专利名称：人还原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸－细胞色素b5还原酶及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人还原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸—细胞色素b5还原酶(human NADH-cytochrome b5 reductase，简称为humNCb5Rh)的cDNA序列，该蛋白是NCb5R家族的成员。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
还原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸(NADH)—细胞色素b5(cytb5)还原酶(NADH-cytochrom b5 reductare，NCb5R)是细胞微粒体中电子传递体系成员之一。以黄素腺嘌呤核苷酸(FMN)为辅基，催化细胞色素b5的还原反应，参与体内重要合成反应如不饱和脂肪的形成，7-脱氢胆固醇的合成，还参与高铁血红蛋白的还原而调节O2的运输等重要生理功能。该酶由一个大的亲水性催化结构域和一个小的疏水性膜结合结构域组成(Spatz，L.et al，J.Biol.Chem.248793-799，1973)。
根据在细胞内分布不同将NCb5R分为两种类型一种是分布于红细胞质中的可溶解型，主要参与红细胞高铁血红蛋白的还原反应(Hultquist，D.E.，et al.Nature New Biol.299252-254，1971)；另一种是与胞质膜相结合的膜结合型，主要参与脂肪酸的延长及脱饱和(Oshino，N.，et al.J.Biochem.69155-167，1971；Keyes，S.R.，et al.J.Biol.Chem.25511357-11364)、胆固醇的生物合成(Reddy.V.V.R.，etal.J.Biol.Chem.2522797-2801，1977)、抗自由基、和药物代谢过程中的氧化还原反应(Hildebrandt，A.，et al.Arch.Biochem.Biophys.14366-79，1971)。
已确认NADH-cytb5还原酶基因是遗传型高铁血红蛋白血症的候选基因。I型NCb5R缺陷的特点是红细胞中NCb5R缺陷而导致高铁血红蛋白血症，引起发绀(Scott，E.M.et al.Biochem.Biophys.Acta.34584，1959)；II型NCb5R缺陷的特点是所有细胞中NCb5R缺陷，引起高铁血红蛋白血症，并伴随智力底下(Lerou，A.，et al.Nature 258619，1975)；III型NCb5R缺陷的特点是白细胞、血小板、红细胞中NCb5R缺陷，引起的高铁血红蛋白血症但并不伴随智力底下(Tanishima.K.，et al.Blood 661288-1291，1985)。
1989年，人NCb5R的cDNA序列及基因组序列通过酶切图谱及测序等方法获得(Shunji.T.et al.Gene 80353-361，1989)。鼠的NCb5R的cDNA和基因组序列是以人NCb5R的cDNA为探针，从鼠的肝cDNA文库中克隆获得(Shuhei.Z.，et al.J.Biochem.107810-816，1990)。其它物种如牛等的NCb5R的全部或部分DNA或氨基酸序列也有报道。
然而，在本发明之前还没有报道过本发明的新的人还原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸—细胞色素b5还原酶或其编码序列。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码人还原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸—细胞色素b5还原酶，它是NCb5R家族的一个新成员，本发明的NCb5R家族成员被命名为人humNCb5Rh。
本发明的另一个目的是提供一种新的人的NCb5R家族成员，该蛋白被命名为人humNCb5Rh蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的NCb5R多肽的方法。
本发明还提供了这种人的NCb5R核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人humNCb5Rh蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的方法，该方法包括
(a)将编码具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人humNCb5Rh蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人humNCb5Rh蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人humNCb5Rh蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1633个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于39-956位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人humNCb5Rh蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中39-956位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框39-956位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中39-956位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人humNCb5Rh相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人humNCb5Rh蛋白多肽”指具有人humNCb5Rh蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人humNCb5Rh相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人humNCb5Rh蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人humNCb5Rh DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人humNCb5Rh多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人humNCb5Rh多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人humNCb5Rh多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人humNCb5Rh多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人humNCb5Rh蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人humNCb5Rh多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人humNCb5Rh保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表 1
本发明还包括人humNCb5Rh多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人humNCb5Rh的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有人humNCb5Rh多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人humNCb5Rh的核酸分子。
本发明还包括检测人humNCb5Rh核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人humNCb5Rh多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人humNCb5RhDNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人humNCb5Rh基因产物或片段。较佳地，指那些能与人humNCb5Rh基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人humNCb5Rh蛋白的分子，也包括那些并不影响人humNCb5Rh蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人humNCb5Rh基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人humNCb5Rh基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人humNCb5Rh或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人humNCb5Rh功能的抗体以及不影响人humNCb5Rh功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人humNCb5Rh基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人humNCb5Rh基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人humNCb5Rh核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。通常，可先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施例中，人humNCb5Rh的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人体心、脑、胎盘、肝、肾、骨髓、骨骼肌、外周血白细胞和睾丸等组织的cDNA分子库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物—A 5′-GTTCGCTGCAGTTGTTCCCCATC-3′为正向引物，寡核苷酸B5′-TGCCATCTCC ATAAGACCAC CTCTG-3′为反向引物，进行PCR，顺利地扩增出446bp的片段。以该446bp片段为探针，对睾丸cDNA文库进行初、复筛后，我们获得了7个克隆。其中，插入片段为1.6kb的克隆3个，1.2kb的克隆4个。经系列缺失、双向测序及拼接后，我们获得了一个1633bp的全长cDNA顺序(SEQID NO.3)。
因为humNCb5Rh与不饱和脂肪酸氧化、药物代谢及细胞凋亡与肿瘤发生、发展有密切关系，因此对于生物体来说具有重要的生物学意义。此外，由于本发明的humNCb5Rh具有源自人的天然氨基酸序列，因此，预计在施用于人时将具有高活性和低副作用(例如在人体内的免疫原性很低或没有)。
在附图中，
图1为本发明的人humNCb5Rh蛋白与人NCB5R(SP|P00387)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人humNCb5Rh的cDNA序列的克隆和测定1、引物扩增以人体心、脑、胎盘、肝、肾、骨髓、骨骼肌、外周血白细胞和睾丸等组织的cDNA分子库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物—A5′-GTTCGCTGCAGTTGTTCCCCATC-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B5′-TGCCATCTCC ATAAGACCAC CTCTG-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR，PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、66℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟，结果顺利地扩增出446bp片段。以该446bp序列为探针(经α-32P标记)，对睾丸cDNA文库进行初、复筛后，我们获得了7个克隆。插入片段分别为1.6kb和1.2kb两种，各3和4个克隆，其中3个克隆含有完整ORF。经用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)进行系列缺失、双向测序及拼接后，我们获得了一个1633bp长度的cDNA顺序，测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列，其中开放阅读框为第39-956位。
根据得到的全长基因组序列推导出人humNCb5Rh的氨基酸序列，共305个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO4。
2、PCR产物的测序根据上述测序结果，设计PCR引物C5’-ATGGGGATCCAGACGAGCC-3′(SEQ ID NO.9)和D5’-TCAGTAGGTGAATCGCATC-3’(SEQ ID NO.10)。以人体心、脑、胎盘、肝、肾、骨髓、骨骼肌、外周血白细胞和睾丸等组织的cDNA分子库(购自Clontech公司)为模板，用上述C/D引物对进行PCR扩增，得到约900bp的扩增片段。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(EpicentreTechnologies)对扩增片段进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得cDNA序列，共约900bp，经比较与SEQ ID NO.3的全长cDNA序列中的对应部分相一致。
3、RH定位用于RH定位的引物与实施例1中所用的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2相同。RH细胞株DNA购自Research Genetics公司。按G4 Panel法进行PCR，条件为93℃变性3min，然后再以93℃1min，62℃1min，72℃1min，进行35个循环，最后72℃温育5min。结果送Sanger center和WI处理。分析结果表明，本发明的基因定位于1pter-DIS504-NCb5Rg1--WI-9647-1qter之间，经STS图、遗传图、物理图整合分析，最终将humNCb5Rh定位于1q23-32。
实施例2同源比较用本发明的人humNCb5Rh的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，在核苷酸水平上5’端151bp-1006bp分别与人(emb|Y09501，67％)、鼠(dbj|D00636，67％)、牛(gb|M83104，66％)等有较高同源。同源蛋白比较也支持此序列的正确，在氨基酸水平上humNCB5Rh推导蛋白的36-305氨基酸与人(SP|P00387)(图1)、鼠(SP|P20070)、牛(SP|P07514)等的相同性分别达到64％、63％、64％，阳性率都高达80％以上。
在PRODOM软件分析后，确认humNCB5Rh推导蛋白具有由黄素(尼克酰胺)腺苷酸(F(N)AD)结合区及细胞色素b5还原酶催化功能域两个亚结构域组成的NCB5R的催化功能域。humNCB5Rh推导蛋白的氨基酸残基第27位-第303位为细胞色素b5还原酶功能域，其中第176位-第290位为F(N)AD结合区，第27位-第149位为细胞色素b5还原酶催化功能域，尤其是第55，69，77，117位的四个组氨酸残基可能是与细胞色素b5分子中的血红素相结合的位点。因此，humNCB5Rh推导蛋白具有NADH-细胞色素b5还原酶基本分子结构，并可能具有相似的氧化还原酶功能。
研究表明，NCB5R在人体内主要是参与线粒体外氧化还原反应，目前，已知NCB5R是高铁血红蛋白血症的遗传基因，且突变位点不同，所致临床症状轻重不同而分为I、II、III型，基于体内存在多种细胞色素b5的同源体其参与的多种生物化学反应，体内可能存在着NCB5R同系物。因此，本发明humNCb5Rh就是NCB5R同系物之一，是高铁血红蛋白血症的候选基因。
humNCB5Rh推导蛋白N端有疏水性较大的肽段，因而具有与膜结合的可能，已知人、鼠等NCB5R都可与细胞内质膜结合成为膜结合型，因此humNCB5Rh也可能成为膜结合型；或也可能经蛋白质加工后，去掉疏水肽段而成溶解型，参与细胞质内的氧化还原，使得其它类似高铁血红蛋白的分子如O-2、氧化脂类等重要物质能被还原，从而解除了氧化性物质对细胞的毒性作用。所以，humNCB5Rh可能具有不可忽视的生理作用。
另外，也有人认为一种多见于荷兰人家族多发性痣样黑色素瘤与黄素蛋白类氧化还原酶类有关(Gruis.N.A.et al.Bull.Cancer 85627-30，1998)，而黄素蛋白类氧化还原酶蛋白编码基因富集在1号染色体的1q，此区域染色体及基因的突变会导致相关疾病的发生。由于humNCB5Rh定位于1号染色体1q2.3-3.2，同样位于该富集区的附近，因此本发明humNCB5Rh很可能与这类疾病相关。
最近，有人发现，在非O2感受性还原反应中，NADH-Cytb5还原酶参与对毒性物质的还原，通过检测肿瘤细胞中NCB5R酶活性，发现一些肝癌细胞株(Zoeller.R.A.et al. Lipids 19488-91，1984)及脑瘤(Rampling.R.et al.Int.J.Radiat.Onco.Biol.Phys.29427-431，1994)中NCB5R活性很低，提示NCB5R可能在肿瘤的发生中有作用。因此本发明humNCB5Rh也可能在肿瘤的发生中有作用。另外，由于有研究表明丝裂霉素C的生物还原需要NCb5R参与(Mikami.K.etal.Gan To Kagaku Ryoho 241606-10，1997)才能发挥抗肿瘤作用，提示不能用丝裂霉素C等药物来治疗这类NCB5R酶活性很低的肿瘤。也就是说，本发明humNCb5Rh有用于抗肿瘤药物的筛选的前景。
本发明的人humNCb5Rh除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人humNCb5Rh还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人humNCb5Rh的N端与鼠NCb5R的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人humNCb5Rh的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人humNCb5Rh核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人humNCb5Rh的表达水平或者抑制人humNCb5Rh的过度表达。本发明的人humNCb5Rh蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人humNCb5Rh缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人humNCb5Rh在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以实施例1中含有ORF的阳性克隆或以人体心、脑、胎盘、肝、肾、骨髓、骨骼肌、外周血白细胞和睾丸等组织的cDNA分子库(购自Clontech公司)为模板，用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人humNCb5Rh cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TCAGGTCGAC ATGGGGATCC AGACGAGCC-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人humNCb5Rh编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-TTGGAAGCTT TCAGTAGGTG AATCGCATC-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人humNCb5Rh的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，PstI酶切验证人humNCb5Rh的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人humNCb5Rh。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人humNCb5Rh。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约39KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4人humNCb5Rh在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中含有ORF的阳性克隆或以人体心、脑、胎盘、肝、肾、骨髓、骨骼肌、外周血白细胞和睾丸等组织的cDNA分子库(购自Clontech公司)为模板，用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人humNCb5Rh cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TCAGAAGCTT ATGGGGATCC AGACGAGCC-3′(SEQ ID NO.7)该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人humNCb5Rh编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-TTGGGAATTC TCAGTAGGTG AATCGCATC-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人humNCb5Rh的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII和BamHI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，PstI测序验证人humNCb5Rh的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTrisáHCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM TrisáHCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为39kDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人humNCb5Rh基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白特异性地发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称人还原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸—细胞色素b5还原酶及其编码序列(iii)序列数目10(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GTTCGCTGCA GTTGTTCCCC ATC 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度27碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TGCCATCTCC ATAAGACCAC CTCTG25(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度1633bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.3GTCGGCTTGT CAGGTGGTGG AGGAAAAGGC GCTCCGTCAT GGGGATCCAG ACGAGCCCCG 60TCCTGCTGGC CTCCCTGGGG GTGGGGCTGG TCACTCTGCT CGGCCTGGCT GTGGGCTCCT 120ACTTGGTTCG GAGGTCCCGC CGGCCTCAGG TCACTCTCCT GGACCCCAAT GAAAAGTACC 180TGCTACGACT GCTAGACAAG ACGACTGTGA GCCACAACAC CAAGAGGTTC CGCTTTGCCC 240TGCCCACCGC CCACCACACT CTGGGGCTGC CTGTGGGCAA ACATATCTAC CTCTCCACCC 300GAATTGATGG CAGCCTGGTC ATCAGGCCAT ACACTCCTGT CACCAGTGAT GAGGATCAAG 360GCTATGTGGA TCTTGTCATC AAGGTCTACC TGAAGGGTGT GCACCCCAAA TTTCCTGAGG 420GAGGGAAGAT GTCTCAGTAC CTGGATAGCC TGAAGGTTGG GGATGTGGTG GAGTTTCGGG 480GGCCAAGCGG GTTGCTCACT TACACTGGAA AAGGGCATTT TAACATTCAG CCCAACAAGA 540AATCTCCACC AGAACCCCGA GTGGCGAAGA AACTGGGAAT GATTGCCGGC GGGACAGGAA 600TCACCCCAAT GCTACAGCTG ATCCGGGCCA TCCTGAAAGT CCCTGAAGAT CCAACCCAGT 660GCTTTCTGCT TTTTGCCAAC CAGACAGAAA AGGATATCAT CTTGCGGGAG GACTTAGAGG 720AACTGCAGGC CCGCTATCCC AATCGCTTTA AGCTCTGGTT CACTCTGGAT CATCCCCCAA 780AAGATTGGGC CTACAGCAAG GGCTTTGTGA CTGCCGACAT GATCCGGGAA CACCTGCCCG 840CTCCAGGGGA TGATGTGCTG GTACTGCTTT GTGGGCCACC CCCAATGGTG CAGCTGGCCT 900GCCATCCCAA CTTGGACAAA CTGGGCTACT CACAAAAGAT GCGATTCACC TACTGAGCAT 960CCTCCAGCTT CCCTGGTGCT GTTCGCTGCA GTTGTTCCCC ATCAGTACTC AAGCACTATA 1020AGCCTTAGAT TCCTTTCCTC AGAGTTTCAG GTTTTTTCAG TTACATCTAG AGCTGAAATC 1080TGGATAGTAC CTGCAGGAAC AATATTCCTG TAGCCATGGA AGAGGGCCAA GGCTCAGTCA 140CTCCTTGGAT GGCCTCCTAA ATCTCCCCGT GGCAACAGGT CCAGGAGAGG CCCATGGAGC 1200AGTCTCTTCC ATGGAGTAAG AAGGAAGGGA GCATGTACGC TTGGTCCAAG ATTGGCTAGT 1260TCCTTGATAG CATCTTACTC TCACCTTCTT TGTGTCTGTG ATGAAAGGAA CAGTCTGTGC 1320AATGGGTTTT ACTTAAACTT CACTGTTCAA CCTATGAGCA AATCTGTATG TGTGAGTATA 1380AGTTGAGCAT AGCATACTTC CAGAGGTGGT CTTATGGAGA TGGCAAGAAA GGAGGAAATG 1440ATTTCTTCAG ATCTCAAAGG AGTCTGAAAT ATCATATTTC TGTGTGTGTC TCTCTCAGCC 1500CCTGCCCAGG CTAGAGGGAA ACAGCTACTG ATAATCGAAA ACTGCTGTTT GTGGCAGGAA 1560CCCCTGGCTG TGCAAATAAA NTGGCTGAGG CCCCTGTGTG ATATTGAAAA AAAAAAAAAA 1620AGTCGAGCAA AAA 1633(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度305个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Gly Ile Gln Thr Ser Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu Gly Val 15Gly Leu Val Thr Leu Leu Gly Leu Ala Val Gly Ser Tyr Leu Val 30Arg Arg Ser Arg Arg Pro Gln Val Thr Leu Leu Asp Pro Asn Glu 45Lys Tyr Leu Leu Arg Leu Leu Asp Lys Thr Thr Val Ser His Asn 60Thr Lys Arg Phe Arg Phe Ala Leu Pro Thr Ala His His Thr Leu 75Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Tyr Leu Ser Thr Arg Ile Asp 90Gly Ser Leu Val Ile Arg Pro Tyr Thr Pro Val Thr Ser Asp Glu 105Asp Gln Gly Tyr Val Asp Leu Val Ile Lys Val Tyr Leu Lys Gly 120Val His Pro Lys Phe Pro Glu Gly Gly Lys Met Ser Gln Tyr Leu 135Asp Ser Leu Lys Val Gly Asp Val Val Glu Phe Arg Gly Pro Ser 150Gly Leu Leu Thr Tyr Thr Gly Lys Gly His Phe Ash Ile Gln Pro 165Asn Lys Lys Ser Pro Pro Glu Pro Arg Val Ala Lys Lys Leu Gly 180Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Thr Pro Met Leu Gln Leu Ile 195Arg Ala Ile Leu Lys Val Pro Glu Asp Pro Thr Gln Cys Phe Leu 210Leu Phe Ala Asn Gln Thr Glu Lys Asp Ile Ile Leu Arg Glu Asp 225Leu Glu Glu Leu Gln Ala Arg Tyr Pro Asn Arg Phe Lys Leu Trp 240Phe Thr Leu Asp His Pro Pro Lys Asp Trp Ala Tyr Ser Lys Gly 255Phe Val Thr Ala Asp Met Ile Arg Glu His Leu Pro Ala Pro Gly 270Asp Asp Val Leu Val Leu Leu Cys Gly Pro Pro Pro Met Val Gln 285Leu Ala Cys His Pro Asn Leu Asp Lys Leu Gly Tyr Ser Gln Lys 300Met Arg Phe Thr Tyr 305(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGGGGATCC AGACGAGCC29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TCAGTAGGTG AATCGCATC29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGGGGATCC AGACGAGCC29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGAATTC TCAGTAGGTG AATCGCATC29(2)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.9ATGGGGATCC AGACGAGCC 19(2)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.10TCAGTAGGTG AATCGCATC 19
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列。
4.一种分离的人humNCb5Rh蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ IDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.一种产生具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人humNCb5Rh蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人humNCb5Rh蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人humNCb5Rh蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求4所述的人humNCb5Rh蛋白多肽特异性结合的抗体。
10.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了人还原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸－细胞包素b5还原酶(human NADH-cytochrome b5 reductase,简称为humNCb5Rh)的cDNA序列,该序列编码的蛋白是NCb5R家族的成员。本发明还提供了由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C12N15/12GK1276380SQ9910830
公开日2000年12月13日 申请日期1999年6月2日 优先权日1999年6月2日
发明者余龙, 屠强, 张宏来, 赵勇, 赵寿元 申请人:复旦大学