专利名称：以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术胸腺素α1(thyinosin-α1，Tα1)是由28个氨基酸组成的酸性多肽，等电点4.2，其氨基酸序列为N-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C。是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂。它可以促使T细胞成熟和分化，可促使成熟的T细胞、NK细胞分泌各种淋巴因子如白介素-2和γ-干扰素，也同时促进白介素-2受体的生成，促使高亲和力白介素-2受体(IL-2R)的生成。
Tα1作为一种免疫增强剂，主要用于免疫缺陷和免疫受抑制的疾病。当病人感染某些病毒如HIV、HBV或癌症以及经过放疗或化疗后，其免疫系统往往会被逐渐抑制乃至破坏，而不能发挥对病毒或癌细胞的正常杀伤作用。Tα1可以恢复T淋巴细胞的功能，促进成熟T细胞的增殖，促进淋巴细胞在病原组织及癌细胞周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的产生，这样就大大增强了免疫细胞的作用，提高了对病毒和癌症的抵抗能力。
Tα1在医疗上的应用主要有以下几个方面(1)癌症的治疗，已证实对恶性黑色素瘤、肺癌、红白血病、鳞状上皮细胞癌、直结肠癌有效。(2)病毒性肝炎HBV的治疗；(3)爱滋病病毒(HIV)感染的治疗。Tα1也应用于放疗和化疗病人的免疫系统恢复。
Tα1不仅对多种恶性肿瘤、病毒性肝炎、HIV等常见、多发、高死亡率性疾病有良好的治疗和缓解作用，还在新生儿免疫、老年人的医疗保健方面应用具有很大的潜力，因此其市场需求将不可估量。
目前，国内制备胸腺素α1常用的方法是从动物(如牛、猪)的胸腺中的提取，这种方法的缺点是操作复杂，提取Tα1的纯度不高，且来源受动物数量的限制，国外制备胸腺素α1常用的方法是化学合成法，这种方法的缺点是合成成本较高。
本发明的目的是利用基因工程技术，根据Tα1的氨基酸序列，推导并合成了其编码核苷酸序列，并以串连的方式组装入大肠杆菌表达载体，然后以大肠杆菌发酵的方式获得高纯度、高活性的Tα1生物活性物质。
本发明的优点1、应用人工方法，按大肠杆菌惯用密码子合成Tα1基因，采用串联体的方式，使Tα1在大肠杆菌中得以大量(10％)表达。
2、采用常压离子交换方法加以纯化，分离纯化方法简单，成本低。
3、用基因工程方法生产的Tα1比起国外的化学合成法，成本大为降低，比起动物组织提取方法来又具有操作简单、易于放大、工艺取材不受限制，产量大、活性高等优点。
本发明目的是通过以下方式实现的首先按照大肠杆菌的惯用密码子把的Tα1的28个氨基酸转化为以下核苷酸序列5′AGC GAC GCC GCC GTG GAC ACC AGC AGC GAG ATC ACC ACC AAG3′TGC CTG CGG CGG CAC CTG TGG TCG TCG CTC TAG TGG TGG TTCGAC CTG AAG GAG AAG AAG GAG GTG GTG GAG GAG GCC GAG AAC 3′CTG GAC TTC CTC TTC TTC CTC CAC CAC CTC CTC CGG CTC TTG 5′
然后在Tα1基因前依次接上核酸内切酶(EcoRI)，蛋氨酸、核酸内切酶(BamHI)、蛋氨酸对应的核苷酸序列，在Tα1基因后依次加上蛋氨酸、核酸内切酶(Bg1II)、终止密码子、核酸内切酶(PstI)对应的核苷酸序列。把pUC19用EcoRI和PstI双酶切，然后把退火过Tα1基因连同其前后的附加序列用T4DNA连接酶与pUC19/EcoRI+PstI连接后，克隆入pUC19的EcoRI和PstI位点，酶切、测序证明正确的克隆经扩大培养后，提取质粒，分为两份，一份用BamHI+PstI双酶切，回收小片段(约120个核苷酸残基)，一份用Bg1II+PstI双酶切，回收大片段(约2698个核苷酸残基)，再把两份回收的大、小片段用T4DNA连接酶连接，即为Tα1的2串体。经酶切和测序证明正确的2串体克隆，经扩大培养，提取质粒DNA，分为两份，一份用BamHI+PstI双酶切，回收小片段(约240个核苷酸残基)，一份用Bg1II+PstI双酶切，回收大片段(约2930个核苷酸残基)，大小片段用T4DNA连接酶连接，即为Tα1的4串体。
上述克隆技术路线如下EcoRI Met BamHI Met Tα1基因 Met Bg1II stop PstIAATTC ATG GGATCC ATG ———— ATG AGATCT TCACTGCA采用BanHI和BglII酶切后实现Tα1基因的串联。
其具体步骤为1.采用亚磷酰胺法合成4条基因片段①Th1(42mer)5′AAT TCA Tgg gAT CCA TgA gcg Acg Ccg Ccg Tgg AcACCA gCA 3′②Th2(76mer)
5′gcg AgA TCA CCA CCA Agg Acc TgA Agg AgA AgA AggAgg Tgg Tgg Agg Agg ccg AgA AcATgA gAT CTT GacTgCA 3′③Th3(67mer)5′CTC CTT CAg gTC CTT ggT ggT gAT CTC gcT gcT ggTgTC CAC ggC ggC gTC gCT CAT ggA Tcc CATg 3′④Th4(43mer)5′gTC Aag ATC TCA TgT TCT Cgg CCT CCT CCA CCA CCTCCT TCTT 3′2.合成片段的退火用TE[10mmTrisHcl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，0.1mmEDTA(乙二胺四乙酸二钠)]溶解Th1，Th2，Th3，Th4，使其终浓度为1μg/μl，各取10μl，再加10μlTE，总体积50μl，75℃，退火10分钟。
3.质粒的酶切消化取pUC19质粒1μg，用EcoRI和PstI酶双酶切，然后电泳酶切产物，回收所需条带，溶于10μlddH2O中。
4.连接方法法取步骤2退火的片段5μl，T4DNA连接酶1.0μl，连接缓冲液1.5μl，步骤3中所回收的质粒片段5μl，ddH2O2.5μl，16℃连接过夜。
5.连接产物转化大肠杆菌用步骤4中所产生连接产物转化大肠杆菌JM109感受态。
6.阳性克隆的筛选
通过铺板、培养、扩增、酶切等方法初选出阳性克隆，最后通过测序确定阳性克隆。
7.Tα1基因的串联挑选阳性克隆大量提取质粒，把质粒分为两份，一份用BamHI+PstI酶切，回收其小片段部分，一份用Bg1II+PstI酶切，回收其大片段，两份回收部分DNA连接，重复4-7，共进行二次，直到产生四骤体为止。
高效表达形体的构建将含重组胸腺素α1基因的pUC19经EcoRI和PstI双酶切，回收Tα1四聚体，插入原核高效表达载体pBV220中，形成pBVTα1重组体。
工程菌的建立宿主菌为大肠杆菌DH5α，将连结好的pBVTα1用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α株，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，LB培养液扩大培养，提取质粒，用EcoRI和PstI双酶切，筛选出目的菌株。
工程菌pBVTα1在大肠杆菌中的表达将经筛选后的pBVTα1/DH5α30℃培养过夜，42℃诱导5小时，菌体经验2×载样缓冲液处理，进行SDS-PAGE电泳，染色，脱色，干胶后扫描分析，在分子量12.6KD左右处有明显表达条带，此带战友菌体总蛋白的15％。
Tα1实验室纯化pBVTα1/DH5α表达菌经诱导后收集菌体。菌体用溶菌酶裂解，取裂菌上清加入(NH4)2SO4达50％和度，上清用10mmol/Tris-Hcl pH8.5，1mmol/LEDTA充分透析。粗提液经Q-Sepherose柱层析，0-0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集Tα1峰。透析除盐后，经S-Sepherose柱层析，0～1mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集Tα1活性峰，稀释、过滤、分装，冷冻干燥。
Tα1四聚体的裂解及单估的纯化Tα1四聚体冻干后，按0.16mg Tα四聚体加入0.5M CNBr 0.2ml(CNBr溶解在80％甲酸中)。室温裂解过夜，裂解完毕后，加入1.3ml H2O，中止半小时以除去CNBr，然后再冷冻干燥。然后用10mm磷酸年轻缓冲液，PH5.0溶解，经DEAE柱层析，用0～1mmol/L NaCl线性梯度洗脱，收集Tα1单体峰。
实施例采用Tα1工程菌发酵，以30L发酵罐为例，每升发酵液收菌5克，30L共发酵150克，每次发酵周期为2天，每周发酵3次，每个月10次，共收菌150×10＝1500克，以表达量10％，纯化效率为50％，每个月共生产Tα1 1500克×10％×50％＝75克。每支药1.6mg，共装75000/1.6＝46875支，每支售价按进口同类药的1/5(既900/5＝180元)，月产值为46875×180＝8437500元，年产值为8437500×12＝101250000元，既1个亿。
权利要求
1.以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1，其特征是首先按照大肠杆菌的惯用密码子把的Tα1的28个氨基酸转化为以下核苷酸序列5′AGC GAC GCC GCC GTG GAC ACC AGC AGC GAG ATC ACC ACC AAG3′TGC CTG CGG CGG CAC CTG TGG TCG TCG CTC TAG TGG TGG TTCGAC CTG AAG GAG AAG AAG GAG GTG GTG GAG GAG GCC GAG AAC 3′CTG GAC TTC CTC TTC TTC CTC CAC CAC CTC CTC CGG CTC TTG 5′然后在Tα1基因前依次接上核酸内切酶(EcoRI)，蛋氨酸、核酸内切酶(BamHI)、蛋氨酸对应的核苷酸序列，在Tα1基因后依次加上蛋氨酸、核酸内切酶(Bg1II)、终止密码子、核酸内切酶(PstI)对应的核苷酸序列。把pUC19用EcoRI和PstI双酶切，然后把退火过Tα1基因连同其前后的附加序列用T4DNA连接酶与pUC19/EcoRI+PstI连接后，克隆入pUC19的EcoRI和PstI位点，酶切、测序证明正确的克隆经扩大培养后，提取质粒，分为两份，一份用BamHI+PstI双酶切，回收小片段(约120个核苷酸残基)，一份用Bg1II+PstI双酶切，回收大片段(约2698个核苷酸残基)，再把两份回收的大、小片段用T4DNA连接酶连接，即为Tα1的2串体。经酶切和测序证明正确的2串体克隆，经扩大培养，提取质粒DNA，分为两份，一份用BamHI+PstI双酶切，回收小片段(约240个核苷酸残基)，一份用Bg1II+PstI双酶切，回收大片段(约2930个核苷酸残基)，大小片段用T4DNA连接酶连接，即为Tα1的4串体。上述克隆技术路线如下EcoRI MetBamHIMet Tα1基因 Met Bg1II stop PstIAATTC ATGGGATCC ATG ———— ATG AGATCT TCACTGCA采用BanHI和Bg1II酶切后实现Tα1基因的串联。
2.根据权利要求1所述的以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1，其特征是胸腺素α1以4串体的形式在大肠杆菌中表达。
全文摘要
以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1,涉及基因工程技术,采用全合成Tα1基因的方法,通过克隆、测序等步骤,把Tα1基因串联为四聚体,并利用大肠杆菌加以表达,采用离子交换法加以纯化,从而获得高纯度、高活性的Tα1生物活性物质,且生产工艺简单、成本低、产量大,其市场需求将不可估量。
文档编号C12N15/12GK1258747SQ9811306
公开日2000年7月5日 申请日期1998年12月30日 优先权日1998年12月30日
发明者赵永同, 张英起 申请人:中国人民解放军第四军医大学