基因，33,103(1985)]。
微生物宿主可以是埃希氏杆菌属的任一微生物，其中的例子包括大肠杆菌XL1-Blue MRF’[策略5,81(1992)；Stratagene]，大肠杆菌C600[遗传学，39,440(1954)]，大肠杆菌Y1088[科学，222,778(1985)]，大肠杆菌Y1090[科学，222,778(1985)]，大肠杆菌NM522[分子生物学杂志，166,1(1983)]，大肠杆菌K802[分子生物学杂志，16,118(1996)]，大肠杆菌JM105[基因，38,275(1985)]，大肠杆菌JM109，大肠杆菌XL1-Blue，大肠杆菌XL2-Blue，大肠杆菌DH1，大肠杆菌MC1000，等。
可通过杂交筛选携带有此新型肌醇六磷酸酶基因的转化子。
用于杂交的探针包括依新型肌醇六磷酸酶的一段氨基酸序列合成的寡核苷酸。如果已从与具有产生新型肌醇六磷酸酶能力的微生物密切相关的一群微生物中得到了另外一个肌醇六磷酸酶基因，则此基因在某些情况下可用作筛选此新型肌醇六磷酸酶的探针。可以在这种情况下用作探针的基因包括来自Aspergillus Ficcum的肌醇六磷酸酶基因。
源于Aspergillus Ficcum的肌醇六磷酸酶可用下列方法得到，首先用上述方法制备它的染色体DNA，然后用依据来自AspergillusFiccum的肌醇六磷酸酶基因DNA序列合成的DNA引物以PCR扩增它的肌醇六磷酸酶基因。
DNA引物可用硫代亚磷酸方法在常规DNA合成仪上合成，如一种DNA合成仪(Shimadzu Seisakusho,Japan)，也可用磷酰亚胺方法在DNA合成仪Model 392(Perkin Elmer)或380A型DNA合成仪(Applied Systems)上合成。用这种方法合成的引物包括SEQ ID NOS:6和7所示的DNA。
用杂交方法筛选到的转化子中包含新型肌醇六磷酸酶基因的DNA可以Sanger等发明的双脱氧法进行分析[美国国家科学院院报，74,5463(1977)]，借此此基因的序列得以测定。如果用自动测序仪如SQ-5500DNA测序仪(Hitachi)或373DNA测序仪[Perkin Elmer]测序时，基因序列分析将会受到影响。
用这种方法测定的新型肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列包括例如SEQ ID NO4或5的核苷酸序列。
至于其在宿主细胞中的表达，这样得到的新型肌醇六磷酸酶基因可以分子克隆，第二版或现代分子生物学方法增补1-34中描述的方法进行。
首先，以合适限制性内切酶或DNase切割包含有新型肌醇六磷酸酶基因的DNA片段以形成包含此新型肌醇六磷酸酶基因、大小合适的DNA片段，然后此DNA片段被插入到表达载体启动子下游的一段区域，随后将插有此DNA片段表达载体转化到与之相容的宿主细胞中。
只要能表达目的基因的宿主都可应用。其中包括埃希氏杆菌属，沙雷菌属，棒状杆菌属，短杆菌属，假单孢菌属，芽孢杆菌属，小微杆菌属等的原核细胞，曲霉属，根霉菌属，木霉属，链孢霉属，毛霉菌属，青霉属等的丝状真菌，克鲁维酵母菌属，糖酵母属，裂殖糖酵母属，丝孢酵母属及许旺氏酵母属的酵母菌；动物细胞及昆虫细胞。
使用的表达载体能够在宿主细胞内自主复制或能整合到宿主染色体内并且在一个位点具有启动子以转录该新型肌醇六磷酸酶基因。
若使用细菌这样的原核细胞作宿主，此新型肌醇六磷酸酶的表达载体应该在微生物中自主复制并且包含一个启动子，核糖体结合序列，此新型肌醇六磷酸酶基因及一个转录终止序列，此载体也可包括一个调节此启动子的基因。
表达载体包括pKK233-2(Pharmacia)；pSE280(Invitrogen)；pGEMEX-1(Promega)；pQE-8(Qiagen)；pKY10(JP-A-110600/1983)；pKYP200[农业生物化学，48,669(1984)],pLSA1[农业生物化学，53,277(1989)],pGEL1[美国国家科学院院报，82,4306(1985)],pBluescript(Stratagene),pTrs30[从大肠杆菌JM109/pTrs30(FERM BP-5407)制备而来]，pTrs32[从大肠杆菌JM109/pTrs32(FERMBP-5408)制备而来]，pGHA2[包含pGHA2的大肠杆菌以大肠杆菌IGHA2FERM BP-400保藏于国家生物技术和人类技术研究所，工业科学和技术院，日本；见JP-A-221091/1985],pGKA2[包含pGKA2的大肠杆菌以大肠杆菌IGKA2 FERM BP-6798保藏于国家生物技术和人类技术研究所，工业科学和技术院，日本；见JP-A-221091/1985],pTerm2(JP-A-22979/1991),USP 4686191,USP 4939094,USP5160735,pGEX(Pharmacia),pET系统(Novagen)和pSupex。
任何能够在象大肠杆菌这样宿主细胞中表达的启动子都可应用。其中的例子包括来自大肠杆菌，噬菌体等的启动子如trp启动子(Ptrp).lac启动子(Plac),PL启动子和PR启动子。进一步地，人工修饰的启动子也可应用，这样的例子包括Ptrpx2启动子(具有两个紧密相连的Ptrp启动子)，tac启动子，T7启动子，Plet启动子等。
如果一个质粒中SD序列和起始密码子之间的距离恰到好处地受到调节(如距离6-18个碱基)，则这个核糖体结合序列优先地被选用。
尽管任何编码新型肌醇六磷酸酶的基因可被用作新型肌醇六磷酸酶，其核苷酸可被优选地替换以使这个基因的DNA序列是微生物宿主表达的最适密码子。
尽管转录终止序列不是本发明的基因表达必须的，优选地，此转录终止序列应位于结构基因的下游紧接的一个密码子。
宿主包括埃希氏杆菌属，沙雷菌属，棒状杆菌属，短杆菌属，假单孢菌属，芽孢杆菌属等的微生物，例如大肠杆菌XL1-Blue大肠杆菌XL2-Blue，大肠杆菌DH1，大肠杆菌MC1000，大肠杆菌KY3276，大肠杆菌W1485，大肠杆菌JM109，大肠杆菌HB101，大肠杆菌NO49，大肠杆菌W3100，大肠杆菌NY49，枯草芽孢杆菌，淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines),Brevibacterium immariophilumATCC14068，解糖短杆菌(Brevibacterinm saccharolyticum),ATCC14066，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067，乳发醇短杆菌(Brevibacterium lactofermentum),ATCC13869，谷晏酯棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032，乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870和产氨棒杆菌(Microbacterium ammoniphilum)ATCC15354。
若用丝状真菌作为宿主，表达载体包括以下几种，p3SR2[基因，26,295-221(1983)],p KBY2[美国国家科学院院报，82,834-838(1985)],pSa123[农业生物化学，51,2549-2555(1987)],pSTA4[Mol,Gen.Geneti.218,99-104(1989)],pDJB2[基因，36,321-331(1989)]和pleu4[生物科学，生物技术，生物化学，56,1503-1504(1992)]。
只要在丝状真菌作为宿主时能够诱导表达的启动子都科应用。例如，可被淀粉或纤维素强烈诱导的启动子，如来自曲霉属的葡糖淀粉酶或α-淀粉酶的或来自木霉属的纤维素酶(纤维二糖水解酶)的启动子，糖酵解途径中的酶如磷酸甘油激酶(pgk)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)的启动子等。
尽管任何编码新型肌醇六磷酸酶的基因可被用作新型肌醇六磷酸酶基因，优选的例子是在该新型肌醇六磷酸酶末端连接了分泌信号序列肽的氨基酸序列编码的基因，这样的新型肌醇六磷酸酶可被分泌至微生物细胞外。具分泌信号序列肽包括来自曲霉属的葡糖淀粉酶或α-淀粉酶的分泌信号序列，或一段具有如SEQ ID NO:2的1-24位氨基酸序列。
宿主包括黑曲霉SK57，米曲霉M-2-3[农业生物化学，51,2549-2555(1987)],Aspergillus Ficcum NRRL3135,AspergillusNRRL3112，构巢霉IF04340,Trichoderma reesei Rut-C-30[应用微生物学和生物技术，20,46-53(1984)]，雪白根霉(Rhizopus niveus)M-37[生物科学，生物技术，生物化学，56,1503-1504(1992)]等。
丝状真菌的转化可以Gomi等的方法[农业生物化学，51,2549(1987)]进行。
如果酵母被用作宿主，则可用表达载体如YEp13(ATCC37115),YEp24(ATCC37051)和YCp50(ATCC37419)。
任何能够在象酵母这样宿主细胞中表达的启动子都可应用。其中的例子包括糖酵解途径中己糖激酶等基因的启动子，gal1启动子，gal10启动子，热休克蛋白启动子，MFα1启动子和CUP1启动子。
可包括宿主啤酒糖酵母，粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)，乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，茁芽丝孢酵母(Trichosporon Pullulans)，河岸许旺氏酵母(Schwanniomycesalluvius)等。
重组载体的导入可以将DNA导入酵母的任何方法进行，如电穿孔法[酶学方法194,182(1990)]，原生质球法[美国国家科学院院报，84,1929(1978)]，乙酸锂法[细菌学杂志153,163(1983)]等。
如果动物细胞用作宿主，可用作表达载体的有pAGE107[JP-A-22979/1991，细胞技术学，3,133(1990)],pAS3-3(JP-A-227075/1990),pCDM8[自然，329,840(1987)],pcDNAI/Amp(Invitrogen),pREP4(Invitrogen),pAGE103[生物化学杂志，101,1307(1987)]和pAGE210。
任何能够在动物细胞中表达的启动子都可应用。其中的例子包括巨细胞病毒启动子(HCMY)的IE(立即早期)基因的启动子，SV40早期启动子，金属硫蛋白的启动子。另外，源于人类巨细胞病毒立即早期启动子的增强子可与此启动子一起使用。
宿主细胞包括人类Namalwa细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢CHO细胞，HBT5673(JP-A-299/1988)等。
任何将DNA导入动物细胞的方法都可应用，如电穿孔法[细胞技术学，3,133(1990)]，磷酸钙法(JP-A-227075/1990)，脂质体法[美国国家科学院院报，84,7413(1987)]等。
转化子的制备和培养可依JP-A-227075/1990或JP-A-257891/1990中描述的方法进行。
如果昆虫细胞用作宿主，目的蛋白的基因可以如《杆状病毒表达载体实验室手册》，《现代分子生物学方法增补1-34》和生物/技术6,47(1988)中描述的方法进行表达。
即，将含有重组基因的载体与杆状病毒同时转入昆虫细胞；这样就可在培养上清中得到重组病毒，然后用重组病毒感染昆虫细胞，由此蛋白可得以表达。
在这种方法中使用的导入基因的载体包括如pLV1392,pVL1393和pBlueBacⅢ(它们都是Invitrogen公司的产品)。
可用感染某些蛾的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒作为杆状病毒。
可用秋粘虫的卵巢细胞sf9和sf21《杆状病毒表达载体实验室手册，W.H. Freeman and Company,New York(1992)》，粉纹夜蛾的卵巢细胞High5(Invitrogen)等作为昆虫细胞。
为了将含有重组基因的载体与杆状病毒同时转入昆虫细胞而制备重组病毒，可用磷酸钙法(JP-A-227075/1990)或脂质体法[美国国家科学院院报，84,7413(1987)]。
基因表达除了用直接表达的方法外，还可以根据《分子克隆，第二版》的描述，将基因以分泌方式或融合蛋白的方式进行表达。
用丝状真菌、酵母、动物细胞或昆虫细胞表达这个基因时，可以得到具有糖或碳氢链的多肽。
除上述转化子以外，具有产生新型肌醇六磷酸酶能力的微生物或具有更强的产生新型肌醇六磷酸酶能力的微生物的突变体皆可用于生产该新型肌醇六磷酸酶。
用常规的突变方法可获得具有更强的产生新型肌醇六磷酸酶能力的突变体。
为了制备该新型肌醇六磷酸酶，可以常规方法培养具有产生该新型肌醇六磷酸酶能力的微生物及其突变体以及携带有整合了新型肌醇六磷酸酶基因重组DNA的转化子以生产和积累该新型肌醇六磷酸酶，然后从培养基中收获该酶。这些微生物突变体及用于生产该新型肌醇六磷酸酶的转化子在下文称之为产生肌醇六磷酸酶的微生物。
如果产生新型肌醇六磷酸酶的微生物为原核生物如大肠杆菌或如丝状噬菌体或酵母，培养这些微生物的培养基为天然培养基或包含有可被微生物吸收的碳源、氮源、无机盐等的合成培养基，在这些培养基中，转化子可被有效地培养。
只要能够被微生物吸收，任何碳源都可被使用，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖浆一类的碳氢化合物；淀粉和淀粉水解物，乙酸和丙酸一类的有机酸，以及甲醇、乙醇、丙醇一类的醇类物质。
用作氮源的有氨、无机或有机氨盐如氯化氨、硫酸氨、乙酸铵和磷酸铵、以及其它的氮化合物；胨、肉汁(肉汤)；酵母提取物；谷物浸出液；珞蛋白水解液；豆饼及其水解液；多种发酵微生物及其消化产物。
培养基中所用的无机物质包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养丝状真菌的培养基以麸皮，稻皮做碳源，以适当形式的盐补充氮源和无机物。
在通气状况下用摇动培养或通气状况下浸没摇动培养。培养温度以15-40℃为佳，培养时间通常为16-96小时。培养过程中，pH值保持在3.0-9.0，培养真菌时，pH值保持在3.0-6.5为佳，用无机或有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等调节pH值。
培养过程中，可任选地向培养基中加入氨苄青霉素或四环素一类的抗生素。
如果转化了一种微生物的表达载体具有可诱导的启动子，微生物在培养过程中，可任选地向培养基中加入诱导物。例如，转化了具有lac启动子的表达载体的微生物，其培养基中应加入IPTG等，转化了具有trp启动子的表达载体的微生物，其培养基中应加入IAA等。
如果丝状真菌在含有麸皮一类的固体成分的培养基中培养时，先接种真菌，然后将真菌与固体成分混合均匀，随后将混合物以一薄层铺于铝盘或不绣钢盘上，将之置于培养箱中在可控温度、湿度和通气状况下在培养室中25-35℃静置培养3-10天。
如果产生新型肌醇六磷酸酶的为动物细胞，培养基通常为RPMI1640,Eagle’s MEM培养基或在该培养基中补充胎牛血清。
5％CO2存在的情况下进行培养。培养温度以35-37℃为佳，培养时间通常为3-7天。
培养过程中，可任选地向培养基中加入卡那霉素或青霉素一类的抗生素。
培养以昆虫细胞为宿主的转化子使用的培养基为正常培养基如TNM-FH培养基(Pharmigen)sf-900II SFM培养基(GibcoBRL)Excell400Excel1405培养基[皆来自JRH Biosciences]。
培养温度以25-35℃为佳，培养时间通常为1-4天。
培养过程中，可任选地向培养基中加入庆大霉素一类的抗生素。
可以用常规的分离/纯化酶的方法从产生新型肌醇六磷酸酶的微生物的培养基中分离和纯化新型肌醇六磷酸酶。
例如，如果新型肌醇六磷酸酶以可溶形式在产生该酶的微生物细胞中积累，则通过离心从培养物中收集细胞，然后以缓冲液洗涤细胞，用弗氏压碎器、manntongaurin匀浆器、dynomill等超声破碎细胞，由此产生无细胞抽提液。将无细胞抽提液离心留取上清，按常规的分离/纯化酶的方法进行操作溶剂萃取、硫酸铵盐析、有机溶剂沉淀脱盐，以如DEAE-Sepharose琼脂糖凝胶或DIAION HPA-75(Mitsubishi公司)树脂为基质进行离子交换层析，以S-SepharoseFF(pharmacia)树脂为基质进行离子交换层析，在丁基琼脂糖凝胶或苯基琼脂糖凝胶上进行疏水层析，用分子筛进行凝胶过滤，亲合层析，层析聚焦及等电聚焦一类的电泳，上述方法可以单独使用也可联合使用，由此可得到纯品。
如果此新型肌醇六磷酸酶在细胞中以不溶形式表达，则用相似的方法收集、粉碎，离心以得到含有该酶的沉淀部分，用多肽去污剂溶解不溶于水的新型肌醇六磷酸酶。然后稀释或透析得到的液体直至除掉去污剂或其量不致于使多肽变性，由此新型肌醇六磷酸酶恢复到天然构象。通过上述的分离/纯化方法可得到纯品。如果该新型肌醇六磷酸酶被分泌到细胞外，则离心培养物并保留上清可溶部分。若培养基中有麸皮一类的固体成分，则先用温水等提取新型肌醇六磷酸酶，然后离心并保留上清可溶部分。用上述从无细胞提取液中分离和纯化方法，可得到该新型肌醇六磷酸酶纯品。
用下述标准分析方法可确定该新型肌醇六磷酸酶的活性。
将0.5ml含2.5mM植酸钠(Sigma)的pH5.5(乙酸钠)的0.2M乙酸缓冲液在37℃放置5分钟，然后将0.5ml的酶液加入其中以起始反应。37℃放置10分钟，将2ml酶反应终止液(如10mM∶5N硫酸∶丙酮为1∶1∶2的混合物)加入其中以终止反应，然后再加入0.1ml 1M的柠檬酸钠并混匀。在分光光度计(Hitachi U-2000)上380nm读取该溶液的吸值。肌醇六磷酸酶活性单位定义为pH5.5,37℃时1分钟内释放1μM的无机磷酸所需要的酶量。
该新型肌醇六磷酸酶的Km值可通过Lineweaver-Burk图来确定，Lineweaver-Burk图是通过标准分析方法测得的新型肌醇六磷酸酶的活性对不同的底物浓度绘制的。
本发明的肌醇六磷酸酶可用于需要将植酸盐转化为肌醇集合无机磷酸的多种过程。
例如，本酶可用于动物饲料，大豆加工，猪和家禽的液体饲料及从植酸盐制备肌醇或肌醇(单)磷酸。
下面是这类动物饲料的一例。
本发明的新型肌醇六磷酸酶与麦壳一类的携带物混合后在喷洒塔或流化床上干燥。干燥后，将渗透压稳定剂如山梨醇和防腐剂如苯甲酸加入其中形成一种动物饲料。在此动物饲料中新型肌醇六磷酸酶的量为10-5000单位。每Kg动物饲料中含100-1000单位该酶为佳。
附图简述
图1展示了源自黑曲霉SK52的肌醇六磷酸酶基因的限制性酶切图谱，其中箭头指示肌醇六磷酸酶编码区域。
图2展示了质粒pANPHY1的限制性酶切图谱，其中“肌醇六磷酸酶”代表一个新型肌醇六磷酸酶基因，“Amp”指代来自pUC118的氨苄青霉素抗性基因，箭头指示了该基因的转录和翻译方向。
图3展示了用SDS-PAGE测定新型肌醇六磷酸酶的分子量。
图4展示了通过测定新型肌醇六磷酸酶的分子量得到的标准曲线。
图5展示了新型肌醇六磷酸酶的最适pH值，每一个值处的活性为相对活性(％)，将最大酶活性处的值定为100％。
图6展示了新型肌醇六磷酸酶的酸碱稳定性。
图7展示了新型肌醇六磷酸酶的最适温度。每一个温度处的活性为相对活性(％)，将最大酶活性处的温度定为100％。
图8展示了新型肌醇六磷酸酶的热稳定性。每一个温度处的活性为相对活性(％)，4℃时活性定为100％。
图9展示了新型肌醇六磷酸酶在等电聚焦时的等电点。
在pH7.0或更大时，此酶无活性。执行本发明的最佳模式实施例1制备编码新型肌醇六磷酸酶的染色体DNA1、制备黑曲霉SK57将100ml麦芽汁培养基(2％麦芽汁提取液，2％葡萄糖，0.1％蛋白胨)放入具有阻板的500ml三角瓶中，用硅海绵瓶塞封口，120℃灭菌20分钟。
将SK57接种于此培养基中，28℃摇动培养7天。
用灭菌的玻璃滤器过滤培养物得到0.5g SK57。2、从微生物中分离和纯化总DNA将从实施例1-1中得到的SK57置于纸间并压挤之以除去水分，然后将微生物置于冷却至-80℃的研钵中，向其中加入液氮使之冷冻，用冷却至-80℃的研杵将之磨细。
将上述磨细的微生物置入一离心管中并入0.2ml TE缓冲液[10mMTris-HCl(pH8.0),1mM EDTA]并悬浮之。往上述悬浮液中加入0.2ml裂解缓冲液[2％SDS,0.1M NaCl,10mM EDTA,50mM Tris-HCl(pH7.0)]以裂解微生物。裂解液在4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟后，将上清移入一个新的离心管中。
将0.4ml酚溶液(即，酚氯仿异戊醇25∶24∶1的混合液)加入上述上清中，轻轻摇动试管并在4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟后，将上清移入一个新的离心管中。将此过程重复3次，上清移入一个新的离心管中。
向上述上清中加入1ml冷的乙醇，-80℃放置10分钟，4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟，由此可得到沉淀物(DNA)。
真空干燥沉淀并将之溶于0.5ml TE缓冲液中。
向上述溶液中加入5μl RNase(10mg/ml)，37℃放置30分钟。
向上述处理溶液中加入0.5ml酚溶液，缓慢摇动混合物，15000rpm(18500×g)离心10分钟，将上清移入一个新的离心管中，将此过程重复2次，上清移入一个新的离心管中。
将0.5ml氯仿溶液(即，氯仿∶异戊醇24∶1的混合液)加入上述上清中，4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟后，将上清移入一个新的离心管中以回收沉淀物(DNA)。
向上述上清中加入50μl NaCl及1ml冷的乙醇，-80℃放置10分钟，4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟，由此可得到沉淀物(DNA)。用0.5ml 70％的乙醇进一步洗涤沉淀并在4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟以收集沉淀物(DNA)。真空干燥沉淀后会得到大约5ug纯基因组DNA。3、探针制备可用来自Aspergillus ficcum NRRL3135[来自北部地区研究中心，农业Peoria联邦部，Illinois美国NRRL]的基因作为探针检测来自黑曲霉SK57的肌醇六磷酸酶克隆。
以实施例1-1和1-2描述的方法制备NRRL3135的总DNA。
为了从NRRL3135中扩增肌醇六磷酸酶的结构基因，正义和反义引物分别为SEQ ID NO:6和NO:7，它们是在380ADNA合成仪(AppliedBiosystems)上合成的。用100μl包含正义引物、反义引物及反义引物基因DNA的混合物以PCR方法扩增肌醇六磷酸酶的结构基因。按下列反应步骤进行PCR，每循环中，92℃1分钟，45℃2分钟，72℃3分钟，总共25个循环。
先用限制性内切酶EcoRⅠ切割pUC118，将一段EcoRⅠ处理过的用PCR扩增到的肌醇六磷酸酶的结构基因通过连接试剂盒(Taraka Shuzo,Japan)连入pUC118 EcoRⅠ位点。
有肌醇六磷酸酶的结构基因片段插入的质粒转化大肠杆菌JM109(Taraka Shuzo)。
将大肠杆菌转化子在含有50mg/ml氨苄青霉素钠的LB培养基中(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)37℃培养一天。
从培养物中提取质粒，然后用EcoRⅠ消化质粒以回收1.7Kb的DNA片段。
此1.7Kb的DNA片段用作探针。4、Southern杂交将12U的限制性内切酶XbaⅠ(Takara Shuzo)加入到20ug SK57基因组DNA中，37℃作用12小时以切割DNA。琼脂糖凝胶电泳分离此DNA。按照ECL试剂盒(Amersham)说明书以实施例1-3得到的探针进行Southern杂交。
琼脂糖凝胶电泳后，DNA在0.4N的氢氧化钠溶液中通过毛细作用转印到Hybond-N+膜上(Amersham)，空气干燥此膜。将膜于42℃在10杂交缓冲液中
浸泡1小时，此杂交缓冲也包含在直接ECL核酸标记和检测系统中(Amersham)，然后向浸泡有转印了DNA的膜的杂交液中加入30μl探针溶液[制备方法，将7μl无菌水加入到3μl实施1-3中得到的探针中，95℃作用5分钟，然后冰上放置5分钟，再向上述溶液中加入10μl标记溶液和10μl戊二醛溶液，将混合物在37℃放置10分钟]，42℃摇动过夜。
用100ml初级洗液[6M尿素，0.4％S DS,0.5×SSC(1×SSC,150mM氯化钠及15mM柠檬酸钠)]在42℃洗膜20分钟。然后，用100ml次级洗液
在55℃洗膜2此，每次10分钟，随后，用100ml 2×SSC在室温下洗膜2次，每此5分钟。
洗涤后的膜空气干燥1分钟，然后将之浸入7ml的显色剂中1分钟，迅速将之包于Saran纸中。然后将膜置于一个X-光片夹中X-光片(Fuju,Japan)室温下曝光5分钟。
与探针杂交信号强的DNA片段约4.6Kb。5、黑曲霉SK57染色体DNA制备将12U的限制性内切酶XbaⅠ加入到10ug黑曲霉SK57基因组DNA中，37℃作用12小时以切割DNA，随后将之进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。电泳后，从胶上切下约的DNA片段，用Geneclean(BI0101)可得到约100ng的DNA片段。
在另一反应中，将12 U XbaⅠ加入到约200ng大肠杆菌载体pUC118中(Takara Shuzo)并在37℃作用1小时以切割pUC118。
将1U碱性磷酸酶加入到上述处理过的溶液中，37℃作用30分钟，加入20μl酚处理液至反应混合物中，轻轻摇动，4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟后，将上清移入一个新的离心管中。重复此过程两遍，将上清移入一个新的离心管中。
向上清中加入2μl 3M乙酸钠及50μl冷乙醇，-80℃放置10分钟，4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟以回收沉淀物。
真空干燥沉淀并将之溶于10l TE缓冲液中以获得切割后的片段。
上述方法制备的约4.6Kb的DNA片断通过T4DNA连接酶(TakaraShuzo)连入到切割后片段的切点处，由此产生了具有黑曲霉SK57染色体DNA片段的质粒。
用常规方法将此质粒转化大肠杆菌JM109(Taraka Shuzo)。
转化大肠杆菌在含有50mg/ml氨苄青霉素钠的LB培养基中在37℃培养一天。为了制备一个复制物，转化子进一步在含有50ug/ml氨苄青霉素钠的LB培养基(通过在LB培养基中加入2％的琼脂制备)中在37℃培养一天。在培养基上生长的克隆用作SK57染色体DNA文库。6、从染色体DNA文库中分离含目的DNA的克隆为了从实施例1-5制备的文库中筛选具有新型肌醇六磷酸酶基因的克隆，文库中的克隆被转移至滤膜上并且利用ECL试剂盒(Amersham)，以实施例1-3制备的探针通过克隆杂交方法进行筛选。几千个克隆用于杂交以分离阳性克隆。7、限制性酶切图谱的制备及测序用常规方法提取实施例1-6中得到的阳性克隆的质粒。此质粒被命名为pANPHY1。用多种限制性酶切割质pANPHY1并进行琼脂糖凝胶电泳，依据片段大小，得到了一个由XbaⅠ处理来自SK57染色体DNA插入片段的限制性酶切图谱(图1)，此插入片段大小为4.6Kb。
用多种限制性酶切割质粒pANPHY1，然后进行琼脂糖凝胶电泳，将其转移至尼龙膜上。用ECL试剂盒以实施例1-3中得到的探针进行Sourhern杂交。插入片段的中间部位与探针杂交。pANPHY1的限制性酶切图谱及新型肌醇六磷酸酶的编码区示于图2。
插入到pANPHY1的新型肌醇六磷酸酶基因全核苷酸序列通过双脱氧链终止法测定。此核苷酸序列示于SEQ ID NO:4。实施例2编码新型肌醇六磷酸酶DNA的内含子分析从实施例中获得的编码新型肌醇六磷酸酶的染色体DNA内的内含子的分析是通过下述方法从黑曲霉SK57中获得肌醇六磷酸酶cDNA中来进行的。1、黑曲霉SK57的培养此培养基以察氏培养基为基础，在50mM MES缓冲液含有0.05％硫酸镁，0.01％硫酸亚铁，0.05％氯化钾，0.2％硝酸钠，1％葡萄糖及谷物浸出液(Sanei Toka,Japan)。将此培养基以100ml/瓶等分到具有阻板的500ml三角瓶中，高压蒸汽灭菌(120℃,20分钟)。灭菌后，将斜面上的一铂环SK-5接种于培养基中，28℃,200rpm振荡培养5天。用吸力使培养物通过玻璃滤器以收获微生物并快速将之冻存于液氮中以抑制RNase的活性。在使用前此生物一直保存于-80℃。2、RNA的提取边快速研磨1g实施例1-1中得到的冰冻微生物边向其中加入液氮。将获得的粉末加入到50℃的10ml ISOGEN提取液(Nippon Gene)中并激烈振荡30秒。
上述溶液在50℃放置10分钟并以1ml/管分到Eppendorf管中。
向每一份液体中加入200μl氯仿，然后摇动之，并在4℃以15000rpm(18500×g)离心10分钟后，收集上层水相。
将500μl 4M氯化锂加入水相，混匀，-80℃放置1小时。并在4℃以15000rpm(18500×g)离心15分钟，获得的沉淀物溶于0.4ml无RNase的灭菌水中(此后简称为无PNase水)。
向上述溶液加入0.4ml异丙醇，4℃放置30℃,4℃以15000rpm(18500×g)离心15分钟，回收沉淀物。
以75％乙醇洗涤沉淀，然后在真空离心机中干燥之，并将其溶于0.4ml RNase水中。
将1ml乙醇加入上述乙醇，然后离心并再次回收沉淀物。
将75％乙醇洗涤沉淀并将之溶于无RNase水中，总体积为0.4ml，此溶液可用作RNA样品。3、用RT-PCR括增肌醇六磷酸酶cDNA用RT-PCR试剂盒(Toyobo)扩增肌醇六磷酸酶cDNA。
<1>反转录反应将1ug实施例2-2中得到的RNA样品置于一个Eppendorf管中，以无RNAse水将溶液补至10ul。
将RT-PCR试剂盒(Toyobo)中的4μl 5×RTase缓冲液，1μl随机引物，1μl RNase抑制剂及2μl RTase加到上述溶液中，然后在PJ2000热循环仪上(Perkin Elmer)30℃反应10分钟，42℃反应20分钟，99℃反应5分钟，4℃反应5分钟。
<2>PCR将RT-PCR试剂盒(Toyobo)中的10μl Plus缓冲液，68μl灭菌水，0.5μl正义引物、0.5μl反义引物及1μl rTaq DNA多聚酶加入到实施例2-1的20μl反应液中，最后的总体积为100μl。肌醇六磷酸酶cDNA的扩增在下列条件下进行；每个循环中，94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒，总共35个循环。
反应结束后，将10μl氯仿∶异戊醇(24∶1)混合物加入反应体系，振荡，然后15000RPM离心5分钟以回收上清作为cDNA样品。
此cDNA样品用于cDNA分析，结果，在SEQ ID NO:4的碱基序列(44-155位置)发现一个内含子。此序列编码SEQ ID NO 2的氨基酸序列。从下面描述的纯化的新型肌醇六磷酸酶的氨基酸(SEQ ID NO 1)中可以发现，从N末端至第24位的氨基酸相当于分泌信号肽。实施例3表达新型肌醇六磷酸酶DNA的转化子的制备表达新型肌醇六磷酸酶的转化子以黑曲霉SK57，构巢曲霉MD-4和米曲霉M-23作为宿主的。
宿主(黑曲霉SK57，构巢曲霉MD-4和米曲霉M-23)在DPY培养基中(2％糊精，1％蛋白胨，5％酵母提取物，0.5％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2OpH5.5)30℃振荡培养2-3天。用3G1玻璃滤器收集生长的微生物并用灭菌水洗涤之。
将洗涤后的微生物加入到10ml原生质体制备液中[5mg/mlNovozyme234,5mg/ml纤维素酶R-10,0.8M NaCl,10mM磷酸缓冲液(pH6.0)]并在30℃轻轻震荡3小时。未被裂解的菌丝通过3G3玻璃滤器除掉，获得的滤液则以700×g(2000rpm)离心以获得原生质体。
0.8M NaCl洗涤两次原生质体，以溶液Ⅰ
洗涤一次，然后将其溶于4/5体积的溶液Ⅰ中，最终浓度为2.5×108/ml。向悬浮液中加入1/5体积的溶液Ⅱ[40％(w/v)PEG4000,50mM Tris-HCl(pH7.5)]，由此制备了用于转化的原生质体悬液。
在使用黑曲霉SK57和构巢曲霉MD-4的原生质体悬液时，向0.2ml原生质体悬液中加入20μl质粒pANPHY1，或质粒pANPHY1和p3SR2各10μl，混合液在冰上放置30分钟，随后加入1ml溶液Ⅱ并在室温下放置20分钟。然后，加入10ml溶液Ⅰ并在700×g离心5分钟以得到沉淀部分。将沉淀部分悬浮于0.2ml溶液Ⅰ。将悬液涂到含0.8MNaCl的CD板培养基上(1％蔗糖，10mM乙酰胺，0.1％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2O,0.05％KCl,)，随后将含0.5％琼脂的培养基覆于其上，30℃培养5-10天。
在使用米曲霉M-23的原生质体悬液时，向0.2ml原生质体悬液中加入质粒pANPHY1和pSa123各10μl，混合液在冰上放置30分钟，随后加入1ml溶液Ⅱ并在室温下放置20分钟。然后，加入10ml溶液Ⅰ并在700×g离心5分钟以得到沉淀部分。将沉淀部分悬浮于0.2ml溶液Ⅰ。将悬液涂到基本培养基上板上(1％蔗糖，0.3％NaNO3,0.1％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2O,0.05％KCl,pH5.5)，随后将含0.5％琼脂的培养基覆于其上，30℃培养5-10天。
培养过程中，将生长良好的株系选作转化子，测定每一转化子的肌醇六磷酸酶的活性，得到了具有高活性的黑曲霉MH-PA1，构巢曲霉M-pA1及米曲霉MO-PG3。黑曲霉MH-PA1，构巢曲霉M-PA1分别在1996年1月25日以FERM BP-5372和FERM BP-5373贮存于国家生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术院，日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号，邮区305。实施例4由转化子生产肌醇六磷酸酶<1>由黑曲霉MH-PA1生产肌醇六磷酸酶将10g麸皮加入到一个500ml的三角瓶中并用棉塞封瓶口，在120℃灭菌20分钟，然后向其中加入8ml灭菌水。在此培养基中接种MH-PA1菌株，摇动三角瓶使MH-PA1菌株与麸皮完全混合，30℃静置培养4-5天。
向上述三角瓶中加入100ml 37℃的灭菌水，并将之在37℃放置1-2小时，然后，用2号滤纸将液相与固相分开，由此可得到560U的新型肌醇六磷酸酶。由MH-PA1产生的新型肌醇六磷酸酶比实施例6-1中SK57产生的新型肌醇六磷酸酶高2.4倍。<2>由构巢曲霉M-PA1生产肌醇六磷酸酶将10ml肌醇六磷酸酶生产培养基(1％蔗糖，0.2％NaNO3,0.05％MgSO4.7H2O,0.05％KCl,0.001％FeSO4.7H2O,0.1％C.S.L pH 5.5)加入到100ml的三角瓶中，用硅塞封瓶口在120℃灭菌30分钟，将M-PA1接种到此培养基中，30℃摇动培养4-5天。
转化子M-PA1产生90mU肌醇六磷酸酶，它是在同样条件下构巢曲霉MD-4产生的肌醇六磷酸酶的18倍，后者为5mU。<3>由米曲霉MO-PG3生产肌醇六磷酸酶将500ml肌醇六磷酸酶产生培养基置于一个2L的三角瓶中，用硅塞封瓶口在120℃灭菌20分钟。将MO-PG3接种到此培养基中，30℃摇动培养4-5天。
转化子MO-PG3产生370mU/ml肌醇六磷酸酶，它是在同样条件下米曲霉M-23产生的肌醇六磷酸酶的29倍，后者为13MU/ML。实施例5由黑曲霉SK57制备高产新型肌醇六磷酸酶的黑曲霉SK92在基础培养基[2％蔗糖，0.3％亚硝酸钠，0.05％氯化钾，0.05％硫酸镁，2％琼脂，pH5.5]上培养黑曲霉SK57使其产生孢子。将这些孢子悬浮在灭菌水中。悬浮液的终浓度为107孢子/ml灭菌水，10ml这样的悬浮液用于突变。以99％致死量的UV-射线或γ-射线照射孢子悬液。用这种突变方法得到了一肌醇六磷酸酶高表达株。此菌株又通过了7次突变，得到了高表达新型肌醇六磷酸酶的黑曲霉SK92。实施例6由黑曲霉SK57和黑曲霉SK92生产新型肌醇六磷酸酶<1>由SK57和SK92生产新型肌醇六磷酸酶将10g麸皮加入到一个500ml的三角瓶中，用棉塞封瓶口并在120℃高压20分钟，然后向瓶中加入8ml灭菌水。将SK57或SK92接种于此培养基中，摇动三角瓶以使菌丝与麸皮完全混匀。
将100ml 37℃的水置于上述三角瓶中，并将之在37℃放置1-2小时，随后，用2号滤纸将液相与固相分开。
通过此过程，SK57生产230U新型肌醇六磷酸酶而SK92产生1000U新型肌醇六磷酸酶。
SK92产生新型肌醇酶的量比SK57高4.5倍。<2>由SK57和SK92生产新型肌醇六磷酸酶原来在纯培养基上生长的SK57被接种到120℃高压30分钟的750g麸皮中，在混合器中将菌丝与麸皮混匀。
将混合物到在铝盘上(600×1000mm)，每盘为5Kg，将SK57在100％湿度，30℃培养5天。
培养物转移至抽提液中并喷洒18吨温水。将肌醇六磷酸酶抽提液回收至一个25吨的罐。将抽提液转移至真空浓缩罐(Nippon ShinkuK.K.)在真空作用下将抽提液浓缩2-3倍，并向其中加入3.5吨95％冷乙醇。用压力滤器将由此产生的不纯固体成分除掉。
用无菌滤器(0.45μM,Nippon Rosuiki K.K.)过滤上述得到的滤液，并将3.5吨95％冷乙醇加入到滤液中以分离新型肌醇六磷酸酶。沉淀分离肌醇六磷酸酶，得到3吨包含新型肌醇六磷酸酶的沉淀。
在沉淀中加入8吨95％的冷乙醇，脱水后，分离到的肌醇六磷酸酶被沉淀，由此得到3吨包含新型肌醇六磷酸酶的沉淀。将脱水和沉淀过程重复2-3次，沉淀经真空干燥后，得到1.5×108肌醇六磷酸酶粗制品。实施例7新型肌醇六磷酸酶的纯化<1>纯化由黑曲霉SK57产生的新型肌醇六磷酸酶将实施例6-2中得到的10g肌醇六磷酸酶粗制品溶于50ml乙酸缓冲液A[50mM乙酸/50mM乙酸钠(pH5.5)]并用一种超滤膜脱盐(除掉分子量10000以下的物质Sartrius)。得到的酶液上样于用乙酸缓冲液A平衡过的DIAIONPA-75[Mitsubishi]柱上(5.6×30cm)，用乙酸缓冲液A洗柱后，以含0.3MNaCl乙酸缓冲液B[50mM乙酸/50mM乙酸钠(pH4.8)]洗脱新型肌醇六磷酸酶。用超滤膜脱盐(除掉分子量10000以下的物质Advantec)将洗脱部分浓缩20倍，然后上样于用乙酸缓冲液C[50mM乙酸/50mM乙酸钠(pH4.9)]平衡过的S-Sepharose FF(2.5×30cm Pharmacia)柱上。用乙酸缓冲液C洗涤后，以乙酸缓冲液D[50mM乙酸/50mM乙酸钠(pH5.2)]洗脱蛋白以得到新型肌醇六磷酸酶。用超滤膜(除掉分子量10000以下的物质Advantec)将洗脱部分浓缩20倍，然后上样于用乙酸缓冲液E[50mM乙酸/50mM乙酸钠(pH4.5)]平衡过的Toyopearl HW-55F(Toso)柱上。新型肌醇六磷酸酶以乙酸缓冲液E洗脱。将洗脱部分上样于用25mM组氨酸-盐酸缓冲液pH5.8(Pharmacia)平衡过的mono-PHR5/20柱(Pharmacia)，然后以10％Polybuffer74-HCl,pH4.2(Pharmacia)洗脱新型肌醇六磷酸酶。
经过上述步骤，新型肌醇六磷酸酶被纯化到特异性为158U/mg。<2>纯化由黑曲霉NH-PA1及构巢曲霉M-PA1产生的新型肌醇六磷酸酶根据实施例6-1描述的方法培养MH-PA1和M-PA1，分别用2号滤纸从其培养物中分离液体部分(新型肌醇六磷酸酶粗提液)。
向每一新型肌醇六磷酸酶粗提液加入50ml乙酸缓冲液A(pH5.5)并用一种超滤膜脱盐(除掉分子量10000以下的物质Advantec)。
将脱盐酶液上样于用乙酸缓冲液A平衡过的DIAIONPA-75柱上(5.6×30cm)，用乙酸缓冲液A洗柱后，以含0.3 M NaCl乙酸缓冲液B[50mM乙酸/50mM乙酸钠(pH4.8)]洗脱新型肌醇六磷酸酶。
洗脱部分超滤膜脱盐(除掉分子量10000以下的物质Advantec)浓缩然后透析。得到的酶液上样于用50mM乙酸缓冲液E[50mM乙酸/50mN乙酸钠(pH4.5)]平衡过的Toyopearl HW-55F(Toso)柱上。新型肌醇六磷酸酶以乙酸缓冲液E洗脱。
经过上述步骤，由黑曲霉MH-PA1及构巢曲霉M-PA1产生新型肌醇六磷酸酶得以纯化。<3>纯化由米曲霉MO-PG3产生的新型肌醇六磷酸酶通过离心除掉实施例4-3培养物中的微生物，得到的上清用作酶粗提液。
向酶粗提液加入50mM乙酸缓冲液A(pH5.5)并用一种超滤膜脱盐(除掉分子量10000以下的物质Advantec)。
将脱盐酶液上样于用乙酸缓冲液A平衡过的DIAIONPA-75柱上(5.6×30cm)，用乙酸缓冲液A洗柱后，以含0.3MNaCl乙酸缓冲液B[50mM乙酸/50mM乙酸钠(pH4.8)]洗脱新型肌醇六磷酸酶。
洗脱部分超滤膜脱盐(除掉分子量10000以下的物质Advantec)浓缩然后透析。得到的酶液上样于用50mM乙酸缓冲液E[50mM乙酸/50mM乙酸钠(pH4.5)]平衡过的Toyopearl HW-55F(Toso)柱上。然后以乙酸缓冲液E洗脱新型肌醇六磷酸酶。
经过上述步骤，由米曲霉MO-PG3产生的新型肌醇六磷酸酶得以纯化。实施例8新型肌醇六磷酸酶的物理化学特性在实施例7-1-7-3中得到的新型肌醇六磷酸酶的物理化学特性如下。<1>Km值活性测定按标准分析方法进行，其中底物浓度变化范围为0.00625-1.25mM。结果做成Lineweave-Burk图以确定Km值。
来自黑曲霉SK57，黑曲霉MH-PA1，构巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶的Km值分别为13,30,20和28μM。
在同样条件确定来自Aspergillus ficcum NRRL3135的肌醇六磷酸酶Km值为197μM，因此本发明的新型肌醇六磷酸酶的Km值比已知肌醇六磷酸酶的Km值低一个数量级。<2>分子量(通过SDS-PAGE)向实施例7-1-7-3中得到的每一新型肌醇六磷酸酶40ml样品中加入10ml加样缓冲液(4％2-巯基乙醇，80％甘油，4％SDS，40mM Tris-HCl缓冲液，pH6.8)，将混合物煮沸分钟，在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上用AE-6200(Atoh)型电泳仪进行电泳。以考马斯亮兰G250染蛋白。进一步，用内切糖苷酶H处理每一样品而去掉碳氢链后，也以同样的方式进行电泳。
图3展示了来自黑曲霉SK57的新型肌醇六磷酸酶的SDS-PAGE电泳结果。根据SDS-PAGE，来自黑曲霉SK57或MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶的分子量为60KDa。用内切糖苷酶H处理每一样品而去掉碳氢链后，这些新型肌醇六磷酸酶的分子量几乎没有改变。由SEQ ID No.1或2所示的氨基酸序列推断的分子量为50KDa，与SDS-PAGE测定的分子量是一致的。
由SDS-PAGE测定的来自构巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶的分子量展示于图4。经测定，来自两菌株的新型肌醇六磷酸酶的分子量为90-100KDa。因为这些新型肌醇六磷酸酶经内切糖苷酶H处理后，其分子量(60KDa)与来自黑曲霉SK57或MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶的分子量相同，所以认为自构巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶具有碳氢链。<3>最适pH值按标准分析方法测定活性，其中用下列0.2M缓冲液改变pH值。pH 2-4甘氨酸/盐酸缓冲液pH 4-5.5乙氨酸/乙酸钠缓冲液pH 5.5-7:MES缓冲液(Good缓冲液)pH 7-8:MOPS缓冲液(Good缓冲液)pH 8-9:Tris-HCl缓冲液结果展示于图5。本发明的新型肌醇六磷酸酶在pH5.0-6.5表现出最大活性。在pH7.0或更大时，此酶无活性。<4>pH稳定性将2.1mg/ml新型肌醇六磷酸酶在下列100M缓冲液于37℃放置60分钟，按标准分析方法测定其活性。pH 2-4甘氨酸/盐酸缓冲液pH 4-5.5乙氨酸/乙酸钠缓冲液pH 5.5-7:MES缓冲液(Good缓冲液)pH 7-8:MOPS缓冲液(Good缓冲液)pH 8-9:Tris-HCl缓冲液结果展示于图6。
来自黑曲霉SK57和MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶在pH4.5-7.5中具有60％或更高的活性。
来自构巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶在pH8或低于pH8，具有70％或更高活性。<5>最适温度其活性通过标准分析方法在0-70℃的反应温度范围内测定。结果展示于图7。本发明的新型肌醇六磷酸酶在45-65℃具有最大其活性。<6>温度稳定性酶液以2.1mg/ml的蛋白浓度在100M乙氨酸/乙酸钠缓冲液(pH5.5)中于0-60℃放置60分钟，按标准分析方法测定其活性。
结果展示于图8。
来自黑曲霉SK57和MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶在30℃或30℃以下中具有70％或更高的相对活性。
来自构巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶在高至50℃时仍稳定，在高于50℃时，其渐渐失活。因为来自构巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶具有如实施例8-1所示的碳氢链人们认为它们比来自黑曲霉SK57和MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶具有更高的热稳定性。<7>底物特异性其活性通过标准分析方法进行，其中底物浓度为1mM和10mM。
来自黑曲霉SK57的新型肌醇六磷酸酶的测定结果列于表1。此新型肌醇六磷酸酶对于表1的底物具有低的特异性，它对植酸以外的底物活性也较低。来自其他株系的新型肌醇六磷酸酶具有相同的结果。
表1
<8>等电聚焦等电聚焦以AE-3230型电泳仪(Atoh)在3％聚丙烯酰胺凝胶(Ampholine pH3.5-10.0)上进行。
来自黑曲霉SK57的新型肌醇六磷酸酶的结果示于图9。新型肌醇六磷酸酶的等电点(PI)在pH4.7-5.4。
工业应用根据本发明，它可提供一种对于植酸有低的，价格低廉的肌醇六磷酸酶，编码此肌醇六磷酸酶的DNA，具有该DNA的重组DNA，携带该重组DNA的转化子，利用该转化子制备肌醇六磷酸酶的方法。该肌醇六磷酸酶可用于饲料以降解饲料中抗营养因子-植酸，由此提高饲料的营价值并可有效利用降解释放出的磷酸。
序列表序列号1长度443类型氨基酸拓扑结构线性分子类型蛋白质假拟的是序列描述序列号1Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys1 5 10 15Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser20 25 30Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His35 40 45Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr50 55 60Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln65 70 75 80Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn85 90 95Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu100 105 110Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg115 120 125Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala130 135 140Ser Gly Ash Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp145 150 155 160Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile165 170 175Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Ash Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr180 185 190Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr195 200 205Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser210 215 220GlY Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys225 230 235 240Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro245 250 255Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu260 265 270Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly275 280 285Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr290 295 300His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser305 310 315 320Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser325 330 335His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn
340 345 350Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr355 360 365Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pre Phe Ala Ser Arg Met Tyr370 375 380Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val385 390 395 400Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala405 410 415Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala420 425 430Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu Cys Phe Ala435 440序列号2长度443类型氨基酸拓扑结构线性分子类型蛋白质假拟的是序列描述序列号2Ser Xaa Xaa Gln Ser Thr Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys1 5 10 15Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser20 25 30Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His35 40 45Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr50 55 60Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln65 70 75 80Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn85 90 95Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu100 105 110Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg115 120 125Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala130 135 140Ser Gly Asn Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp145 150 155 160Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile165 170 175Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr180 185 190Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr195 200 205Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser210 215 220Gly Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys225 230 235 240Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro245 250 255Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu260 265 270Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly275 280 285Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr290 295 300His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser305 310 315 320Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser325 330 335His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn340 345 350Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr355 360 365Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr370 375 380Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val385 390 395 400Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala405 410 415Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala420 425 430Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu Cys Phe Ala435 440序列号3长度467类型氨基酸拓扑结构线性分子类型蛋白质假拟的是序列描述序列号: 3Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Gly Val1 5 10 15Thr Ser Gly Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp20 25 30Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp35 40 45Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser50 55 60Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser65 70 75 80Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser85 90 95Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys100 105 110Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu115 120 125Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr130 135 140Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser145 150 155 160Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Gly Asn Lys Phe Ile Glu Gly165 170 175Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser180 185 190Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn
195 200 205Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala210 215 220Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg225 230 235 240Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser Gly Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu245 250 255Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser260 265 270Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu275 280 285Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly290 295 300His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala305 310 315 320Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr325 330 335Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn340 345 350Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile355 360 365Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr370 375 380Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr385 390 395 400Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser405 410 415Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro420 425 430Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser435 440 445Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu450 455 460Cys Phe Ala465序列号4长度1332类型核苷酸链型单链拓扑结构线型分子类型基因组DNA序列描述序列号4TCG AGA AAT CAA TCC ACT TGC GAT ACG GTC GAT CAG GGG TAT CAA TGC48Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys1 5 10 15TTC TCG GAG ACT TCG CAT CTT TGG GGC CAA TAC GCG CCG TTC TTT TCT96Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser20 25 30CTG GCAAAC AAA TCG GCC ATC TCC CCT GAT GTT CCT GCC GGA TGC CAT144Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His35 40 45GTC ACT TTC GCC CAG GTT CTC TCC CGC CAT GGA GCA CGG TAT CCG ACC 192Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr50 55 60GAC TCC AAG GGC AAG AAA TAC TCC GCT CTC ATC GAG GAG ATC CAG CAG 240Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln65 70 75 80AAC GCG ACA ACC TTC GAG GGG AAA TAT GCC TTC CTG AAG ACA TAC AAC 288Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn85 90 95AC AGC CTG GGC GCG GAT GAT CTG ACT CCC TTC GGA GAG CAG GAG CTG 336Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu100 105 110GTC AAC TCC GGC GTC AAG TTC TAC CAG CGA TAC GAA TCG CTC ACA AGA 384Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg115 120 125AAC ATT GTC CCG TTC ATC CGA TCC TCA GGC TCC AGC CGC GTG ATT GCC 432Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala130 135 140TCT GGC AAT AAA TTC ATC GAG GGC TTC CAG AGC ACT AAG CTG AAG GAT 480Ser Gly Asn Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp145 150 155 160CCT CGT GCC CAG CCC GGC CAA TCG TCG CCC AAG ATC GAC GTG GTC ATT 528Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile165 170 175TCA GAG GCC AGC ACA TCC AAC AAC ACT CTC GAT CCG GGC ACC TGC ACC 576Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr180 185 190GTT TTC GAA GAT AGC GAA TTG GCC GAT GAC ATC GAA GCC AAT TTC ACC 624Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr195 200 205GCC ACG TTC GTC CCC TCC ATT CGT CAA CGT CTG GAG AAC GAC TTG TCT 672Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser210 215 220GGC GTG TCT CTC ACG GAC ACA GAA GTG ACC TAC CTC ATG GAC ATG TGC 720Gly Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys225 230 235 240TCC TTC GAC ACC ATC TCC ACC AGC ACC GTC GAC ACC AAG CTG TCC CCC 768Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro245 250 255TTC TGT GAC CTG TTC ACC CAT GAA GAA TGG ATC AAC TAC GAC TAC CTC 816Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu260 265 270CAG TCC CTG AAC AAA TAC TAC GGC CAT GGC GCA GGT AAC CCG CTC GGC 864Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly275 280 285CCG ACC CAG GGC GTC GGC TAC GCT AAC GAG CTC ATC GCC CGT CTC ACC 912Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr290 295 300CAC TCG CCT GTC CAC GAT GAC ACC AGC TCC AAC CAC ACA TTG GAC TCC 960His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser305 310315 320AAC CCG GCT ACT TTC CCG CTC AAC TCC ACT CTC TAT GCG GAC TTT TCG 1008Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser325 330 335CAT GAT AAC GGC ATC ATC TCT ATC CTC TTT GCT TTG GGT CTG TAC AAC 1056His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn340 345 350GGC ACC AAG CCG CTG TCT TCC ACG ACC GCG GAG AAT ATC ACC CAG ACC 1104Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr355 360 365GAT GGG TTC TCA TCT GCC TGG ACG GTT CCT TTC GCG TCG CGC ATG TAC 1152Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr370 375 380GTC GAG ATG ATG CAA TGC CAG TCC GAG CAG GAG CCT TTG GTC CGT GTC 1200Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val385 390 395 400TTG GTT AAT GAT CGT GTT GTT CCG CTG CAT GGC TGT CCG GTT GAT GCT 1248Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala
405 410 415TTG GGA AGA TGT ACG CGG GAT AGC TTC GTG AAG GGG TTG AGC TTT GCC1296Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala420 425 430AGA TCT GGC GGT GAT TGG GGG GAG TGT TTC GCT TAG1332Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu Cys Phe Ala Ala435 440序列号5长度1515类型核苷酸链型单链拓扑结构线性分子类型基因组DNA假拟的是反义是在基因组的位置单位基因组％序列描述序列号5ATG GGT GTC TCT GCC GTT CTA CTT CCT TTG TAC CTC CTG TCC GG 44Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Gly-20 -15 -10GTATGCTAAT CATCCCTATC GGAGCCTGAT ATGGACCCTC CCCTTCCGAA GGCCCCCTGA 104AGCTTGGACT GTGTGGGACT ATTGATCTGA TCGCTGACAA TCTGTGCACA GA GTC 159ValACC TCC GGA CTG GCA GTC CCC GCC TCG AGA AAT CAA TCC ACT TGC GAT 207Thr Ser Gly Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp-5 1 5ACG GTC GAT CAG GGG TAT CAA TGC TTC TCG GAG ACT TCG CAT CTT TGG 255Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp10 15 20GGC CAA TAC GCG CCG TTC TTT TCT CTG GCA AAC AAA TCG GCC ATC TCC 303Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser25 30 35 40CCT GAT GTT CCT GCC GGA TGC CAT GTC ACT TTC GCC CAG GTT CTC TCC 351Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser45 50 55CGC CAT GGA GCA CGG TAT CCG ACC GAC TCC AAG GGC AAG AAA TAC TCC 399Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser60 65 70GCT CTC ATC GAG GAG ATC CAG CAG AAC GCG ACA ACC TTC GAG GGG AAA 447Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys75 80 85TAT GCC TTC CTG AAG ACA TAC AAC TAC AGC CTG GGC GCG GAT GAT CTG 495Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu90 95 100ACT CCC TTC GGA GAG CAG GAG CTG GTC AAC TCC GGC GTC AAG TTC TAC 543Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr105 110 115 120CAG CGA TAC GAA TCG CTC ACA AGA AAC ATT GTC CCG TTC ATC CGA TCC 591Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser
125 130 135TCA GGC TCC AGC CGC GTG ATT GCC TCT GGC AAT AAA TTC ATC GAG GGC 639Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Gly Asn Lys Phe Ile Glu Gly140 145 150TTC CAG AGC ACT AAG CTG AAG GAT CCT CGT GCC CAG CCC GGC CAA TCG 687Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser155 160 165TCG CCC AAG ATC GAC GTG GTC ATT TCA GAG GCC AGC ACA TCC AAC AAC 735Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn170 175 180ACT CTC GAT CCG GGC ACC TGC ACC GTT TTC GAA GAT AGC GAA TTG GCC 783Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala185 190 195 200GAT GAC ATC GAA GCC AAT TTC ACC GCC ACG TTC GTC CCC TCC ATT CGT 831Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg205 210 215CAA CGT CTG GAG AAC GAC TTG TCT GGC GTG TCT CTC ACG GAC ACA GAA 879Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser Gly Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu220 225 230GTG ACC TAC CTC ATG GAC ATG TGC TCC TTC GAC ACC ATC TCC ACC AGC 927Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser235 240 245ACC GTC GAC ACC AAG CTG TCC CCC TTC TGT GAC CTG TTC ACC CAT GAA 975Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu250 255 260GAA TGG ATC AAC TAC GAC TAC CTC CAG TCC CTG AAC AAA TAC TAC GGC 1023Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly265 270 275 280CAT GGC GCA GGT AAC CCG CTC GGC CCG ACC CAG GGC GTC GGC TAC GCT 1071His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala285 290 295AAC GAG CTC ATC GCC CGT CTC ACC CAC TCG CCT GTC CAC GAT GAC ACC 1119Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr300 305 310AGC TCC AAC CAC ACA TTG GAC TCC AAC CCG GCT ACT TTC CCG CTC AAC 1167Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn315 320 325TCC ACT CTC TAT GCG GAC TTT TCG CAT GAT AAC GGC ATC ATC TCT ATC 1215Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile330 335 340CTC TTT GCT TTG GGT CTG TAC AAC GGC ACC AAG CCG CTG TCT TCC ACG 1263Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr345 350 355 360ACC GCG GAG AAT ATC ACC CAG ACC GAT GGG TTC TCA TCT GCC TGG ACG 1311Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr365 370 375GTT CCT TTC GCG TCG CGC ATG TAC GTC GAG ATG ATG CAA TGC CAG TCC 1359Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser380 385 390GAG CAG GAG CCT TTG GTC CGT GTC TTG GTT AAT GAT CGT GTT GTT CCG 1407Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro395 400 405CTG CAT GGC TGT CCG GTT GAT GCT TTG GGA AGA TGT ACG CGG GAT AGC 1455Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser410 415 420TTC GTG AAG GGG TTG AGC TTT GCC AGA TCT GGC GGT GAT TGG GGG GAG 1503Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu425 430 435 440TGT TTC GCT TAG 1515Cys Phe Ala443序列号6长度32类型核苷酸链型单链拓扑结构线性分子类型其他核苷酸，合成DNA序列描述序列号6GGGAATTCAT GGGCGTCTCT GCTGTTCTAC TT 32序列号7长度32类型核苷酸链型单链拓扑结构线性分子类型其他核苷酸，合成DNA序列描述序列号7GGGAATTCCT AAGCAAAACA CTCCGCCCAA TC 3权利要求
1.一种当用植酸作底物时，米氏常数为10-30μM的肌醇六磷酸酶。
2.根据权利要求1的肌醇六磷酸酶，具有以下物理化学特征<1>分子量(通过SDS-PAGE)用内切糖苷酶H处理后为60KDa；<2>最适pH值pH5.0-6.5；<3>最适温度45-65℃时，具最大活性；<4>底物特异性可作用的底物有，植酸，对硝基苯基磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和腺苷三磷酸；及<5>等电聚焦pI4.7-5.4。
3.根据权利要求1或2的肌醇六磷酸酶，其中的肌醇六磷酸酶是选自如下的蛋白质具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；或具有SEQ ID N0:1,2和3所示氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被替换、删除或添加并且当将植酸用作底物时，其Km值为10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
4.根据权利要求1或2的肌醇六磷酸酶，其中的肌醇六磷酸酶源于黑曲霉属的微生物。
5.根据权利要求1或2的肌醇六磷酸酶，其中属于黑曲霉属的微生物选自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
6.根据权利要求1-3中任何一项的肌醇六磷酸酶，其中的肌醇六磷酸酶具有糖链。
7.一种基因，当用植酸作底物时，其所编码的肌醇六磷酸酶的米氏常数为10-30μM。
8.根据权利要求7的基因，其中的肌醇六磷酸酶具有以下物理化学特征<1>分子量(通过SDS-PAGE)用内切糖苷酶H处理后为60KDa；<2>最适pH值pH5.0-6.5；<3>最适温度45-65℃时，具最大活性；<4>底物特异性可作用的底物有植酸，对硝基苯基磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和腺苷三磷酸；及<5>等电聚焦pI4.7-5.4。
9.根据权利要求7或8的基因，其中的基因编码的蛋白是选自如下的蛋白质具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被替换、删除或添加并且当将植酸用作底物时，其Km值为10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
10.根据权利要求7或8的基因，其中的基因选自SEQ ID NO:4和5所示的DNA。
11.根据权利要求7或8的基因，其中的基因源于黑曲霉属的微生物。
12.根据权利要求11的基因，其中属于黑曲霉属的微生物选自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
13.通过将一个DNA片段引入一个载体而得到重组DNA，其中的DNA片段编码一种当用植酸作底物时，米氏常数为10-30μM的肌醇六磷酸酶的基因。
14.根据权利要求13的重组DNA，其中的肌醇六磷酸酶具有以下物理化学特征<1>分子量(通过SDS-PAGE)用内切糖苷酶H处理后为60KDa；<2>最适pH值pH5.0-6.5；<3>最适温度45-65℃时，具最大活性；<4>底物特异性可作用的底物有，植酸，对硝基苯基磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和ATP；及<5>等电聚焦pI4.7-5.4。
15.根据权利要求13或14的重组DNA，其中的基因编码的蛋白是选自如下的蛋白质具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；或具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被替换、删除或添加并且当将植酸用作底物时，其Km值为10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
16.根据权利要求13或14的重组DNA，其中的基因选自SEQ IDNO:4和5所示的DNA。
17.根据权利要求13或14的重组DNA，其中的基因源于黑曲霉属的微生物。
18.根据权利要求17的重组DNA，其中属于黑曲霉属的微生物选自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
19.根据权利要求13或14的重组DNA，其中的重组DNA是pANPHY1。
20.携带重组DNA的转化子，该重组DNA是通过将含有编码一种骨醇六磷酸酶的基因的DNA片段导入载体中而得到，当用植酸作底物时，该酶的米氏常数为10-30μM。
21.根据权利要求20的转化子，其中的肌醇六磷酸酶具有以下物理化学特征<1>分子量(通过SDS-PAGE)用内切糖苷酶H处理后为60KDa；<2>最适pH值pH5.0-6.5；<3>最适温度45-65℃时，具最大活性；<4>底物特异性可作用的底物有，植酸，对硝基苯磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和ATP；及<5>等电聚焦pI4.7-5.4。
22.根据权利要求20或21的转化子，其中的基因编码的蛋白是选自如下的蛋白质具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；或具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被替换、删除或添加并且当将植酸用作底物时，其Km值为10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
23.根据权利要求20或21的转化子，其中的基因选自SEQ ID NO:4和5所示的DNA。
24.根据权利要求20或21的基因，其中的基因源于黑曲霉属的微生物。
25.根据权利要求24的基因，其中属于黑曲霉属的微生物选自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
26.根据权利要求20或21的转化子，其中的重组DNA是pANPHY1。
27.根据权利要求20或21的转化子，其中的转化子选自下述微生物大肠杆菌属，沙雷菌属，棒状杆菌属，短杆菌属，假单孢菌属，芽孢杆菌属，曲霉属，根霉菌属，木霉属，链孢霉属，毛霉菌属，青霉属，克鲁维氏酵母属，糖酵母属，裂殖糖酵母属。
28.根据权利要求20或21的转化子，其中的转化子选自黑曲霉MH-PA1(FERM BP-5372)，构巢曲霉M-PA1(FERM BP-5373)和米曲霉MO-PG3。
29.一种制备肌醇六磷酸酶的方法，当用植酸作底物时，该酶的米氏常数为10-30μM，包括，在培养基中培养具有生产和积累肌醇六磷酸酶的微生物，生产和积累肌醇六磷酸酶，从培养物中回收肌醇六磷酸酶。
30.根据权利要求29的方法，其中的肌醇六磷酸酶具有以下物理化学特征<1>分子量(通过SDS-PAGE)用内切糖苷酶H处理后为60KDa；<2>最适pH值pH5.0-6.5；<3>最适温度45-65℃时，具最大活性；<4>底物特异性可作用的底物有，植酸，对硝基苯磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和腺苷三磷酸；及<5>等电聚焦pI4.7-5.4。
31.根据权利要求29或30的方法，其中属于黑曲霉属的微生物选自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
32.根据权利要求29或30的方法，其中的微生物是一个携带有重组DNA的转化子，其中的重组DNA是通过将包含有一个基因的DNA片段引入载体而得到的，其中的基因编码一种肌醇六磷酸酶，当用植酸作底物时，其米氏常数为10-30μM。
33.根据权利要求32的方法，其中的基因编码的蛋白是选自如下的蛋白具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；或具有SEQID NO:1,2和3所示氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被替换、删除或添加并且当将植酸用作底物时，其Km值为10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
34.根据权利要求32的方法，其中的基因选自SEQ ID NO:4和5所示的DNA。
35.根据权利要求32的方法，其中的基因源于黑曲霉属的微生物。
36.根据权利要求32的方法，其中属于黑曲霉属的微生物选自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
37.根据权利要求32的方法，其中的重组DNA是pANPHY1。
38.根据权利要求32的方法，其中的转化子选自下述微生物大肠杆菌属，沙雷菌属，棒状杆菌属，短杆菌属，假单孢菌属，芽孢杆菌属，曲霉属，根霉菌属，木霉属，链孢霉属，毛霉菌属，青霉属，克鲁维氏酵母属，糖酵母属，裂殖糖酵母属。
39.根据权利要求32的方法，其中的转化子选自黑曲霉MH-PA1(FERM BP-5372)，构巢曲霉M-PA1(FERM BP-5373)和米曲霉MO-PG3。
40.一种动物饲料，包含有一种当用植酸作底物时，米氏常数为10-30μM的肌醇六磷酸酶。
全文摘要
一种对于植酸有低的米氏常数,价格低廉的肌醇六磷酸酶;编码此肌醇六磷酸酶的DNA;包含有该DNA整合其中的重组DNA;携带该重组DNA的转化子;利用该转化子制备肌醇六磷酸酶的方法,一种利用该肌醇六磷酸酶制备的饲料。
文档编号C12N1/21GK1220697SQ9719516
公开日1999年6月23日 申请日期1997年4月4日 优先权日1996年4月5日
发明者近藤英正, 穴泽秀治, 兼子俊一, 长岛直, 丹下达也 申请人:协和发酵工业株式会社, 新日本化学工业株式会社