专利名称：一种提纯葡萄糖氧化酶的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制品提纯技术领域，特别涉及一种提纯葡萄糖氧化酶的方法和装置。
葡萄糖氧化酶的提纯通常是用快速蛋白质液相色谱(简称FPLC)结合用Mono Q离子交换柱进行。提纯过程中同时采用了梯度pH和盐浓度的方法，其起始缓冲溶液是20×10-3mol/L(20mM)pH＝8.5磷酸盐的缓冲溶液；洗脱缓冲溶液是含0.1mol/L(0.1M)NaCl的50×10-3mol/L(50mM)pH＝3.6的醋酸盐缓冲溶液，这在《色谱杂志》1990年521卷245-250页[Journal of Chromatography，521(1990)245-250]的文章和《生物分子学杂志》1990年213卷207-209页[Journal of Molecular Biology，1990，213，207-209]的文章中都有报导。经过采用上述方法提纯的葡萄糖氧化酶在水溶液中的活力比提纯前要高，这方面的内容在《中国化学快报》1999年第9卷第11期1049页[Chinese ChemicalLetter，1999，9(11)，1049]的文章中有报导。上述方法在分离时所采用的离子交换树脂Mono Q是关键，Mono Q的功能团是-CH2N+(CH3)3，但是其具体的结构和合成方法生产厂商并未在快速蛋白质液相色谱(FPLC)产品介绍中提供[Introduction of FPLC，Pharmacia Corp.]。另外，由于离子交换树脂Mono Q在商业上主要是为在实验室中进行提纯生物样品而生产的，这就决定了它在提纯葡萄糖氧化酶时每次提纯的量很少。而对于需要制备少量提纯的葡萄糖氧化酶的单位或个人而言，很不经济。此外，由于快速蛋白质液相色谱(FPLC)和离子交换树脂Mono Q均需从国外购买，价格十分昂贵，购买仪器所需时间较长，费用也较多。
本发明的目的在于克服上述已有技术的缺陷，为了寻找一种代替快速蛋白质液相色谱(FPLC)结合Mono Q离子交换柱提纯葡萄糖氧化酶的工业方法，可快速方便地适于少量(一次)提纯葡萄糖氧化酶，和为了节约成本，从而提供一种经济的、适于实验室或个人对葡萄糖氧化酶进行小量提纯的方法和装置。
本发明的目的是这样实现的本发明提供的提纯葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于依下列步骤进行
第一步准备工作(1)配浓度20×10-3mol/L(20mM) pH＝8.5的磷酸盐起始缓冲溶液，配含0.2M NaCl的50×10-3mol/L(50mM)pH＝3.6的醋酸盐缓冲溶液作为洗脱液；(2)处理阴离子交换树脂将阴离子交换树脂依次用含0.5M NaCl的0.5MNaOH溶液浸泡不少于1小时，用二次水洗至中性；再用0.5M HCl浸泡不少于1小时，用二次水洗至中性。最后将其浸泡在起始缓冲溶液中，并搅拌；其中，浸泡水洗时均结合浮选去掉太细的颗粒。
第二步配浓度为0.10-2.0mg/ml葡萄糖氧化酶的样品溶液(二次水溶液)，4℃下保存备用。
第三步用自然沉降法将填料即阴离子交换树脂装入离子交换柱中，使填料上表面距离子交换柱上端橡皮塞的下表面1cm左右；用步骤1中配制的磷酸盐起始缓冲溶液反复淋洗离子交换柱，直到流出的溶液pH＝8.5为止；为了防止向离子交换柱内加溶液时对填料表面的扰动，还包括在树脂上表面加盖一片滤纸。
第四步取下离子交换柱上端橡皮塞，将配好的浓度为10.10-2.0ml的葡萄糖氧化酶样品溶液小心地加在填料上端，然后打开离子交换柱下端出口处的止水夹，让样品溶液流至与离子交换柱表面持平，然后分2-3次用磷酸盐少量的起始缓冲溶液将离子交换柱上残留的样品溶液洗下来，关闭止水夹，塞紧离子交换柱上端橡皮塞。
第五步分液漏斗中加入步骤1中配制的浓度为50mM pH＝3.6的醋酸盐洗脱液20-50ml，打开离子交换柱下端出口处的止水夹以及分液漏斗的活塞，洗脱缓冲溶液从分液漏斗中流出，开始洗脱。
第六步开始洗脱的同时开启记录仪，记录洗脱曲线。控制紫外检测仪出口的流出速度为3-25秒/滴，每滴的体积约为0.044ml。实验时可得到两个分离峰，根据分离峰流出的先后顺序分别命名为峰1和峰2。其中，所得峰1是所需要的提纯的葡萄糖氧化酶。可根据所需要提纯后的葡萄糖氧化酶的量进行多次分离，分别收集峰1和峰2两个组分，4℃下保存。
整个实验均在室温下进行。
其中，所述的磷酸盐为KH2PO4和Na2HPO4·12H2O，他们之间的比例按通常的磷酸盐起始缓冲溶液的配比；醋酸盐为NaAc·3H2O和冰醋酸，他们之间的比例按通常的醋酸盐洗脱液的配比；葡萄糖氧化酶从Sigma公司购买；所用各种试剂纯度至少在分析纯以上。所述的阴离子交换树脂的结构如下
其外观是淡黄色的球状颗粒，型式是氯型，粒度是0.1-2.0mm，功能团是-CH2N+(CH3)3，n的值为1，m的值为18，合成的具体方法可参见《化工产品手册》—合成树脂与塑料，化学工业出版社，1983，380-383页。合成过程中苯乙烯(98％)∶二乙烯苯(40％)∶氯化锌∶氯甲甲醚(40％)∶三甲胺的值约为5.9∶1∶2.2∶11∶7.6；合成的具体路线如下1.共聚反应
2.氯甲基反应
3.胺化反应
本发明的提纯葡萄糖氧化酶的装置，包括一个分液漏斗，为通用分液漏斗，内装洗脱缓冲溶液；一个离子交换柱，为通用离子交换柱，圆形，其内径与长度比为1/20～1/30，内径为1.0～3.0厘米，内装有填料，离子交换柱两端均用橡胶塞塞住，每个橡皮塞中插入一段不锈钢管，离子交换柱底端的橡皮塞可包有布，以塞中插入一段不锈钢管，离子交换柱底端的橡皮塞可包有布，以防柱内填料堵塞不锈钢管。
分液漏斗与离子交换柱分别用铁圈和试管夹固定在铁架台上，且分液漏斗位于离子交换柱上方，其间通过一段粗乳胶管及一段细的硅胶管与离子交换柱上端橡皮塞上的不锈钢管相连；一台与离子交换柱下端出口用一硅胶管相连的紫外检测仪，其中硅胶管用一止水夹夹住；一台与紫外检测仪串联的分光光度计，为通用分光光度计，其检测器用紫外灯光源，检测波长为280nm，其狭缝调节为0.28；一台稳压器，与分光光度计串连；一台记录仪，为台式自动平衡记录仪，带有记录纸，记录仪走纸速度为4mm/min，量程为5mV；分光光度计、稳压器和记录仪之间通过电线相连；可在离子交换柱填料上表面加盖一小片滤纸，防止向离子交换柱加洗脱缓冲溶液时对填料表面的扰动；其中所述粗乳胶管的内径为2mm；所述细的硅胶管的内径为1mm；所述紫外灯光源为氢灯。
本发明的优点和效果用本发明的方法提纯葡萄糖氧化酶，所得提纯葡萄糖氧化酶的活力得到了提高，并且与已有技术相比如表1所示表1 提纯前后的葡萄糖氧化酶的活力的对比组分 未提纯葡萄糖氧化酶 峰1峰2峰A峰B活力(单位)25.266.3 32.9 55.4 30.2其中，峰1，2指用自装柱方法提纯后所得的两个组分，按其流出的先后顺序，称为1，2。峰A，B指用FPLC结合Mono Q柱提纯后所得的两个组分，按其流出的先后顺序，称为A，B。单位是指在25℃，pH＝6.0测定条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖每分钟生成1μmol的酶量为一个单位。
由于葡萄糖氧化酶是由两种同工酶组成的，这两种同工酶能催化同一反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同，因此其生理性质、理化性质是不同的，活性也不相同。对葡萄糖氧化酶的提纯的实质就是将这两种同工酶进行了分离。在本发明的方法中配制的磷酸盐起始缓冲溶液中，这两种同工酶都带有负电荷(葡萄糖氧化酶的等电点是4.2)不同的是它们带电数量不同、强弱不同。当开始对离子交换柱进行分离提纯时，带有负电荷的葡萄糖氧化酶与填料功能团上的Cl-发生交换，这两种同工酶都被吸附到填料表面。在用醋酸盐洗脱液进行洗脱后，由于醋酸盐洗脱液是pH＝3.6，使得在离子交换柱中的溶液pH值不断下降，当pH值不断下降到4.2以下时，葡萄糖氧化酶会从带有负电荷改为带有正电荷。这样，这两种同工酶中带电荷数量较少的、带电荷数较弱的一种同工酶会首先带有正电荷，不再被填料表面吸附，从而首先被洗脱液洗下来。所以用本发明的方法对葡萄糖氧化酶进行提纯的条件合理，提纯后的葡萄糖氧化酶活性提高了。
从上表中可看出，用本发明和用快速蛋白质液相色谱(FPLC)结合Mono Q柱方法提纯葡萄糖氧化酶均得到两个组分，经过提纯后的组分的活性均较提纯前活性增大。从具体数据上可看出，用本发明提纯后峰1较峰A活性增大，峰2较峰B活性增大。因此，表1的数据表明了用本发明对葡萄糖氧化酶进行提纯效果好。由于本发明所用填料是自己合成的，合成的过程也很简单，而且本发明的装置简单，因此总体而言提纯葡萄糖氧化酶所需的费用是很低的，而且也十分方便，非常适用于小量提纯葡萄糖氧化酶的用户。
下面结合附图和实施例进一步说明本发明
图1是本发明提纯葡萄糖氧化酶的装置示意面说明如下1-分液漏斗，2-活塞，3-缓冲溶液， 4-铁圈，5-乳胶管， 6-硅胶管， 7-橡胶塞，8-离子交换柱，9-填料，10-橡胶塞， 11-电线， 12-铁架台，13-试管夹， 14-紫外监测仪， 15-试管，16-分光光度计， 17-稳压器， 18-细硅胶管， 19-记录仪，20-记录纸， 21-止水夹实施例1本发明的提纯葡萄糖氧化酶的装置按图1制作，包括一个分液漏斗(1)，为通用分液漏斗，内装洗脱缓冲溶液；一个离子交换柱(8)，其内径与长度比为1/20～1/30，内径为1.0～3.0厘米，内装有填料(9)，离子交换柱两端均用橡胶塞(7，10)塞住，每个橡皮塞中插入一段Φ＝1mm的不锈钢管，离子交换柱底端的橡皮塞(10)包有布，以防柱内填料(9)堵塞不锈钢管。
分液漏斗(1)与离子交换柱(8)分别通过铁圈(4)和试管夹(13)固定在铁架台(25)上，且分液漏斗(1)位于离子交换柱(8)上方，其间通过一段Φ＝2mm乳胶管(5)及一段Φ＝1mm的硅胶管(6)与离子交换柱上端橡皮塞(7)上的不锈钢管相连；一台与离子交换柱(8)通过一Φ＝1mm的硅胶管(18)相连的G751型紫外检测仪(14)，其中硅胶管(18)用一止水夹(21)夹住；一台与紫外检测仪(14)串联的G751型分光光度计(16)，为通用分光光度计，其检测器用紫外灯光源(氢灯)，检测波长为280nm，其狭缝调节为0.28；一台稳压器(17)，与分光光度计(16)串连；一台记录仪(19)，为台式自动平衡记录仪，带有记录纸(20)，记录仪走纸速度为4mm/min，量程为5mV；分光光度计(16)、稳压器(17)和记录仪(19)之间通过电线相连；可在离子交换柱填料(9)表上面加盖一小片滤纸，防止向离子交换柱加洗脱缓冲溶液时对填料(9)上表面的扰动；其中所述粗乳胶管的内径为2mm；细的硅胶管的内径为1mm。
实施例2使用上述的专用装置，整个实验均在室温下进行。
其中，磷酸盐为KH2PO4和Na2HPO4·12H2O；醋酸盐为NaAc·3H2O和冰醋酸；葡萄糖氧化酶从Sigma公司购买；所用各种试剂纯度至少在分析纯以上。所用的阴离子交换树脂的结构如下
其外观是淡黄色的球状颗粒，型式是氯型，粒度是0.3-1.2mm，功能团是CH2N+(CH3)3，n的值为1，m的值为18，合成的具体方法可参见《化工产品手册》一合成树脂与塑料，化学工业出版社，1983，380-383页。合成过程中苯乙烯(98％)∶二乙烯苯(40％)∶氯化锌∶氯甲甲醚(40％)∶三甲胺的值约为5.9∶1∶2.2∶11∶7.6；其工艺步骤依以下顺序进行第一步准备工作(1)配20mM pH＝8.5的KH2PO4和Na2HPO4·12H2O的磷酸盐起始缓冲溶液，配含0.2M NaCl的50mM NaAc·3H2O和冰醋酸的醋酸盐(pH＝3.6)缓冲溶液作为洗脱液；
(2)处理阴离子交换树脂将阴离子交换树脂依次用含0.5M NaCl的0.5M NaOH溶液浸泡不少于1小时，用二次水洗至中性；再用0.5MHCl浸泡不少于1小时，用二次水洗至中性。最后将其浸泡在起始缓冲溶液中，并搅拌；其中，浸泡水洗时均结合浮选去掉太细的颗第二步配浓度为1.17mg/ml葡萄糖氧化酶的二次水溶液，4℃下保存备用；第三步用自然沉降法将填料(9)即阴离子交换树脂装入离子交换柱(8)中，使填料(9)上表面距离子交换柱上端橡皮塞(7)的下端1cm左右；用起始缓冲溶液反复淋洗离子交换柱(8)，直到流出的溶液pH＝8.5为止；为了防止向离子交换柱内加溶液时对离子交换柱表面的扰动，在离子交换柱表面上加盖了一小片圆型滤纸；第四步取下离子交换柱(8)上端橡皮塞(7)，将浓度为1.17mg/ml的葡萄糖氧化酶样品溶液0.8ml小心地加在填料(9)上端，然后打开离子交换柱(8)下端出口处的止水夹(21)，让样品溶液流至与离子交换柱(8)表面持平，然后分2-3次用少量的起始缓冲溶液将离子交换柱(8)上残留的样品溶液洗下来，关闭止水夹(21)，塞紧离子交换柱上端橡皮塞(7)；第五步分液漏斗(1)中加入pH＝3.6的洗脱缓冲溶液(3)40ml，打开离子交换柱(8)下端出口处的止水夹(21)以及分液漏斗(1)的活塞(2)，洗脱缓冲溶液(3)从分液漏斗(1)中流出，开始洗脱；第六步开始淋洗的同时开启记录仪(19)，记录洗脱曲线。控制紫外检测仪(14)出口的流出速度为6秒/滴，每滴的体积约为0.044ml。实验时可得到两个分离峰，根据分离峰流出的先后顺序分别命名为峰1和峰2。其中，所得峰1是所需要的提纯的葡萄糖氧化酶。可根据所需要提纯后的葡萄糖氧化酶的量进行多次分离，用试管(15)分别收集峰1和峰2两个组分，4℃下保存。实施例3制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为0.1mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为3秒/滴有改变，其余过程与实施例2相同。实施例4制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为0.1mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为25秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例5制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为0.1mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为12秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例6制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为2.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为3秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例7制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为2.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为25秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例8制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为2.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为12秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例9制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液2.0ml，浓度为2.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为3秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例10制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为1.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为3秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例11
制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为1.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为25秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例12制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液0.1ml，浓度为1.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为12秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例13制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液2.0ml，浓度为2.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为3秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例14制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液2.0ml，浓度为1.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为25秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例15制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液2.0ml，浓度为0.1mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为12秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例16制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液1.0ml，浓度为0.1mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为25秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例17制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液1.0ml，浓度为2.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为25秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。实施例18制备工艺同实施例2相比只是葡萄糖氧化酶样品溶液1.0ml，浓度为1.0mg/ml，紫外检测仪出口的流出速度为12秒/滴有改变，其余方法和过程与实施例2相同。
权利要求
1.一种提纯葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于；在室温下依下列步骤进行第一步准备工作(1)配20mM pH＝8.5的磷酸盐起始缓冲溶液，配含0.2M NaCl的50mMpH＝3.6的醋酸盐缓冲溶液作为洗脱液；(2)处理阴离子交换树脂将阴离子交换树脂依次用含0.5M NaCl的0.5M NaOH溶液浸泡1小时，用二次水洗至中性；再用0.5M HCl浸泡1小时，用二次水洗至中性。最后将其浸泡在起始缓冲溶液中，并搅拌；第二步配浓度为0.10-2.0mg/ml葡萄糖氧化酶的二次水溶液，4℃下保存备用；第三步用自然沉降法将填料阴离子交换树脂装入离子交换柱中，填料上表面距离子交换柱上端橡皮塞的下表面1cm左右；用起始缓冲溶液反复淋洗离子交换柱树脂，直到流出的溶液pH＝8.5为止；第四步取下离子交换柱上端橡皮塞，将0.1-2.0ml的葡萄糖氧化酶样品溶液加在填料上端，然后打开离子交换柱下端出口处的止水夹，让样品溶液流至与离子交换柱表面持平，然后分2-3次用少量的起始缓冲溶液将离子交换柱上残留的样品溶液洗下来，关闭止水夹，塞紧离子交换柱上端橡皮塞；第五步分液漏斗中加入pH＝3.6的洗脱溶液20-50ml，打开离子交换柱下端出口处的止水夹以及分液漏斗的活塞，洗脱溶液从分液漏斗中流出，开始洗脱；第六步开始洗脱的同时开启记录仪，记录洗脱曲线；控制紫外检测仪出口的流出速度为3-25秒/滴，每滴的体积约为0.044ml；记录洗脱曲线得到两个分离峰，可根据所需要提纯后的葡萄糖氧化酶的量进行多次分离，分别收集峰1和峰2两个组分，4℃下保存；
2.如权利要求1所述的一种提纯葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的阴离子交换树脂结构为
其中，n的值为1，m的值为18；其外观是淡黄色的球状颗粒，型式是氯型，粒度是0.3-1.2mm，功能团是-CH2N+(CH3)3。
3.一种权利要求1提纯葡萄糖氧化酶的专用装置，其特征在于包括一个内装洗脱缓冲溶液的分液漏斗(1)；一个离子交换柱(8)，其内径与长度比为1/20～1/30，内径为1.0～3.0厘米，离子交换柱两端均用橡胶塞(7，10)塞住，每个橡皮塞中插入一段细的不锈钢管；一个分液漏斗(1)与离子交换柱(8)分别通过铁圈(4)和试管夹(13)固定在铁架台(25)上，且分液漏斗(1)位于离子交换柱(8)上方，其间通过一段粗乳胶管(5)及一段细的硅胶管(6)与离子交换柱上端橡皮塞(7)上的不锈钢管相连；一台与离子交换柱(8)通过一细的硅胶管(18)相连的紫外检测仪(14)，其中硅胶管(18)用一止水夹(21)夹住；一台与紫外检测仪(14)串联的分光光度计(16)，其检测器用紫外灯光源，检测波长为280nm，其狭缝调节为0.28；一台稳压器(17)，与分光光度计(16)串连；一台带有记录纸(20)的记录仪(19)，记录仪走纸速度为4mm/min，量程为5mV；分光光度计(16)、稳压器(17)和记录仪(19)之间通过电线相连。
4.如权利要求1所述的一种提纯葡萄糖氧化酶的装置，其特征在于还包括在离子交换柱填料上表面加盖一片滤纸。
5.如权利要求1所述的一种提纯葡萄糖氧化酶的装置，其特征在于所述粗乳胶管的内径为2mm；细的硅胶管的内径为1mm。
6.如权利要求1所述的一种提纯葡萄糖氧化酶的装置，其特征在于所述的离子交换柱底端的橡皮塞(10)包有布。
全文摘要
本发明涉及提纯葡萄糖氧化酶的方法和装置。该方法在提纯葡萄糖氧化酶的专用装置内进行,配磷酸盐起始缓冲溶液和醋酸盐洗脱液;处理好阴离子交换树脂装入离子交换柱中,用起始缓冲溶液淋洗离子交换柱;配浓度为0.10—2.0mg/ml葡萄糖氧化酶样品溶液;取下离子交换柱上端橡皮塞,将样品溶液加在填料上,然后用少量的起始缓冲溶液将离子交换柱上残留的样品溶液洗下来,分液漏斗中加入洗脱液开始洗脱,记录洗脱曲线,分别收集峰1和峰2组分。
文档编号C12N9/04GK1276425SQ9910806
公开日2000年12月13日 申请日期1999年6月8日 优先权日1999年6月8日
发明者江龙, 戴国亮, 郎爱东, 李津如 申请人:中国科学院感光化学研究所