灌流式组织培养及药物敏感性试验装置的制作方法

专利名称：灌流式组织培养及药物敏感性试验装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组织培养及药物敏感性试验装置，它是由供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)及保护盒(F)组成的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置。
如何正确筛选出对某一肿瘤具有化疗敏感性的药物来进行针对性较强的个体化治疗，以期提高化疗效果并降低化疗药物的毒副作用，已成为近年来改善肿瘤化疗方法所追求的目标。自七十年代以来，化疗药物敏感性试验在探索中不断发展，目前已有体内和体外两大类试验方法。但是这两类方法均不能反映药物在体内对肿瘤的实际杀伤情况，主要问题有(1)动物体内药敏试验虽然模拟了人体内的生理环境，但与人体内的复杂的免疫环境相比差异仍很大，而且实验周期长、费用高昂、用药量大，这些因素限制了它的应用；(2)以往应用的体外单层细胞或单细胞悬液培养药物敏感性试验，肿瘤细胞在加入化疗药物的培养液中生长，往往使所测得的药物敏感性明显高于体内实际情况，不能反应体内可能参与作用的其它因素。
由于实体瘤在体内占据一定的空间立体结构，其表层及不同深度层的血管分布、氧及营养物质的供应均不相同，处于不同增殖状态的细胞数及比例亦不相同，从而导致了对化疗药物敏感性的差异。探索能够模拟实体瘤内部血运不丰富、药物不易到达深部、细胞增殖周期不同步以及有相应的细胞生长微环境等因素的体外细胞培养法日益受到重视。细胞团或组织块培养法有类组织的特点，但肿瘤细胞团仍浸于培养液中生长，不能建立适于细胞生长的微环境，另外，由于各细胞团或组织块的取材部位的不同，各细胞团或组织块间的均一性和可比性存在差异，以及在培养过程中细胞团或组织块内部可出现自发性坏死等因素，均不利于对药物敏感性试验结果的判定。
由德国学者Petra Kpf-maier于1991年报道的人体肿瘤的类器官培养法(1.Petra Kpf-Maier and B.Zimermann.Organoid reorganizationof human tumors under in vitro conditions.Cell and Tissue Research.1991，264563-576；2.Petra Kpf-Maier.A new approach for realizingthe″antioncogram″.Life Sciences.1992，50(22)1711-1718；3.P.Kpf-Maier and B.Kolon.An organoid culture assay(OCA) for deter-mining the drug sensitivity of human tumors.Int J Cancer.1992，5199-107)，即将由肿瘤组织制备的高浓度的含有多种细胞的悬液滴在置于培养液表面的滤纸上的细胞生长介质滤膜(如硝酸纤维膜)上进行培养，几天后可形成紧密的细胞团，由此建立了一个类似人体内肿瘤生长环境的肿瘤模型。这种类器官培养法具有以下特点(1)经培养生长成由成纤维细胞、肌上皮细胞以及上皮来源的癌细胞等异源细胞组成的癌细胞团；(2)细胞团内具有腺腔、微绒毛、细胞间连接灌流体等类似来源组织的立体形态结构特征；(3)保持了肿瘤细胞异质性，建立了细胞间的相互作用关系；(4)培养基中的药物须透过滤膜的孔接触癌细胞，生长微环境以及与药物的作用方式近似于体内的情况。但是此方法在生理代谢与药代动力学方面尚存在一些问题，如体内血供不断给肿瘤提供营养物质，同时带走组织代谢排泄物，使局部微环境保持稳定等，而这种类器官培养法仅依靠渗透作用局部交换，细胞生长微环境中的代谢产物将会在局部逐渐积累增多，而提供的氧和营养物质却逐渐减少，同时加入培养基中的药物透过细胞生长介质滤膜的量和速度也受到影响。
本发明的目的是为了解决Petra Kpf-maier的类器官培养法中存在的上述问题和缺点，研制一种适用于药物敏感性试验的组织培养装置。参照1964年陈瑞铭和朱德厚报道的利用滤纸虹吸原理培养器官的方法(实验生物学报.1964，9(2)163-171)以及鲍家驹报道的网格法器官培养(章静波主编.细胞生物学实用方法与技术.北京北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1995，847-49)和章静波等报道的灌流式器官培养法(实验生物学报.1979，12299-300)，在Petra Kpf-maier类器官培养法的基础上加以改进和发展，从生理学、组织学、肿瘤生物学及药理学等方面出发，在多重试验的基础上，发明了本项灌流式组织培养及药物敏感性试验装置。
本发明的目的可采用以下技术方案来实现由供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)及保护盒(F)组成的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置，此装置的各组成部分的基本结构特点及作用原理如下

图1是供液槽(A)供液槽(A)是用于储存培养液(G)并供应组织生长需要的，在其一端的底部有一个滴管(a1)，在工作状态时供液槽(A)中的培养液自滴管(a1)流出，在供液槽(A)的底部有两处有突出的支脚(a2)，以使供液槽(A)平稳地置于支持方盘(D)上。
图2是过滤管(B)过滤管(B)由外套管(b1)、内套管(b2)和过滤物(b3)组成，过滤物(b3)置于内套管(b2)中，内套管(b2)和过滤物(b3)占外套管(b1)的下半部分，过滤管(B)以其外套管(b1)连接于供液槽(A)的滴管(a1)上，通过选择不同内径的内套管(b2)和过滤物(b3)来控制培养液的滴速。
图3是灌流培养层(C)灌流培养层(C)由上层滤纸(c1)、上层带孔隔离膜(c2)、上层细胞生长介质(c3)，中层带孔隔离膜(c4)和下层细胞生长介质(c5)、下层带孔隔离膜(c6)、下层滤纸(c7)由上至下排列组成，下层滤纸(c7)有一端较长并折向下方，其主体部分位于支持方盘(D)上。上、中、下三层带孔隔离膜上有孔处上下相互对应，两层细胞生长介质之间对应于上、中、下三层隔离膜上有孔处(一处以上)为种植组织(细胞)区(c8)，每处可种植一株组织(细胞)。灌流培养层是本发明装置的核心结构，其作用原理是在工作状态时培养液(G)加入供液槽中，培养液通过滴管(a1)经过滤管(B)连续缓慢地滴在上层滤纸(c1)上，沿滤纸横向漫延并向下方渗透，再依次经上、中、下三层隔离膜上有孔处，由上向下穿过上、下两层细胞生长介质(c3，c5)到达下层滤纸(c7)上，在下层滤纸(c7)漫延，经其较长并折向下方的一端滴入收液槽(E)中。通过上述过程，培养液由位于高处的供液槽中流向低处的收液槽中，在灌流培养层的种植组织(细胞)区形成了一种柱状培养液灌流区域，类似于体内组织的微循环血液供应。
图4是支持方盘(D)置于收液槽(E)上方的支持方盘(D)是用来放置灌流培养层(C)的。支持方盘的底面为长条形平面(d1)与灌流培养层(C)的主体部分相适应，在其中一端有一个横形的开口(d2)，灌流培养层的下层滤纸(c7)较长并折向下方的一端插入此处，支持方盘的四周为向上凸起的棱边(d3)，起固定灌流培养层(C)以及防止培养液流失的作用。
图5是收液槽(E)收液槽(E)位于支持方盘(D)的下方，是用于收集组织代谢废液(H)的。
图6是保护盒(F)保护盒(F)由盒底(f1)和盒盖(f2)组成，收液槽(E)、支持方盘(D)、灌流培养层(C)、过滤管(B)、供液槽(A)分别置于保护盒中，构成一个整体。
上述供液槽、收液槽、支持方盘和保护盒可由无细胞毒性作用的玻璃或硬质塑料等材料制成，采用透明材料制成便于在培养中进行观察，灌流培养层中的细胞生长介质可采用适于组织生长的微孔滤膜(如硝酸纤维膜等)制成，带孔隔离膜可由无细胞毒性的塑料薄膜制成，过滤管的外套管可由乳胶或硅胶制成、内套管由玻璃或硬质塑料制成、过滤物由具有过滤性能的材料制成。
本发明的具体使用方法及步骤为在具备进行普通组织培养的条件下，如温度37℃，5％二氧化碳培养箱等(鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京北京出版社.1995)，按图7所示将供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)及保护盒(F)分别组装，即组成了灌流式组织培养及药物敏感性试验装置。
灌流式组织培养及药物敏感性试验装置的组装及细胞种植顺序在无菌条件下在无菌平台上进行操作，先将保护盒(F)的盒底(f1)置于无菌平台上，将收液槽(E)置于盒底(f1)中，其上放置支持方盘(D)，将灌流培养层(C)的下层滤纸(c7)、下层带孔隔离膜(c6)、下层细胞生长介质(c5)、中层带孔隔离膜(c4)依次排列于支持方盘(D)上，将要培养的组织如高浓度的细胞悬液滴在种植组织(细胞)区(c8)，再依次放置上层细胞生长介质(c3)、上层带孔隔离膜(c2)和上层滤纸(c1)，将过滤管(B)接于供液槽(A)并置于灌流培养层(C)上方，即完成上了组装及细胞种植。
组织培养方法如图8所示，将适量培养液(G)加入供液槽(A)中，盖上保护盒(F)，将整个培养装置放置于(37℃/5％二氧化碳)培养箱内进行培养，培养液通过滴管(a1)经过滤管(B)连续缓慢地滴在上层滤纸(c1)上，沿滤纸横向漫延并向下方渗透，再依次经上、中、下三层隔离膜上有孔处，由上向下穿过上、下两层细胞生长介质(c3，c5)到达下层滤纸(c7)上，在下层滤纸(c7)上漫延，经其较长并折向下方的一端流入收液槽中。通过上述过程，培养液由位于高处的供液槽中滴入低处的收液槽(E)中，在复合培养层的种植组织(细胞)区形成了一种柱状培养液灌流区域，类似于体内组织的微循环血液供应。滴在种植组织(细胞)区的组织则开始生长，培养液的灌流供给方式是持续流动的，在培养过程中可间断向供液槽中加入培养液，取出收液槽中的组织代谢废液(H)，在几天后可逐渐形成紧密的细胞团(c9)，类似于Petra Kopf-maier的类器官培养法。
药物敏感性试验方法先将由肿瘤组织制备的高浓度的细胞悬液按上述组织培养方法进行培养，选择一定时期将抗肿瘤药物加入供液槽中的培养液中，继续加以培养，可从细胞形态、细胞增殖、细胞代谢等方面测定抗肿瘤药物对细胞的杀伤作用，进而判断肿瘤组织对药物的敏感性。此法适用于对实体肿瘤进行药物敏感性试验。
与现有组织培养装置比较，本发明具有如下优点和有益效果(1)建立了类似于体内血液流动的微环境；(2)使肿瘤生长出的细胞团类似于人体内肿瘤的立体形态结构特征；(3)保持了肿瘤细胞的异质性及其相互间的作用关系；(4)在进行药物敏感性试验时对培养组织供药方式类似于体内血供通路；(5)实验方法简便易行，药物敏感性试验结果更接近于体内实际情况。
本灌流式组织培养及药物敏感性试验装置在国内、外尚无先例，该发明虽然是对类器官培养法的改进，不仅适用于进行类器官培养，也可应用于广义的体外组织培养，包括对细胞、组织块或器官进行培养。本发明为肿瘤生物学特性的研究、抗癌新药筛选、药物作用机制的探讨以及耐药性的研究、抗癌新药临床前期实验及体外化疗药物和放疗敏感性试验等的研究开辟了一条新途径。
附图的图面说明如下图1供液槽(A)；图2过滤管(B)；图3；灌流培养层(C)图4支持方盘(D)；图5收液槽(E)；图6是保护盒(F)图7灌流式组织培养及药物敏感性试验装置立体图8图7的剖视图，为图7中的0-0剖面；图9灌流式组织培养及药物敏感性试验装置的实施例。
在图7和图9中只标出了盒底和盒盖的一部分。
A.供液槽 a1.滴管 a2.支脚 B.过滤管 b1.外套管 b2.内套管 b3.过滤物 C.灌流培养层 c1.上层滤纸 c2.上层带孔隔离膜 c3.上层细胞生长介质 c4.中层带孔隔离膜 c5.下层细胞生长介质 c6.下层带孔隔离膜 c7.下层滤纸 c8.种植组织(细胞)区 c9.细胞团 D.支持方盘 d1.长条形平面 d2.开口 d3.棱边 E.收液槽 F.保护盒 f1.盒底 f2.盒盖 G.培养液 H.代谢废液 ↓培养液流动方向本发明的实施方式如下，下面结合附图作进一步详述实施例本实施例是由M组(M≥2)供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)及保护盒(F)分别并列组合成一体而成的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置。各组供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)均分别相同，其中多组保护盒(F)并列组合成了一个共用的保护盒。每条灌流培养层上有N个种植组织(细胞)区，则本实施例适于种植X株(X＝M×N)组织。
如图9本实施例由3组供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)和一个保护盒(F)组成。在3条灌流培养层上，每个灌流培养层上有3个种植组织(细胞)区，这种灌流式组织培养及药物敏感性试验装置可一次同时培养3组共9株组织。
权利要求
1.一种组织培养装置，其特征在于它是由供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)及保护盒(F)组成的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置。
2.根据权利要求1所述的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置，其特征在于其中的支持方盘(D)的底面为长条形平面(d1)，在其中一端有一个横形的开口(d2)，四周为向上凸起的棱边(d3)。
3.根据权利要求1所述的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置，其特征在于其中的灌流培养层(C)是由上层滤纸(c1)、上层带孔隔离膜(c2)、上层细胞生长介质(c3)，中层带孔隔离膜(c4)和下层细胞生长介质(c5)、下层带孔隔离膜(c6)、下层滤纸(c7)由上至下排列组成，其中下层滤纸(c7)有一端较长并折向下方，其主体部分位于支持方盘(D)上，上、中、下三层带孔隔离膜上有孔处上下相互对应。
4.根据权利要求1所述的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置，其特征在于它是由多组(2组以上)供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)及保护盒(F)分别并列组合成一体而组成的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置，各组供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持平台(D)、收液槽(E)均分别相同，其中多组保护盒(F)并列组合成了一个共用的保护盒。
全文摘要
本发明是涉及一种组织培养及药物敏感性试验装置,它是由供液槽(A)、过滤管(B)、灌流培养层(C)、支持方盘(D)、收液槽(E)及保护盒(F)组成的灌流式组织培养及药物敏感性试验装置。本发明建立了具有类似于体内血液流动特点的组织培养微环境,药物敏感性试验的供药方式类似于体内血供通路。本发明适用于类器官培养和细胞、组织块或器官培养,并适用于对新鲜实体肿瘤进行药物敏感性试验以及肿瘤生物学特性的研究。
文档编号C12M3/04GK1245830SQ9811815
公开日2000年3月1日 申请日期1998年8月26日 优先权日1998年8月26日
发明者王悦华 申请人:王悦华